Брз и једноставан протокол за чишћење и отицање за 3Д ин-ситу снимање бубрега широм скале
Mar 23, 2022
Последњих година објављени су многи протоколи светлосне микроскопије за визуелизацију структура наноразмера убубрега.Ови протоколи представљају истраживачима нове алате за процену и анатомије процеса стопала и брисања, као и дистрибуције протеина у процесима стопала, дијафрагми са прорезом и у базалној мембрани гломерула. Међутим, ови протоколи или укључују примену различитих компликованих микроскопа супер-резолуције или дугачке протоколе за припрему узорака. Овде представљамо брзу и једноставну, петочасовну процедуру за тродимензионалну визуализацијубубрегаморфологија на свим скалама дужине. Протокол комбинује концепте оптичког чишћења и експанзије ткива да би се произвео благи оток, довољан за решавање структура наноразмера коришћењем конвенционалног конфокалног микроскопа. Показали смо да се протокол може применити за визуелизацију широког спектра патолошких карактеристика и код миша и код људибубрези. Дакле, наш брз и једноставан протокол може бити користан за конвенционалну микроскопску проценубубрегаинтегритет ткива како у истраживањима, тако и евентуално у будућим клиничким рутинама.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ФУНКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Бројни оптички протоколи за снимање структура наноразмера убубрегасу представљени последњих година. И- Моћ ових нових техника као алата за квантификацију анатомије и патологије филтрационе баријере је илустрована у недавним публикацијама наше групе и других.5, проценат ,10 Иако моћни, сви ови оптички протоколи захтевају употребу напредна микроскопија са неограниченом дифракцијом или укључује увођење комплексне хемије полимера у узорак да би се он скупио и/или физички проширио. Многи од протокола такође одузимају време и захтевају значајну количину практичног рада. Овај додатни слој сложености може бити оно што спречава да ове нове методе рутински користе и истраживачи и клинички патолози. Штавише, многим протоколима недостаје приступ дубоком 3-димензионалном (3Д) снимку процеса стопала (ФПс) изнад 5-15 ум дубине.-1,7,8 Стога смо имали за циљ да развити драстично поједностављен и брз потпуно оптички протокол који чисти и просторно растебубрегаузорке ткива довољно да омогуће ин ситу 3Д анализу високе резолуцијебубрежнианатомије и патологије користећи конвенционални микроскоп са ограниченом дифракцијом који је доступан у скоро свим научним и патолошким установама.Претходна поједностављења протокола су показала да се увођење акриламидних полимера у узорке фиксиране параформалдехидом може потпуно изоставити, а да се и даље очува интегритет ткива на клиренсу натријум додецил сулфата (СДС). Друга студија је показала да се узорци ткива могу проширити за више од фактора 2 коришћењем једноставног протокола без полимера заснованог на урањању у различите водене растворе.2 Стога смо уклонили инфузију акриламида из наших досаднијих и сложенијих објављених протокола² и променили медијум за уградњу узорка да би се омогућило благо (1.3-пут линеарно) отицањебубрегаузорци ткива. Такође, оптимизујући параметре снимања, постигли смо довољно високу ефективну резолуцију за 3Д визуализацију ФП подоцита и гломеруларне базалне мембране (ГБМ) коришћењем конвенционалне конфокалне микроскопије.
Кључне речи:фокална сегментна гломерулосклероза; ИгА нефропатија; подоцит; биопсија бубрега; патологија бубрега; бубрега
РЕЗУЛТАТИ
Оптичко чишћење и благи оток бубрежног ткиваЈедноставан протокол деаринг/свеллинг је шематски приказан на слици ла. Имајте на уму да је корак СДС делипидације додат не првенствено ради оптичке транспарентности, већ ради обезбеђења довољног бубрења узорака.7 Штавише, када се изостави делипидација, квалитет бојења је лош (додатна слика СлА). Показали смо да је брза делипидација на 70 степени током 1 сата дала добре резултате без да се деградација узорка догоди на вишим температурама (додатна слика С1Б). Како су известили Мураками и сарадници, уреа и молекули слични уреи могу ефикасно да набубре узорке ткива, што резултира повећаном ефективном просторном резолуцијом. Стога смо додали 4 М урее у смешу са 80 процената (тежина/теж) фруктозе (названо ФРУИТ), што је резултирало линеарним фактором бубрења од -1.3 (слика лб).
Да бисмо скратили време обележавања, користили смо примарна антитела коњугована бојом. У почетку, када се користе антитела на нефрин коњугована бојом у стандардном пуферу за бојење (физиолошки раствор пуферован фосфатом са Твеен 20), ефикасност сигнала и обележавања није била довољно висока да би се оцртале појединачне ФП. Међутим, коришћењем алтернативног пуфера за бојење, ХЕПЕС-ТСЦ, квалитет бојења је повећан на задовољавајући степен (додатна слика С1Ц). У поређењу са претходно објављеним протоколима који користе конвенционалну микроскопију, наш брзи и једноставни 5-сатни протокол их је надмашио по неколико битних параметара (Слика лц-ф). Протокол који су представили Пуллман ет ал.' је нешто бржи у целини, али има недостатке што захтева микроскопију структурираног осветљења супер-резолуције и коришћење танких криосекција, спречавајући приступ великим дубинама снимања. Треба напоменути да је наш протокол мање сложен од стандардног уграђивања парафина или криосекције када се узму у обзир сви процењени параметри.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЗУ/БУБРЕЗУ
Оптимизација и валидација нашег протокола за решавање процеса стопалаПошто наш протокол даје само умерени фактор бубрења од 1,3, параметри конфокалног снимања су морали бити оптимизовани да би се постигла довољна моћ резолуције за ФП-ове за снимање. Мишбубрегаузорци су третирани према протоколу и обојени на нефрин коришћењем различитих флуорофора. Резолуција конфокалног микроскопа зависи и од величине рупице и од таласне дужине ексцитационе/емисионе светлости.15 Дакле, користили смо мањи пречник рупице од 0.3 Аири јединице (АЈ) заједно са зелено-емитујућим дие, Алека Флуор 488, и на овај начин постигао довољну резолуцију за решавање ФП-а код миша дивљег типа (ВТ)бубрези(Слика 2а). Стога, кад год треба да се визуелизују мишји ФП, користе се флуорофори са максималном таласном дужином побуде од 488 нм. Под овим оптимизованим условима снимања, били смо у могућности да визуелизујемо целе гломеруле миша у 3Д са ефективном резолуцијом од -115 нм, довољно добром да разрешимо појединачне ФП (Слика 2б-е). Штавише, показујемо да се дубина пенетрације антитела од најмање 70 μм постиже брзим обележавањем (додатна слика С2А-Ц). Коришћењем глицеронског објектива са корективном крагном, обезбеђује се приступ већим З-дубинама него било који од претходно развијених протокола, са изузеткомпротокол чишћења/стимулисане емисије. Пошто је аксијална резолуција конфокалног микроскопа отприлике 3 пута лошија од латералне резолуције, капиларе треба да буду оријентисане у ки равни за оптимално решавање ФП. Показујемо да са нашим протоколом можемо пронаћи много (до 25) области за снимање у сваком гломерулу (додатна слика С2Д), што нам омогућава да прикупимо велике количине података да бисмо такође открили суптилне варијације у структурама баријере за инфилтрацију. Ово показује важност приступа димензији дубине приликом извођења квантитативних анализа здравља гломерула високе пропусности. Важно је да смо такође потврдили протокол за решавање ФП-а у материјалу људских пацијената (Слика 2ф и г), који је мање изазован у поређењу са мишевима, због већих димензија људских ФП-а. Штавише, користећи аглутинин пшеничних клица (ВГА) лектин са афинитетом према гликокаликсу ФП, такође смо били у могућности да разрешимо ФП на начин попречног пресека у узорцима мишева и људи (Слике 2х и и). Поред тога, одредили смо нефрин, са очекиваном локализацијом у прорезној мембрани, што показује да поред морфолошких информација можемо добити податке о локализацији протеина.
Патологија филтерске баријере у узорцима мишеваКао што је раније објављено, '-,5,6,9,10 ен фаце ФП снимак дијафрагме са прорезом може се лако користити за визуелизацију и квантификацију ФП брисања. Потврђујемо да се овај приступ такође може применити са нашим новим протоколом користећи недавно објављен модел миша за фокалну сегменталну гломерулосклерозу (ФСГС) (слика 3). Бојењем за нефрин, узорак дијафрагме прореза се може визуализовати у 3 димензије у целим гломерулима ВТ и мутираним мишевима (Слике 3а и б). Као што је раније објављено, 5, дужина дијафрагме са прорезом по површини може се квантифицирати полуаутоматски, а ова анализа даје резултат који је у складу са оним што је раније објављено за ову линију миша' (Слика 3ц). Штавише, гломеруларне капиларе су снимљене у попречним пресецима који показују и брисање ФП-а као и промене на ГБМ (Слика 3д-ф); погледајте додатне методе и слику С3 за детаље о ГБМ мерењима.
Патологија филтерске баријере у људским узорцимаДа бисмо додатно потврдили наш протокол за могућу клиничку употребу, применили смо га на људско ткиво пацијената којима је дијагностикована различита врстаобољење бубрега. Два пацијента са конгениталним нефротским синдромом, било са хомозиготном мутацијом у НПХС1 гену (кодирају за нефрин), или транс-асоцираним мутацијама у ТРПЦ6 и НПХС2 генима (кодирају за ТРПЦ6 канал и подоцин). Такође смо анализирали 2 пацијента са дијагнозом ФСГС и болешћу минималних промена. Могли бисмо да визуализујемо и квантификујемо типичне карактеристикеобољење бубрега, као што је брисање ФП, као и измене ГБМ (Слика 4). Слике су се могле добити и ен фаце (Слика 4а-е) и са стране (Слика 4г-к). Штавише, приметили смо очекивано одсуство нефрина у дијафрагми са прорезима код пацијената са НПХС1 мутацијом (Слике 4б и х). Што се тиче узорака миша
(Слика 3), подаци о сликању могу се квантитативно проценити (Слика 4ф и л и додатна слика С4А и Б).
Треба напоменути да је неочекивано благо задебљање ГБМ примећено код дијагностикованих пацијената у поређењу са контролама. Контрола са нефректомијомбубрегана слици 4 узет је од старијег пацијента, док су сви остали узорци од дојенчади или деце. Пошто се дебљина ГБМ повећава са годинама (додатна слика С5А-Е), вероватно би се приметило значајније задебљање у поређењу са контролним пацијентима који одговарају годинама. Такође смо потврдили да наш протокол није увео артефакт отока који зависи од старости (додатна слика С5Ф-Х), као и да је другачија стратегија мерења ГБМ дала сличне резултате (додатна слика С5И и Д).
Патологија великих размера у узорцима мишева и људиЈер не само скала филтрационе баријере, већ и хистолошке промене набубрежниморфологије, од великог су интереса и за истраживаче и за клиничаре, истражили смо могућност коришћења нашег протокола за процену морфологије великих размера кроз хистолошку анализу засновану на флуоресценцији. Показали смо да бисмо коришћењем нижих циљева увећања могли да откријемо велике патологије и разлике у експресији протеина у људским узорцима (додатна слика С6) и узорцима миша (додатна слика С7).
Визуелизација патолошких промена код пацијената са дијагнозом ФСГС и ИгА нефропатијеДа бисмо додатно илустровали могућу употребу протокола у узорцима пацијената, истражили смо да ли можемо да откријемо патолошке карактеристике ФСГС ћелијског типа. Били смо у могућности да визуализујемо већину патолошких карактеристика поменутих у изјави патолога, укључујући фокалну тоталну/сегменталну стенозу, тубуларну атрофију и ендотелну хиперцелуларност у гломеруларним капиларама у поређењу са садашњим методама златних стандарда (Слика 5а-ј). Квалитативно и квантитативно упоредно поређење са електронском микроскопијом (ЕМ) показало је сличне резултате коришћењем обе методе (Слика 5к и л и Додатна слика С4; погледајте Додатне методе за дискусију о мерењима ширине ФП).
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Такође смо применили протокол на биопсијски узорак пацијента са дијагнозом ИгА нефропатије (ИгАН) (Слика 6) и успели смо да потврдимо визуализацију многих дијагностичких карактеристика. У баријери за филтрацију нису биле евидентне озбиљне патологије (Слике 6а и б), а компаративна анализа није резултирала очигледним разликама између ЕМ и нашег протокола (Слике 6ц и д). Затим је хистологија позајмљеног бубрега процењена и стандардном хистологијом (слика 6е) и "флуоресцентном хистологијом" (слика 6ф). Могли бисмо да визуелизујемо промене (или недостатак промена) поменуте у изјави патолога, као што су интерстицијска инфилтрација ћелија (Слика 6г и х), нормалне гломеруларне капиларе (Слика 6и) и мезангијална експанзија/хиперцелуларност (Слика 6ј). Имунобојење коришћењем ИгА антитела јасно је открило наслаге како у великој мери (Слика 6к и л), тако иу детаљима (Слика 6м) са узорком који је еквивалентан оном који се види на стандардној имунофлуоресценцији (Слика 6н и о). Коначно, ФП снимање је показало делимично благо брисање (Слике 6п и к). Патолошке карактеристике које можемо открити нашим протоколом су сажете у Додатној табели С1.
ДИСКУСИЈА
Овде представљамо протокол за визуелизацију високе пропусностибубрежниструктуре на свим скалама дужине што је и брже и једноставније од претходно објављених протокола за ФП анализу и снимање баријере гломеруларне филтрације убубрега, Показујемо да је резолуција коју постижемо довољно висока да извучемо закључке о патологијама у филтрационој баријери користећи једноставну конфокалну микроскопију, стандардни алат који је већ доступан у већини истраживачких установа и лабораторија за патологију. 3Д способност протокола је важна када се врши снимање ФП-а јер је доступан велики обим слике, омогућавајући идентификацију и скрининг погодних региона узорка за квантитативну анализу.
Важан налаз наше студије је да наш протокол не само да ради комплементарно и корисно у поређењу са стандардним протоколима који се тренутно користе за стандардну анализубубрегаткива. Такође би могао да споји ове токове рада у један протокол, са очигледним уштедама у погледу радних сати и потребних материјала/реагенса/опреме. Међутим, како се анализа у великој мери заснива на антителима, цена реагенаса за обележавање је прилично висока (око 20е по узорку), што важи и за друге протоколе засноване на флуоресценцији представљене у овом чланку (укључујући редовну имунофлуоресценцију).
У најбржој верзији протокола, користимо примарна антитела коњугована бојом која дају довољан квалитет бојења за решавање ФП. Међутим, резултујући сигнал је увек нижи у поређењу са оним из 2-корак примарног/секундарног приступа. Штавише, примарна коњугована антитела коришћена у студији нису комерцијално доступна и морају се коњуговати у кући. Стога, за неке апликације, протокол примарног/секундарног бојења 2-корак и даље може бити пожељнији, додајући 2 сата протоколу. Недавне студије су примениле Аирисцан микроскопију набубрежниткива, које користи променљива подешавања рупица на малом детектору низа камера у комбинацији са обрадом слике са деконволуцијом и прерасподелом сигнала.7,18 У овој студији показујемо да са благим отоком и накнадним одличним условима бојења и снимања, конвенционално конфокално снимање са
Затворена рупица пружа довољну резолуцију без потребе за математичком накнадном обрадом слика. У овом раду дајемо упоредне податке за наш протокол и стандардне методе за процену патологије у узорцима пацијената. Међутим, анализа је спроведена на малом броју пацијената и даља истраживања су од кључног значаја да би се истражило да ли се протокол може користити за откривање мноштва патолошких параметара присутних у другим типовимаболести бубрегатакође. Да би се то постигло, мора се покренути фокусиран заједнички напор који укључује и патологе, стручњаке за припрему узорака и стручњаке за снимање. Ова темељна валидација није била у оквиру ове студије доказа о принципу, у којој је циљ био да се развије брз, оптички протокол за снимање слике високе резолуцијебубрега.Такође треба нагласити да је резолуција нашег протокола далеко од ЕМ и не може да реши фибриларне наслаге, на пример, па би у неким случајевима ЕМ и даље био потребан за тачну дијагнозу.
У овој студији смо користили необрађена мерења дужине без корекције за артефакте секције који произилазе из неортогоналног оптичког или физичког сечења мерене структуре (ГБМ или ФП). Постоје 2 главна разлога за представљање података у овом облику. Прво, исправити артефакте секције уз задржавање информација у вези са изменама на наносмерама (као што је неправилан „квргав” ГБМ) није једноставно. Друго, у нашим провидним узорцима увек смо бирали раван за снимање
у којој је структура која се проучава што је могуће ортогоналнија у односу на раван слике. Дакле, секција није насумична, што додатно компликује анализу артефаката секције. Сходно томе, средње вредности представљене у овој студији вероватно су мало прецењене, а артефакти секције доприносе ширењу података у дијаграмима расејања. За будућа мерења конструкција исправљених секцијама без губитка стварних варијација података, потенцијално би се могле применити модификоване верзије постојећих метода корекције артефаката секције, као што је метода ортогоналног пресека.!920
Способност извлачења патолошких параметара из очишћенихбубреганедавно је демонстрирано ткиво које користи и необележене (аутофлуоресцентно) и флуоресцентно обележене узорке.- Штавише, недавна студија је показала да се „виртуелна хистологија“ може извести помоћу дубоког учења ал-фор ставки на сликама аутофлуоресценције и сегментације засноване на неуронској мрежи и такође је приказана класификација бубрежних патологија. Спајање нових метода припреме узорака (као што су овде наведене) са новим алатима за анализу слике представља многе занимљиве дигиталне могућности у будућности, и вероватно ћемо видети промене у начину на који замишљамо и анализирамо узорке бубрега како у истраживању тако и на клиници.
МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ Мишје и људско бубрежно ткивоСве експерименте са мишевима одобрила је немачка државна канцеларија Северне Рајне-Вестфалије, Одељење за природу, животну средину и заштиту потрошача, и изведени су у складу са европским, националним и институционалним смерницама. Коришћени су мишеви са 100% позадине Ц57БЛ/6Н. После индукције анестезије са кетамином и ксилазином, мишеви су еутаназирани срчаном перфузијом са Хенковим балансираним раствором соли и фиксирани како је описано у наставку.
Материјал за пацијенте је добијен од 2 деце која пате од нефротских синдрома отпорних на стероиде због тачкастих мутација у НПХСИ или једињења-хетерозиготних тачкастих мутација у ТРПЦ6 и НПХС2, као и од 3 пацијента са дијагнозом фокалне сегментне гломерулосклерозе, болести минималних промена и ИгА нефропатије. , редом. Контролно људско ткиво је сакупљено од пацијената који су нефректомизирани збогбубрежнитумори. Узорци ткива сецирани са нетуморозног полабубрегапоказала нормалну хистолошку слику на рутинском хистолошком прегледу. Све процедуре су одобрене од стране Етичке комисије Келна и регионалног Етичког комитета из Стокхолма и спроведене су у складу са Хелсиншком декларацијом. Када је применљиво, пацијент или старатељ пацијента дао је информисани пристанак.
Модел миша за ФСГСМишеви са 2 једињења хетерозиготне тачкасте мутације, Под8асициАзв су генерисани као што је претходно описано." Мишеви су жртвовани у старости од 20 недеља као што је горе наведено.ФиксацијаЧовек и мишбубрезису фиксирани у 4% параформалдехида у 1× физиолошком раствору пуферованом фосфатом на собној температури током 1-3 сати. Човек са нефректомијомбубрегаје фиксиран у раствору Дубосак-Брасил 3 сата.СецтионингУзорци су уграђени у 3% агарозе и исечени на дебљину од 300 μм помоћу вибратома.ДелипидацијаУзорци су инкубирани у раствору за чишћење (200 мМ борне киселине и 4 процента СДС, пХ 8,5) на 70 степени Ц током 1 сата уз мућкање на 500 пм.ЕтикетирањеПротокол обележавања и листа антитела/сонди су дати у Додатном материјалу.МонтажаУзорци су инкубирани у 80 процената фруктозе (1 мл дХ,0 додат у 4 г фруктозе) која садржи 4 М урее на 37 степени уз мућкање на 500 рпм током 15 минута, а затим стављени у МатТек посуду (МатТек , Асхланд, МА) са покровним стакалцем на врху (да би се спречило испаравање) пре снимања,ИмагингСлике су добијене коришћењем Леица СП8 конфокалног система (циљеви су наведени у легендама слика) (Леица Мицросистемс, Буффало Грове, ИЛ). Снимање са 100× објективом увек подразумева поставку рупице од 03 АУ (како је израчунато за 594-нм светлост) ако није другачије наведено. Стандардно хистолошко снимање је изведено коришћењем Леица ДМ3000 система (Слика 5) или Олимпус БКС45 система (Олимпус, Токио, Јапан) (Слика 6). Стандардна имунофлуоресценција је изведена коришћењем Никон Мицропхот-ФКСА (Никон, Токио, Јапан), а ЕМ је изведена са Зеисс 912 (Слика 5) или Хитацхи 7700 (Хитацхи, Токио, Јапан) (Слика 6) трансмисионим електронским микроскопом.Обрада и анализа сликеОсим ако није другачије наведено, слике су изглађене заменом сваке вредности пиксела усредсређеном на њено окружење 3 × 3 коришћењем Фији/ИмагеЈ (Национални институт за здравље, Бетхесда, МД). Морфометријске анализе су описане у Додатним методама и приказане на Додатној слици С4.
