Аристолохична киселина изазива бубрежну фиброзу и старење код мишева
Mar 23, 2022
Апстрактан:Бубрези су један од органа који су најподложнији оштећењима везаним за узраст. Генерално, бубрежно старење је праћено реналном фиброзом, што је последњи уобичајени пут хроничнеболести бубрега. Аристолохична киселина (АА), нефротоксично средство, изазива АА нефропатију (ААН), коју карактерише прогресивна бубрежна фифиброза и функционални пад. Иако је фифиброза бубрега повезана са старењем бубрега, остаје нејасно да ли АА изазива старење бубрега. Циљ ове студије је да се истражи потенцијална употреба ААН-а као модела старења бубрега. Овде смо испитали факторе везане за старење у ААН моделима хроничном применом АА мишевима Ц57БЛ/6. У поређењу са контролама, АА група је показала старењебубрегафенотипови, као што су атрофија бубрега, смањење функције бубрега и тубулоинтерстицијска фифиброза. Поред тога, АА је промовисао ћелијско старење посебно убубрезии повећана експресија мРНК п16 бубрега и активност галактозидазе повезане са старењем. Штавише, мишеви третирани АА показали су абнормалности проксималних тубуларних митохондрија, као и акумулацију реактивних врста кисеоника. Клотхо, ген против старења, такође је значајно смањен убубрезимишева третираних АА. Заједно, резултати ове студије показују да АА мења факторе везане за старење и да је фиброза бубрега уско повезана са старењем бубрега.
Кључне речи:хронична болест бубрега; фиброза бубрега; аристолохична киселина; старење; ћелијско старење
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛЕСТИ БУБРЕГА/БУБРЕГА
УводСа континуираним повећањем животног века код људи, све више појединаца пати од оштећења везаних за узраст.Бубрезису типично захваћени оштећењем ткива везаним за узраст и учесталошћу хроничногобољење бубрегаповећава се са годинама [1]. Старење бубрега убрзава свеукупно старење, што резултира краћим животним веком. Због тога је неопходно истраживање старења бубрега, иако одговарајући животињски модели нису у потпуности развијени. Старење бубрега праћено је различитим патолошким променама, укључујући атрофију бубрега, гломерулосклерозу и тубулоинтерстицијалну фифиброзу [2]. Бубрежна тубулоинтерстицијска фифиброза је последњи уобичајени пут у већини облика прогресивне бубрежне болести, што сугерише да је ренална фифиброза уско повезана са старијимбубрега. У истраживању старења, мишеви су поуздан алат због своје генетске близине људима, способности да генетски манипулишу својим геномом и чињенице да представљају сличне фенотипове повезане са старењем људима током њиховог животног века [3]. Лонгитудинална посматрања помоћу инбред мишева су идеална као модел старења, иако је дуготрајно праћење мишева током њиховог пуног животног века. Поред тога, постоји неколико генетски модификованих мишјих модела старења. Миш са Клотхо дефицитом је модел прераног старења који се користи у истраживању старења. Међутим, у овом моделу, бубрежна функција је непромењена, а оштећено је и неколико других органа осим бубрега [4]. Стога, овај модел миша може бити неприкладан за истраживање старења бубрега.Примена аристолохичне киселине (АА) изазива специфичан тип оштећења бубрега познат као АА нефропатија (ААН), коју карактерише екстензивна интерстицијска фиброза [5,6]. АА је токсичан за бубрежни тубуларни епител јер промовише формирање ДНК адуката у бубрежним ткивима [7]. Мало је вероватно да ће АА утицати на друге органе осим уринарног система и може бити корисна за проценубубрега-специфичне измене. Због тога се АА обично користи за успостављање модела фифиброзе бубрега код мишева [8,9]. Међутим, остаје нејасно да ли су промене изазване АА повезане са старењем убубрези. У овој студији, испитали смо фенотипове везане за узраст и молекуларне факторе у ААН код мишева
Резултати 2.1. АА администрација изазвала је значајан губитак тежине, атрофију бубрега и пад бубрежне функцијеОсновна телесна тежина (БВ) и систолни крвни притисак (БП) били су идентични између контролне групе и групе АА. БВ у контролној групи возила се константно повећавао током 8 недеља. Међутим, добијање на тежини је инхибирано давањем АА, а група АА је имала значајно нижи БВ 4 и 8 недеља након почетка примене АА (Слика 1А). Није било значајне разлике у систолном БП или срчаном ритму између контролне групе и групе АА (Слика 1Б, Ц). Однос срчане тежине/ТВ није показао разлику између група 8 недеља након почетка примене АА (Слика 1Д), докбубрегаОднос тежина/БВ био је значајно нижи у групи са АА 8 недеља након почетка примене АА (слика 1Е). Затим смо испитали функцију бубрега у групама са контролом возила и АА. Концентрације креатинина и азота уреје (УН) у плазми биле су значајно веће у групи са АА него у контролној групи са вехикулумом 8 недеља након почетка примене АА. Поред тога, третман АА је значајно смањио клиренс креатинина у поређењу са контролном групом вехикулума 8 недеља након почетка примене АА (Слика 1Ф-Х).
2.2. АА администрација изазвала је отворену тубулоинтерстицијску фиброзу и значајну регулацију експресије гена повезане са фиброзом у бубрезимаХистолошки преглед коришћењем бојења периодичном киселином по Шифу (ПАС) открио је да је гломеруларно подручје значајно смањено у групи са АА у поређењу са контролном групом са вехикулумом (Слика 2А). Екстензивна тубулоинтерстицијална фифиброза, процењена коришћењем Массоновог трихрома (МТ) бојења, примећена је у АА групи (слика 2Б), као и са повећањем нивоа мРНА гена повезаних са фифиброзом бубрега, колагена И и ИИИ и трансформишућег фактора раста ( ТГФ)- (Слика 2Ц–Е).
2.3. АА администрација убрзала ћелијско старење, митохондријалну дисфункцију и акумулацију реакционих врста кисеоника/гена (РОС) у бубрезимаДа бисмо проценили ћелијску сенесценцију, испитали смо експресију мРНА у бубрезима п53, п21, п16 и глутаминазе (ГЛС), АА група је показала значајно више нивое мРНА ових гена повезаних са старењем убубрези(Слика 3А-Д). Штавише, интензитет бојења повезан са старењем -галактозидазом (СА- -гал) убубрезије повећана у АА групи и скоро одсутна у контролној групи са носачем (Слика 3Е). У групи АА, електронска микроскопија је открила нестанак митохондријалних криста, фрагментацију митохондрија, вакуолизацију цитоплазме и аутолизозома у проксималним тубуларним ћелијама, истовремено са смањење регулације БЦЛ2/аденовируса Е1Б 19-кДа интерактивног протеина 3 (Бнип3), гена који је повезан са митохондријама (Слика 3ФГ). Експресија реналне мРНК Нок2. компонента никотинамид аденин динуклеотид фосфат (НАДПХ) оксидазе, значајно је повећана у АА групи у поређењу са контролном групом са вехикулумом (Слика 3Х). Штавише, вестерн блот анализа је открила да је бубрежни 4-хидрокси-2-номинални (4-ХНЕ) ниво значајно повећан у АА групи (Слика 3И). Ови резултати су показали да је примена АА изазвала ћелијско старење, митохондријалну дисфункцију и акумулацију РОС убубрези.
2.4. АА смањена експресија бубрежног Клотхо протеинаИспитивали смо бубрежну експресију протеина против старења у контролној групи и АА групама. Клотхо експресија је значајно смањена у АА групи у поређењу са контролном групом са вехикулумом (Слика 4А), док су бубрежне експресије никотинамид фосфорибозилтрансферазе (НАМПТ) и сиртуина1 (СИРТ1) биле сличне између група (Слика 4Б, Ц).
3. ДискусијаКолико знамо, ова студија је прва која се фокусира на процену промена у ААН које су повезане са старењем бубрега користећи маркере старења, као што су активност п16 и СА- -гал. Лечење АА је подстакло атрофију бубрега, тубулоинтерстицијалну фиброзу и опадање бубрежне функције, који су били праћени појачаном регулацијом реналне п16 мРНА и СА- -гал-позитивним бојењем. Штавише, АА група је показала карактеристике механизама бубрежног старења као што су абнормалности митохондрија, повећан оксидативни стрес и смањење регулације гена против старења, Клотхо. Узето заједно, наша запажања сугеришу да хронична примена АА делимично опонаша старење бубрега.
Ћелијско старење је трајно заустављање пролиферације ћелија као одговор на различите стресоре, као што је оштећење ДНК, и доприноси старењу и болестима повезаним са старењем. Експресија п16, инхибитора киназе зависне од циклина, је у корелацији са старењем у различитим органима, укључујући бубреге. Ограничење калорија продужава животни век инхибирањем експресије пл6 [10]. Поред тога, елиминација п16-експресирајућих старачких ћелија код ИНК-АТТАЦ мишева путем ињекције АП20187, ФК506-везујућег протеинског димеризера [11], узрокује слабљење фенотипова старења бубрега, као што су гломеруларна склероза и ренална функционални пад. Стога је п16 један од најважнијих фактора везаних за старење. Стареће ћелије се могу открити коришћењем СА- -гал бојења, које показује повећану активност -галактозидазе на пХ 6,0 [12], и широко је коришћен биомаркер старих и остарелих ћелија. Експресија пл16 у бубрежној мРНК повећава се код старијих пацовабубрезии праћен је повећаном активношћу СА- -гала у бубрежном епителу [13И. У овој студији, показали смо повећану експресију мРНК п16 у бубрезима и бојење СА- -галом, што указује да АА изазива старење бубрега. Недавно је објављено да је ГЛС неопходан за опстанак старих ћелија путем појачане глутаминолизе и интрацелуларне неутрализације пХ [14]. Показало се да инхибиција глутаминолизе зависне од ГЛС код старијих мишева елиминише старе ћелије и побољшава дисфункцију органа у вези са старењем. У овој студији, повећана регулација реналне ГЛС мРНК указала је на бубрежну акумулацију сенесцентних ћелија у групи. Дакле, хронична примена АА изазвала је ћелијско старење у бубрезима.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ФУНКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Поред ћелијског старења, митохондријална дисфункција је суштински механизам који лежи у основи оштећења ткива у вези са старењем и праћена је акумулацијом РОС-а [15,16. Митохондријална дисфункција покреће и одржава ћелијско старење [17] док ћелијско старење директно доприноси митохондријалној дисфункцији [18]. Бнип3, лоциран првенствено у спољашњој митохондријалној мембрани, може играти улогу у регулацији митофагије у култивисаним бубрежним проксималним тубуларним ћелијама као одговор на оксидативни стрес и хипоксију. Код старијих мишева, калорична рестрикција повећава аутофагију у тубуларним ћелијама, преко регулације Бнип3, и побољшава дегенерацију бубрежне функције изазвану старењем [19]. У овој студији, електронска микроскопија је открила карактеристике митохондријалних абнормалности на које може утицати смањена експресија бубрежног Бнип3 или ћелијско старење. Митохондрије су главни интрацелуларни извор РОС. Да бисмо проценили ефекте митохондријалних абнормалности на РОС бубрега, испитали смо бубрежну акумулацију 4-ХИНЕ и демонстрирали акумулацију РОС изазвану АА убубрези.НАДПХ оксидазе су главни извор РОС. Током акутне фазе ААН код мишева, експресија Нок2 у бубрежној мРНК је била повишена, а доступност азотног оксида смањена, што је довело до трајне хипоксије и исхемије [20. Код старих пацовабубрези, акумулација РОС је праћена повећаном експресијом Нок2 [21]. Ови налази сугеришу да АА може индуковати фено-типове везане за старење преко акумулације РОС узроковане митохондријалном дисфункцијом и повећањем НАДПХ оксидаза.
Експресија бубрежног Клотхо гена је смањена у АА групи, док је експресија НАМПТ и СИРТл била слична између група. Клотхо је ген против старења који кодира једнопролазни трансмембрански протеин који делује као супресор старења. Процес старења код мишева са недостатком Клотхо-а личио је на онај код људи, укључујући краћи животни век, неплодност, артериосклерозу, атрофију коже, остеопорозу и емфизем [22]. Хипоморфни мутантни Клотхо мишеви су такође показали фенотип убрзаног старења, који је обновљен аблацијом п16 [23]. Пошто је Клотхо важан фактор у старењу, Клотхо генски модификовани мишеви су нашироко коришћени у истраживању старења. Међутим, мишеви модификовани Клотхо геном могу бити неприкладни за истраживање бубрежног старења због системских оштећења ових мишева повезаних са старењем и чињенице да функција бубрега није потврђена (тј. нивои креатинина). Насупрот томе, ААН модел миша се може користити као модел старења бубрега изазван лековима у истраживачке сврхе, јер има неколико предности, као што су релативна лакоћа имплементације и могућност процене ефеката интервенција на смањење функције бубрега. .
Ова студија је имала нека ограничења. Процењивали смо старење бубрега, фокусирајући се углавном на ћелијско старење, митохондријалну морфологију и експресију гена која је повезана са старењем. Међутим, механизми старења су сложени и недовољно схваћени. Поред тога, иако је експресија Клотхо гена смањена као одговор на АА, нисмо могли показати узрочну везу са патолошким променама у ААН. Потребне су даље студије да би се утврдиле улоге различитих молекула укључених у развој ААН. Ипак, ова студија пружа нове увиде у употребу Авана као модела старења бубрега. Важно је напоменути да фенотипске промене убубрегасу снажно повезане са животним веком. иакобубрегана које лако утичу промене повезане са старењем, инхибиција бубрежног старења може продужити укупан животни век. Стога, даља истраживања о старењу бубрега користећи моделе ААН-а могу довести до повећања дуговечности у будућности.
4. Материјали и методе4.1. ЖивотињеОва студија је спроведена у складу са смерницама Националног института за здравље за употребу експерименталних животиња. Све експерименте на животињама одобрио је Комитет за студије на животињама Универзитета Јокохама Цити (број одобрења: ФА20-027) и спроведени су у складу са смерницама АРРИВЕ. Уложени су напори да се смањи број коришћених животиња и њихова патња. Мишеви су смештени у контролисаном окружењу под циклусом 12-х светлости/12- х таме на температури од 25 степени Ц. Мишеви су имали слободан приступ храни и води.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Осмонедељни мужјаци Ц57БЛ/6 мишеви су купљени од Цхарлес Ривер Лабораториес (Вилмингтон, МА, САД) и додељени групама за контролу возила или АА након 1 недеље аклиматизације, мишевима је интраперитонеално даван вехикулум или АА (Сигма -Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД), који је растворен у малој количини диметил сулфоксида. Пре ове студије, спровели смо прелиминарну студију користећи неколико протокола. Први протокол је укључивао давање АА (3 мг/кг) мишевима Ц57БЛ/6 интраперитонеално два пута недељно током 4 недеље без времена ремоделирања; у овом протоколу, АА је изазвао очигледне акутне лезије бубрега, као што су проширени проксимални тубули са губитком ивице четкице (додатна слика С1). У другом протоколу, мишевима Ц57БЛ/6 је даван АА (2,5 мг/кг) интраперитонеално једном недељно током 4 недеље, након чега је уследило време ремоделирања током 4 недеље; креатинин у плазми код ових мишева је био 0.19 ± {{20}}.080 мг/дЛ наспрам 0.18 ± 0.010 мг/дЛ (контрола возила наспрам АА, респективно; средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ), п=0.86, непарени Студентов т-тест, н=4 по групи) и УН плазме је био 31,3 ± 5,95 мг/дЛ у односу на 30,4 ± 3,87 мг/дЛ (контрола возила наспрам АА, респективно; средња вредност ± СЕМ, п=0,90, неупарени Студентов т-тест, н=4 по групи). Стога смо утврдили да овај протокол није погодан за модел повреде бубрега јер АА није изазвао значајан пад функције бубрега. У трећем протоколу, мишевима Ц57БЛ/6 је даван АА (3 мг/кг) интраперитонеално два пута недељно током 10 недеља без времена ремоделирања; код ових мишева, стопа морталитета у АА групи била је 83 процента (н=6), док ниједан од мишева у контролној групи није угинуо (н=4). У овом протоколу нисмо могли статистички да проценимо фенотип бубрега изазван АА због високог морталитета. У четвртом протоколу, мишевима Ц57БЛ/6 је даван АА (3 мг/кг) интраперитонеално два пута недељно током 4 недеље, након чега је уследило време ремоделирања током 4 недеље; хроничне бубрежне лезије, као што је тубулоинтерстицијска фифиброза, и смањење функције бубрега примећени су код ових мишева [9]. Стога смо, на основу резултата ових прелиминарних истраживања, усвојили четврти протокол за извођење експеримената у овој студији.
4.2.БП МеасурементСистолни крвни притисак и број откуцаја срца мерени су претходно описаном методом репне манжетне (БП-Монитор МК-2000; Муромацхи Кикаи Цо., Токио, Јапан)[24,25]. Сва мерења су обављена између 9:00 и 14:00. Најмање 10 мерења је обављено код сваког миша, а средња вредност је коришћена за анализу.
4.3. ПЦР анализа квантитативне реверзне транскрипције у реалном времену Укупна РНК је екстрахована из бубрежних ткива коришћењем ИСОГЕН-а (Ниппон Гене, Токио, Јапан), а комплементарна ДНК (цДНК) је синтетизована коришћењем СуперСцрипт ИⅢФирст-Странд система (Инвитроген, Валтхам, МА, САД). Квантитативна ПЦР анализа реверзне транскрипције у реалном времену је изведена коришћењем ЦФКС96 Тоуцх система за детекцију ПЦР у реалном времену (Био-Рад Лабораториес, Херцулес, Калифорнија, САД), а производи реверзне транскрипције су инкубирани са ТакМан ПЦР Мастер Мик-ом и прилагођеним ТакМан-ом. сонда (Апплиед Биосистемс, Валтхам, МА, САД), као што је претходно описано [26]. Коришћене су ТакМан сонде против следећих гена: колаген И(Мм00801666_г1), колаген ИИ (Мм01254476_м1), ТГФ- (Мм01178819 м1),п53(Мм00441964 г1),п21( Мм04205640 г1).п16(Мм00494449 м1)ГЛС (Мм01257297_м1), Бнип3 (Мм01275600_г1) и Нок2 (Мм00627011_м1). Нивои мРНА су нормализовани на нивое 18С рибосомална РНК.
4.4. Вестерн блот анализа Експресија протеина је анализирана Вестерн блот анализом хомогената ткива коришћењем претходно описане методе [27,28]. Укупни протеински екстракти су припремљени из ткива коришћењем пуфера за узорке који садржи натријум додецил сулфат. Концентрација протеина у сваком узорку је мерена коришћењем комплета за испитивање протеина компатибилног са детерџентом (Био-Рад Лабораториес, Херцулес, Калифорнија, САД) и НаноДроп Оне (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА), са говеђим серумским албумином као стандардне. Једнаке количине протеинских екстраката из узорака ткива су фракционисане на 5-20 процената полиакриламидних гелова (АТТО Цорп., Токио, Јапан). Одвојени протеини су затим пребачени на поливинилиден дифлуоридне мембране коришћењем Семи-Дри Трансфер Систем (АТТО Цорп., Токио, Јапан). Мембране су блокиране 1 х на собној температури са физиолошким раствором пуферованим фосфатом који садржи 5 процената обраног млека у праху. Мембране су инкубиране са примарним антителима против Клотхо (аб181373 1:1000; Абцам, Цамбридге, УК), НАМПТ(сц-67020 1:5000; Абцам), СИРТ1(07-131 1:1000, МиллипореСигма , Бурлингтон, МА, САД), 4-ХИНЕ(МХН-100П 1:1000; ЈаИЦА, Фукурои, Јапан) и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ) (2118, 1:2000; Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА, САД). Мембране су испране и инкубиране са секундарним антителима 60 минута на собној температури. Места за реакције антитело-антиген су визуелизована коришћењем супстрата побољшане хемилуминисценције (Мерцк, Кенилвортх, Њ, УСА). ГАПДХ је коришћен као контрола оптерећења. Слике су квантитативно анализиране коришћењем ЦхемиДоц Тоуцх-а (Био-Рад Лабораториес, Херцулес, Калифорнија, САД).
4.5. Хистолошка анализа је изведена као што је претходно описано [29]. Бубрежна ткива мишева су фиксирана са 4 процента параформалдехида и потом уграђена у парафин. Секције (дебљине 4 ум) су обојене ПАС и МТ мрљама. Да би се проценила област гломерула, измерено је 50 гломерула по мишу и измерено им је просечно. Све слике су добијене помоћу микроскопа БЗ-9000 (Кеиенце Цорп., Осака, Јапан).
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЖНУ/БУБРЕЗНУ ДИЈАЛИЗУ
4.6. СА- -ал бојење Бубрежна ткива мишева су брзо замрзнута и постављена у једињење са оптималном температуром резања (Сакура ФинетекЈапан, Цо., Лтд., Токио, Јапан). Секције (дебљине 4 μм) су припремљене коришћењем криостата (ХМ550-ВПД); Тхермо Фисхер Сциентифиц) и монтирана на стаклене дијапозитиве. Активност СА- -гала је мерена коришћењем комплета за детекцију старења (Био Висион Инц., Милпитас, Калифорнија, САД) у складу са протоколима произвођача. Узорци су посматрани под светлим пољем при увећању ×100 коришћењем БЗ-9000микроскопа (Кеиенце Цорп.. 4.7.Електронска микроскопијаАнализа електронском микроскопом је обављена као што је претходно описано [30]. Мишеви су анестезирани изофлураном и перфузирани кроз десни лук аорте са хепаринизованим (5 У/мЛ) физиолошким раствором и 2,5 процената глутаралдехида у 0,1 мол/Л фосфатног пуфера на пХ 7,4. Узорци за трансмисијску електронску микроскопију су уроњени у 1 процентни осмијум тетроксид током 2 х, серијски дехидрирани у етанолу и уклопљени у смешу Епон. УлИтратхин пресеци су обојени уранил ацетатом и оловним цитратом и прегледани помоћу Хитацхи Х-7500 трансмисионог електронског микроскопа који ради на 80 кВ (Хитацхи, Лтд., Токио, Јапан). Секције су посматране при увећању × 5000 и фотографисане помоћу камере уређаја са спојеним пуњењем.
4.8.Биохемијска анализаУзорци крви су узети пункцијом срца у нахрањеном стању. Узорци пуне крви су центрифугирани на 3000 рпм (МР-150; Томи Сеико Цо., Лтд., Токио, Јапан) 10 минута на 4 степена да би се одвојила плазма. Добијени узорци плазме су ускладиштени на -80 степени. Нивои креатинина у плазми, УН и креатинина у урину мерени су помоћу Хитацхи 7180 аутоанализера (Хитацхи, Лтд., Токио, Јапан).
4.9. Статистичка анализа Статистичке анализе су обављене коришћењем софтвера ГрапхПад Присм (ГрапхПад Софтваре Инц., Сан Дијего, Калифорнија, САД). Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ. Неупарени Студентов ф-тест је коришћен за поређење разлика између група за контролу возила и АА група.п<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ЗакључциАА администрација узрокујебубрегастарење, заједно са тубулоинтерстицијском фиброзом и атрофијом бубрега. Резултати сугеришу да је фиброза бубрега уско повезана са старењем бубрега и да ААН може бити користан каобубрега-специфичан модел старења.