Засновано на мрежној фармакологији и експериментима на животињама за истраживање ефекта фенилетаноидног гликозида Цистанцхе Тубулоса на ефекат дијабетичке нефропатије

Апстракт: Циљ Истражити ефекатЦистанцхефенилетанол гликозиди(ЦПхГс) укљученодијабетесна болест бубрега(ДКД) на основу мрежне фармакологије и експеримената на животињама. Методе УХПЛЦ-КЕ-МС метода је коришћена за анализухемијске компоненте ЦПхГ-а. ТЦМСП и Свисс Таргет Предицтион базе података су коришћене за преглед основних компоненти. ОМИМ и ГенеЦардс базе података су коришћене за добијање циљева везаних за ДКД. Након добијања заједничких циљева, веб локација СТРИНГ је коришћена за изградњу мреже интеракције протеина. ДАВИД база података је коришћена за ГО, анализу КЕГГ пута, а софтвер Цитосцапе је коришћен за конструисање мреже „ЦПхГс цоре цомпонент-таргет-патхваи”. Десет пацова је насумично одабрано као нормална група, а преостали пацови су храњени храном са високим садржајем шећера и масти и дата им је једна интраперитонеална ињекција СТЗ да би се успоставио ДКД модел. Били су подељени у моделску групу, групу дапаглифлозина (1 мг/кг) и ЦПхГ високе и средње и ниске дозе (500, 25{{40}}, 125 мг/кг) групе, 10 животиња у свакој групи, интервенција лека током 6 недеља, посматрана су општа стања, одређивана телесна тежина и испитиван је ниво глукозе у крви сваке недеље; 24 х урин је сакупљен након последње дозе. Откривање 24-сатног укупног протеина у урину (24-УТП); прикупити крв из абдоминалне аорте и жртвовати је, одвојити серум и открити азот урее (БУН), мокраћну киселину (УА), укупан холестерол (ТЦ), триглицериде (ТГ) и висок крвни притисак. Нивои липопротеина високе густине (ХДЛ) и липопротеина ниске густине (ЛДЛ), ХЕ бојење и Массоново бојење су коришћени за посматрање патолошких промена у бубрежном ткиву, ЕЛИСА је коришћена за откривање серумског ИЛ-1 , ИЛ{{17} }, и нивои ТНФ-а, а Вестерн блот је коришћен за откривање бубрежног ткива. Експресија протеина ЈАК2, п-ЈАК2, СТАТ3, п СТАТ3, СОЦС3. Резултати Укупно 699 компоненти је детектовано УХПЛЦ-КЕ-МС технологијом. Након скрининга, добијено је 16 кључних компоненти ЦПхГ-а и 323 сродна циља. ЦПхГ и ДКД су делили 99 мета. Кључни циљеви су били СТАТ3, СРЦ, ЕГФР, итд. КЕГГ анализа пута је прегледала 151 сигнални пут, показујући да сигнални пут ИЛ-17, сигнални пут ПИ3К/Акт, сигнални пут ТНФ, итд. могу играти кључну улогу у лечење ДКД од стране ЦПхГ. ЦПхГ могу да повећају телесну тежину ДКД пацова (П<0,01), смање потрошњу воде (П<0,01), регулишу метаболизам глукозе и липида, смање 24-нивое УТП и БУН (П<0,01) и побољшају бубрежно ткиво . Патолошко оштећење смањило је експресију протеина п-ЈАК2/ЈАК2 и п-СТАТ3/СТАТ3 у бубрежном ткиву (П<0,01) и повећало експресију протеина СОЦС3 (П<0,01). Закључак ЦПхГ интервенишу у ДКД кроз више компоненти, више мета и више путева, вероватно инхибирањем ЈАК2/

СТАТ3 сигнални пут.

Кључне речи: Цистанцхе фенилетанол гликозид; дијабетичка нефропатија; УХПЛЦ-КЕ-МС; мрежна фармакологија; експеримент на животињама; ЈАК2 /СТАТ3 сигнални пут

КОЛИКО ЈЕ ТРЕБА ДА ЦИСТАНЦХЕ проради КОД БУБРЕЖНИХ БОЛЕСНИКА?

Дијабетичка болест бубрега (ДКД), као једна од најважнијих микроваскуларних компликација дијабетеса, није само примарни фактор који доводи дохронична болест бубрегаали и главни узрок завршног стадијума бубрежне болести (ЕСРД) широм света. Разлог [1-2]. Клинички третман ДКД углавном укључује прво контролу шећера у крви, крвног притиска и липида у крви, и друго, заштиту функције бубрега, избегавање употребе нефротоксичних лекова и побољшање начина живота [3-4]. Међутим, због сложене патогенезе ДКД и недостатка специфичних циљева интервенције, тренутне опције лечења имају ограничења и нису ефикасне. Инциденца ДКД у завршној фази и даље расте. Због тога је од великог значаја пронаћи ефикасне природне лекове.

Цистанцхе Десертицола И. Ц. Ма орЦистанцхе Ц.Осушене меснате стабљикеЦистанцхе тубулоса (Сцхенк) Вигхтса љускавим листовима [5] први пут су забележени у „Схен Нонг’с Материа Медица” и наведени су као врхунски. Познати су као „пустињски гинсенг“ [6]. Слатки су, слани и топли. , враћа се у меридијане бубрега и дебелог црева и има ефекте храњења јанга бубрега, обнављања есенције и крви, влажења црева и лаксатива. Истраживања показују да су фенилетаноидни гликозиди (ЦПхГ) један од његових главних активних састојака и да су одговорни за његов развој.

Материјална основа за испољавање фармаколошких ефеката; Екстракт Цистанцхе има антидијабетичко [7-8], рак јетре [9], заштиту бубрега [10-11], неуропротективно [12-13] и друге фармаколошке ефекте, али тренутно ЦПхГс нису ефикасни у лечењу ДКД. Његови ефекти и механизми су нејасни.

Ова студија је користила мрежну фармакологију и методе молекуларног спајања [14], узимајући ЦПхГс као предмет истраживања, предвиђајући и анализирајући његове главне активне састојке и потенцијалне циљеве за лечење ДКД, а затим успостављајући комбинацију високих вредности изазваних стрептозоцином (СТЗ). ДКД модел пацова храњен липидном храном коришћен је као предмет истраживања ин виво, да би се обезбедила референца за клиничку експанзију и примену сродних третмана и даља истраживања о механизму деловања.

1 материјал

1.1 Животиње

70-седмично стари мужјаци СД пацова са СПФ нивоом, телесне тежине (240±20) г, купљени су од Центра за експерименте на животињама Медицинског универзитета Синђианг [лиценца за експерименталну употребу на животињама бр. СИКСК (нова) {{4} }], на Животиње су адаптивно узгајане 1 недељу на температури од (22 ±2) степена, релативној влажности од 50% до 70%, и циклусу наизменичног светла и таме од 12 х/12 х. Експеримент је одобрио Комитет за етику животиња Медицинског експерименталног центра за животиње Медицинског универзитета Синђианг (етички број ИАЦУЦ-20220127-19).

1.2 Реагенси и лекови

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) је обезбедио Ксињианг Хотан Дицхен Цо., Лтд. Дапаглифлозин (број серије НБ2248) је купљен од АстраЗенеца, УК. Храна са високим садржајем шећера и масти (кат. бр. Боаиганг-Б1135ДМ) и СТЗ (серија бр. 2021110307) купљени су од Беијинг Боаи Порт Биотецхнологи Цо., Лтд.; микроалбумин у урину (серија бр. 20220611), азот урее (серија бр. 20220626), мокраћна киселина (серија бр. 20220613), укупан холестерол (серија бр. 20220615), триглицериди (број серије 20220615), липо22206160 хигх-20220616 ), а липопротеин ниске густине (бр. серије 20220615) купљен је од Института за биоинжењеринг у Нањингу Јианцхенг; интерлеукин-6 (ИЛ-6, серија број ЈЛ20896), интерлеукин-1 (ИЛ-1, серија број ЈЛ20884) и фактор некрозе тумора- (ТНФ-, серија број 13202 ) купљени су од Схангхаи Јианглаи Биотецхнологи Цо., Лтд.; ЈАК2 зечје поликлонско антитело (партија број 22в9316), п-ЈАК2 зечје поликлонско антитело (партија број 78г9360), СТАТ3 зечје поликлонско антитело (партија број 15к8824), п-СТАТ3 зечје поликлонско антитело зечјег броја 74м2 (20000000000000 лот број 31д4841) сви су купљени од Јиангсу Кианке Биотецхнологи Ресеарцх Центер Цо., Лтд.; ХРП-обележено козје анти-зечје ИгГ поликлонско антитело (број серије 20000758) купљено је од Вухан Митака Биотецхнологи Цо., Лтд.; -актинско зечје моноклонско антитело (број серије АЦ230205001), РИПА пуфер за лизу (број серије 20220416), комплети за одређивање концентрације протеина БЦА (број серије 20230401) купљени су од Беијинг Солебао Тецхнологи Цо., Лтд.

1. 3 Инструменти

Ванкуисх течна хроматографија ултра високих перформанси, К Екацтиве Фоцус масени спектрометар високе резолуције, Хераеус Фресцо17 центрифуга, ФЦ аутоматски читач микроплоче (Тхермо Фисхер Сциентифиц, САД); ЈКСФСТПРП-24 млин (Схангхаи Јингкин Тецхнологи Цо., Лтд.); Мингцхе Д24 УВ мерач чисте воде (Немачка компанија Мерцк Миллипоре); АЦКУИТИ УПЛЦ БЕХ Ц18 колона (1,7 μм, 2,1 мм×100 мм) (Америцан Ватерс Цомпани); Аццу Цхек Перформа мерач глукозе у крви (швајцарска компанија Роцхе); ЦМ1850УВ криостат, ДМ300 усправни флуоресцентни микроскоп (компанија Леица, Немачка); ГЛ-88Б вортек метар (Хаимен Килин Белл Инструмент Мануфацтуринг Цо., Лтд.); електронска аналитичка вага (Био-Рад Цомпани, САД).

2 методе

2. 1 УХПЛЦ-КЕ-МС анализа

2.1.1 Припрема раствора за испитивање

Измерити 100 мг ЦПхГс, додати 500 μЛ 80% метанола, вртложном мешати 30 с, ултразвуком у купатилу са леденом водом 1 х, оставити да стоји на -40 степену 1 х, центрифугирати на 4 степена , 12 000 р/мин током 15 мин, аспирирајте супернатант, 0. Филтрирајте кроз микропорозну мембрану од 22 μм и чувајте у фрижидеру на температури од -80 степени.

2.1.2 Услови хроматографије

АЦКУИТИ УПЛЦ БЕХ Ц18 колона (1,7 μм, 2,1 мм × 100 мм); мобилна фаза ацетонитрила (А) -1% мравље киселине (Б), градијент елуирања (0 ~ 11 мин, 15% ~ 75% А; 11 до 12 мин, 75% до 98% А; 12 до 14 мин, 98% А; 14 до 14,1 мин, 98% до 15% А; 14 до 15 мин; Запремински проток 0 . 5 мЛ/мин; температура колоне 35 степени; запремина ињекције 5 μЛ.

2.1.3 Услови масене спектрометрије

потпуно скенирање ддМС2 режим потпуног скенирања; запремински проток гаса омотача 45 арб; запремински проток помоћног гаса 15 арб; температура капилара 400 степени; енергија судара у НЦЕ режиму 15% ~ 30% ~ 45% циклус; напон прскања ± 4. 0 кВ.

2.2 Мрежна фармаколошка истраживања

2. 2. 1 ЦПхГс

Циљни скрининг компоненти: Сортирајте хемијске компоненте анализиране помоћу УХПЛЦ-КЕ-МС према релативном садржају и обришите оне чије хемијске структуре још нису утврђене. Унесите ИнЦхИКеи серијски број прегледаних састојака у ТЦМСП базу података да бисте добили фармакокинетичке параметре сваког састојка. На основу услова оралне биорасположивости (ОБ) > 30% и сличности са леком (ДЛ) > 0,18, кандидати који испуњавају услове биће прегледани. Унесите СМИЛЕС број сваке компоненте у бази података Свисс Таргет Предицтион да бисте предвидели циљ и добили циљ хемијске компоненте ЦПхГс.

2. 2. 2 ДКД

Скрининг циља болести Користите „дијабетичка нефропатија“ као термин за претрагу да бисте тражили циљеве болести у базама података ОМИМ, ГенеЦардс и НЦБИ.

2. 2. 3 Изградња мреже компонента-циљ-болест

Унакрсни циљеви ЦПхГс компоненти и болести су добијени путем Р софтверског мапирања, а софтвер Цитосцапе 3.7.2 је коришћен за конструисање компонентно-циљног мрежног система, у којем је додатак за анализу детектовао кључне мете.

2. 2. 4 Изградња мреже интеракције протеин-протеин (ППИ)

Увезите циљне протеине укрштања компоненти и болести у СТРИНГ базу података, конструишите мрежу интеракције протеин-протеин (ППИ), избришите протеине без повезаних чворова у мрежи и поставите ниво поузданости најнижег резултата интеракције протеина на {{1} }.700. Конструишите ППИ мрежу, преузмите резултате у ТСВ формату, увезите их у софтвер Цитосцапе 3.7.2 и користите додатак за анализу да бисте даље приказали главне циљеве.

2. 2. 5 ГО, КЕГГ анализа

Користите одељак Функционалне напомене у ДАВИД бази података да бисте извршили анализу обогаћивања на метама укрштања компонентних болести. Прво подесите параметре анализе, унесите циљ пресека у поље за листу гена, изаберите званични-ген-симбол као идентификатор циља, изаберите листу гена као тип података (тип листе) и изаберите „Хомо сапиенс (врста)“ као циљни извор (Врсте). Раце)“, започните анализу након потврде параметара анализе, прибавите резултате ГО и КЕГГ анализе, а затим користите ИмагеГП онлајн платформу за цртање да нацртате балон дијаграм резултата КЕГГ и ГО анализе. Софтвер Цитосцапе 3.7.2 конструише компоненту -тагет-патхваи мрежна слика.

2. 2. 6 Молекуларно пристајање

Прво преузмите 3Д дијаграм структуре активног састојка у СДФ формату из базе података ПубЦхем, затим преузмите 3Д дијаграм структуре мете укрштања у ПДБ формату из америчке Глобалне базе података о протеинима (ПДБ) и коначно га отпремите на ЦБ-Доцк веб-сајт за молекуларно спајање. Прегледајте доминантне конформације пристајања и визуализујте их помоћу Пимола.

2.3 Експерименти на животињама

2.3.1 Моделирање, груписање и примена лекова

10 пацова је насумично одабрано као нормална група и храњено обичном храном, а преостали пацови су храњени храном са високим садржајем шећера и масти. После 6 недеља, дата им је једнократна интраперитонеална ињекција од 30 мг/кг СТЗ (0,1 ммол/Л СТЗ раствореног у пХ 4,5 натријум цитратног пуфера), а 72 сата касније узета је крв из репне вене. за откривање глукозе у крви наташте (ФБГ). Ако је ФБГ већи или једнак 16,7 ммол/Л, модел дијабетеса је успешно успостављен [15]; наставити Хранили су се храном са високим садржајем шећера и масти током 2 недеље. Утврђено је да је моделирање ДКД успешно на основу позитивног нивоа глукозе у урину и 24-сатног укупног протеина у урину (24-УТП) већег или једнаког 20 мг. Међу њима, 3 су умрла током процеса моделирања, а 7 је било неуспешно. , укупно 50 је било успешних. Пацови који су успешно моделовани су насумично подељени у групу модела, групу дапаглифлозина (1 мг/кг) и групу са високим, средњим и ниским дозама ЦПхГс (500, 250, 125 мг/кг). Свака група давана је интрагастрично. Пацовима у нормалној групи и моделној групи давани су одговарајући лекови, а пацовима у нормалној групи и моделној групи давана је иста количина нормалног физиолошког раствора путем сонде, једном дневно током укупно 6 недеља. Током периода примене, пацовима у свакој групи, осим нормалне групе, наставило се давати храну са високим садржајем масти.

2.3.2 Детекција биохемијских индикатора

После 6 недеља ЦПхГ интервенције, од пацова је сакупљен 24-часовни урин и мерен је 24-сатни укупан протеин у урину (24-УТП); крв је сакупљена из вене репа наташте да би се открили нивои ФБГ; крв је узета из абдоминалне аорте, 4 степена, 1500 о/мин. Центрифугирајте 10 минута да бисте одвојили серум и открили азот урее у серуму.

БУН), мокраћне киселине (УА), укупног холестерола (ТЦ), триглицерида (ТГ), липопротеина високе густине (ХДЛ), липопротеина ниске густине (липопротеина ниске густине ЛДЛ).

2.3.3 Посматрање патолошке морфологије бубрежног ткива

Пацови су анестезирани натријум пентобарбиталом и жртвовани. Бубрези су ољуштени, измерени, фиксирани са 4% параформалдехида, дехидрирани, провидни, умочени у восак, уграђени и исечени за бојење хематоксилин-еозином (ХЕ).

Након бојења по Массону, морфологија ткива је посматрана под микроскопом, а софтвер Имаге-Про Плус 6.0 је коришћен за анализу интегрисане оптичке густине и квантификацију релативне површине колагених влакана.

2. 3. 4 ЕЛИСА

Метода је коришћена за откривање нивоа серумских инфламаторних фактора код пацова. Нивои ИЛ-6, ИЛ-1 и ТНФ- су откривени према упутствима комплета.

2. 3. 5 Вестерн блот метода за детекцију сродне експресије протеина

Узето је ткиво бубрега пацова, додат је РИПА лизат за екстракцију укупног протеина, а концентрација је одређена БЦА методом.

После електрофорезе натријум додецил сулфат-полиакриламид гела, трансфер на ПВДФ мембрану, и након блокирања, ЈАК2 (1: 2000), п-ЈАК2 (1: 1000), СТАТ3 (1: 2000), п -СТАТ3 (1:2000), СОЦС3 (1:2000), -актин (1:2000) антитела, инкубирати на 4 степена преко ноћи, додати ХРП-обележено ИгГ секундарно антитело (1:5000) и инкубирати на собној температури 1 х, развијено са комплетом за електролуминисценцију, изложено помоћу протеинског гела, користећи софтвер Имаге Ј

Квантитативна анализа комада. Коришћењем -актина као интерне референце, однос сиве вредности циљне траке и унутрашње референтне траке је релативна експресија протеина.

2.4 Статистичка анализа

Подаци су обрађени софтвером СПСС 25.0, а подаци су изражени као (к±с). За поређење између група коришћена је једносмерна анализа варијансе. П<0.05 indicates that the difference is statistically significant.