Бензиловани дихидрофлавони и алкалоиди добијени из изокинолина из коре Дицлинанона Цалицина (Аннонацеае) и њихова цитотоксичност

За више информација контактирајтеtina.xiang@wecistanche.com

Апстрактан: Дицлинанона цалицина РЕ Помфрит популарно познат као "енвиро", је врста породице Аннонацеае ендемична за Бразил. У нашој сталној потрази за биоактивним једињењима из амазонских биљака Аннонацеае, кора Д.цалицина је истраживана класичним техникама хроматографије које су дале тринаест једињења (алкалоида и флавоноида) описаних по први пут у Д. цалицина као иу роду Дицлинанона. Структура ових изолованих једињења је утврђена опсежном анализом коришћењем 1Д/2Д-НМР спектроскопије у комбинацији са МС. Изоловани алкалоиди су идентификовани као припадајући подкласама: прости изохинолин, тали онлине (1); апорфин, анонаин (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензилтетрахидроизохинолини, (С)-(плус)-ретикулин(4); дехидро-оксонорретикулин (3,4-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5 );( плус )-1С,2Р-ретикулин Нг-оксид (6); и ( плус )-1С,2С-ретикулин Н-оксид (7); тетрахидро протоберберин, корексимин(8); и павине, биснораргемонин (9). Докфлавоноидиспадају у бензилиранедихидрофлавони, изорхамнетин (10), дицхаманетин (11) и мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13). Једињење 5 је први пут у литератури описано као природни производ. Цитотоксична активност главних изолованих једињења је процењена против рака и неканцерозних ћелијских линија. Међу испитиваним једињењима, најперспективнији резултати су пронађени за бензилиране дихидрофлавоне дихаманетин (10) и смешу уваринола (12) и изоуваринола (13), који су показали умерену цитотоксичну активност према испитиванимћелија ракалиније(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 уг·мЛ-И). Дицхаманетин (11) је показао цитотоксичну активност према ХЛ-60 и ХЦТ116 са ИЦ50 вредностима од 15,78 уг·мЛ-И (33,70 умол·ЛИ) и 18,99 уг∶мЛ-（40,56 умол. Л-）, респективно, док је мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13) показала цитотоксичну активност против ХЛ-60, са ИЦ5 вредношћу од 9,74 угс.мЛ-1, и ХЦТ116, са ИЦ50 вредност 17,31 уг. мЛ-И. Ове цитотоксичне активности се могу приписати присуству једне или више хидрокси бензил група присутних у овим молекулима, као и позицији у којој су ове групе повезане. Цитотоксичне активности ретикулина, анонаина и лириоденина су претходно утврђене, при чему је лириоденин најмоћније једињење.

Кључне речи: Дицлинанона цалицина; алкалоиди и бензиловани дихидрофлавони; цитотоксична активност

Кликните да сазнате више о производима

1. Представљање

Аннонацеае је велика породица тропског и суптропског дрвећа и жбуња, која обухвата око 112 родова и 2440 врста [1]. Неколико врста је познато по јестивим плодовима и лековитим својствима ]2]. Претходно фитокемијско истраживање са неким врстама Аннонацеае довело је до изолације и карактеризације различитих класа секундарних метаболита, као што су монотерпени, дитерпени, тритерпени, лигнани,флавоноиди, фенилпропаноиди добијени од асарона, ацетогенини и углавном типични алкалоиди изведени из изохинолина [3-7]. Неки од ових секундарних метаболита изолованих из врста Аннонацеае показали су важне биолошке активности, као што су антиинфламаторна својства и својства инхибирања уреазе [8,9], трипаноцидна [10,11], лајшманицидна [11,12], антималаријска [4,13] , антимикробно [4,14,15], антиоксидативно и антиреуматско деловање [9,15] и, посебно, цитотоксично деловање против различитих хуманих туморских ћелијских линија [4,6,11,16-21].

Иако се породица Аннонацеае сматра примитивном и добро проученом породицом, неколико фитокемијских и/или фармаколошких студија је спроведено са њеним врстама[3]. Фитокемијске и/или фармаколошке студије су се углавном фокусирале на врсте родова Аннона, Асимина и Цананга, због њиховог великог економског значаја, и на неке врсте из родова Дугуетиа, Гуаттериа и Ксилопиа[5]. Упркос великом порасту у последњих 20 година у односу на фитокемијске и фармаколошке студије, број истраживаних врста је и даље веома мали у односу на велики број признатих врста. Тренутно, према научним базама података Веб оф Сциенце, Сцопус и СциФиндер, само око 15 процената описаних врста Аннонацеае има било какву одговарајућу фитокемијску и/или фармаколошку студију.

Међу мало проученим врстама су оне које припадају роду Дицлинанона Диелс. Овај род припада племену Аннонеае, из потфамилије Анноноидеае, и јавља се само у тропској Јужној Америци (углавном у региону Амазона). То је род који се састоји од само три врсте, Дицлинанона цалицина(Диелс)РЕ Фриес Дицлинанона матогроссенсис Маас и Дицлинанона тессманнии Диелс, које се јављају као дрвеће [22-24].Д.цалицина (синоним Ксулопиа цалицина Диелс) је 8. Дрво високо 30 м, популарно познато као "енвиреира" и "енвиро", распрострањено широм Амазонског басена у Бразилу, Перуу и Венецуели [23]. Д.цалицина је површно слична Ксилопиа по цветовима са издуженим и уским латицама, али је другачија по својим дрвенастим, неиспадљивим, лоптастим и дебелозидним монокарпом [23,24].

Претходне студије са Д. цалицина пријављују само фармаколошке студије. Прва студија описује испитивање антимикробне активности метанолних, хлороформских и водених екстраката против микроорганизама Мицобацтериум смегматис, Есцхерицхиа цоли, Стрептоцоццус сангуис, Стрептоцоццус оралис, Стапхилоцоццус ауреус и Цандидагел албицанс методом [2-5]. У другом је приказано испитивање антимикробне активности органских (дихлорометан: метанол 1:1) и водених екстраката против микроорганизма Ентероцоццус фаецалис коришћењем микродилуционог теста бујона (МДБА) и теста дифузије на диску (ДДА)[26]. Дакле, у нашој континуираној потрази за новим биоактивним природним производима из Аннонацеае из амазонске прашуме, ова студија је имала за циљ да истражи фитокемијске и фармаколошке особине коре Д.цалицина. У овом извештају, тринаест једињења (девет алкалоида и четири бензилиранадихидрофлавони) су изоловани и идентификовани по први пут у Д.цалицина, као иу роду Дицлинанона. Поред тога, испитивана је цитотоксичност главних једињења против Б16-Ф10, ХепГ2, К562 и ХЛ{{ 4}} туморске ћелијске линије користећи Аламар блуе тест.

2. Резултати и дискусија

2.1. Разјашњавање структуре једињења

Након што је откривено присуство једињења која садрже азот у метанолном екстракту коришћењем Драгендорфовог реагенса, он је подвргнут кисело-базном третману према методологији Цоста ет ал. [12] што резултира алкалоидним и неутралним фракцијама. У алкалоидној фракцији која је подвргнута хроматографској анализи уочена је висока концентрација једињења која садрже азот. Узастопно хроматографско раздвајање, како је описано у одељку Екстракција и изолација, довело је до изолације и идентификације тринаест хемијских састојака (1-13, слика 1), девет алкалоида добијених изохинолина 1-9 и четири бензилирана дихидрофлавона 10-13. Структуре ових изолованих једињења (Слика 1) су утврђене опсежном анализом коришћењем 1Д и 2Д НМР спектроскопије у комбинацији са МС (додатни подаци), као и поређењем са подацима из литературе.

Једињење 5 је добијено као браон аморфни прах и позитивно је тестирано на Драгендорфов реагенс. Показао је протонирани молекул на м/з328 [М плус Х]' у ЛР-ЕСИ( плус )МС-компатибилан са молекулском формулом Ц18Х1НО5. 'Х и 13Ц-НМР спектри 5 (Табела 1) били су конзистентни са онима ретикулина (4)[27, осим одсуства метил групе везане за азот (ЦХ3-Н) и сигнала метинску групу на позицији 1, која је замењена сигналом на δц 165.1 у типичном 13Ц-НМР спектру имин групе коњуговане са карбонил групом на бц 192.8. У 'Х-НМР спектру, три водоника у доњем пољу на δХ 6,88 (1Х,д, Ј=8.4 Хз, Х-5'), 5Х7,57 (1Х,д, Ј{{33} }.0Хз, Х-2'）и δХ 7.60(1Х, дд, Ј=8.4 и 2.0 Хз, Х-6') , открио је присуство АБКС система спојнице. Два синглетна сигнала на 6Х 6.90(1Х,с, Х-8) и 6.71(1Х, с, Х-5) указују на присуство 1,2,4,5-тетрасупституисаног фенил прстена. Поред тога, Х-НМР спектар 5 је такође показао сигнале за две метокси групе које резонују на бХ 3,93 (3Х, с) и 6Х 3,95 (3Х,с) и сигнале за две метиленске групе које резонују на δμ 2,79 (2Х,т, Ј=7.8 Хз） и 6Х 3.89(2Х,т,/=7.8 Хз), приписано Х-4 и Х-3, респективно (Табела 1) . Ови подаци показују да алкалоид 5 има бензилтетрахидроизохинолински скелет [28-30].

Ове групе су успостављене на основу 'Х-13 корелационе карте са две и три везе из ХМБЦ-НМР експеримента (слика 2 и табела 1). Ова анализа је открила да је водоник на δХ 3,89 (Х-3) показао тропојасну 'Х-13Ц корелацију са угљеницима на 6ц130.1(4а) и δц165.{101} {42}}(Ц-1) и двовезна лХ-13Ц корелација са угљеником на δц 25,4(Ц-4), што потврђује присуство имин групе у молекулу. С друге стране, сигнали на δХ 7,57 (Х-2') и δХ 7,60 (Х-6') показали су тровезну лХ-13Ц корелацију са угљеницима на δц 124,3（ Ц-6'）,5ц 151,4（Ц-4'）и δц192.8(Ц-7), и 5ц116.0(Ц-2'),6ц 151.4 (Ц-4')и ц 192,8(Ц-7'), респективно, успостављајући карбонилну групу у молекулу (слика 2 и табела 1). Стога, на основу ових НМР података, једињење 5

установљен је као бензилтетрахидроизохинолин алкалоид 34-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон, који је назван као дехидро-оксонорретикулин. Овај алкалоид је први пут у литератури описан као природни производ. Његов први и једини запис описали су Дорниеи ет ал. 1982. 【31】као производ синтетичког порекла. Само су 'Х-НМР подаци описани са неким неодређеним вишеструким бројем. Дакле, комплетни задаци за све 1Х- и 13Ц-НМР хемијске помаке су успостављени експериментима корелације са једном везом (ХСОЦ) и две и три везе (ХМБЦ)' Х-13Ц-НМР, а описани су у Табела 1.

Једињења 6 и 7 су идентификовани као бензилтетрахидроизохинолински алкалоиди ( плус )-1С,2Р-ретикулин-Н-оксид, односно (плус )-1С,2С-ретикулин-Н-оксид. Х-НМР подаци ових алкалоида су упоређени са подацима које су описали Лее ет ал. [28] коришћењем истог деутерованог растварача (ЦД3ОД) и уочене су неке недоследности (Табела 1), углавном у вези са Х-1, Х-8 и Х, Ц-НО. Нема 13Ц-НМР података описаних за ове алкалоиде у литератури. На основу ограничених 1Х- и 13Ц-НМР података, као и нејасноћа уочених за ове молекуле, 'Х и 13Ц 1Д и 2Д НМР експерименти су изведени да би се утврдила њихова тачна додела и вишеструкост.

Тачан положај водоника Х{0}} и Х-1 оба изомера 6 и 7 је утврђен на основу корелационе мапе са три везе 'Х-13Ц из ХМБЦ-а -НМР експеримент (слика 2). За изомер 6 анализа је открила да је водоник на δХ 5,78 (Х-8) показао тровезну 'Х-13Ц корелацију са угљеницима на 6ц 79,8 (Ц-1), δц120 .6(4а) и δц 149.4 (Ц-6), док је водоник на δХ 4,13 (Х-1) показао тровезну 'Х-13Ц корелацију са угљеницима на ц 60,7 (Ц-3), 6ц 115,7 (Ц-8), δц 120,6 (Ц-4а) и 131,2 (Ц-1}), чиме се успоставља тачне позиције водоника Х-8 и Х-1 за изомер 6. Ова атрибуција се даље може потврдити анализом водоника на δХ 6,76 (Х-5) која је показала троструку везу Х-13Ц корелација са угљеницима на δц 27.0 (Ц-4), δц 127.1 (Ц-8а) и δц 145.7 (Ц-7) (Слика 2). За изомер 7, анализа је открила да је водоник на δХ 6,30 (Х-8) показао тровезну 'Х-13корелацију са угљеницима на δц 79,4 (Ц-1）, δц 122,8) 4а) и δц 148,9 (Ц-6), док је водоник на δХ 4,46 (Х-1) показао корелацију са три везе Х-13Ц са угљеницима на δц 62,9 (Ц {82}}）,5ц 115.5(Ц-8), бц 122.8(Ц-4а) и 131.4(Ц-1'), чиме се успостављају тачни положаји водоника Х -8 и Х-1 за изомер 7. Ова атрибуција је такође потврђена анализом водоника на δХ 6,71 (Х-5) која је показала тровезну лХ-13Ц корелације са угљеницима на δц26.3(Ц-4), δц 126.9(Ц-8а) и 6ц 146.1(Ц-7) (Слика 2). Експеримент НОЕСИ је такође спроведен да би се установила тачна стереохемија изомера6 и 7. У овом експерименту, јака НОЕ корелација Х-1(δХ 4.13) и Х, ЦН(5 3.15) указује на -оријентација кисеоника у изомеру 6. С друге стране, никаква очигледна НОЕ корелација између Х-1(6Х 4.46) и ХАЦ-Н(5Х 3.20) није се могла наћи у 2Д-НОЕСИ експерименту за 7, што указује на -оријентацију кисеоника у изомеру 7 (Слика 2). Ове мале разлике у хемијским померањима ових изомера јасно су уочене због стереохемије азота на које утичу и положаји кисеоника. Поређења 'Х- и 13Ц-НМР података добијених за једињења 6 и 7 са подацима о молекулима са блиским структурама као што су хексапеталин А и хексапеталин Б [30] подржавају податке описане у табели 1 без двосмислености.

Једињења 1-4 и 8-13 су идентификована као талифолин (1) [32], анонаин (2) [33]лириоденин (3)[10,34], (С)-( плус )-ретикулин ( 4)[27], корексимин (8) [34,35], биснораргемонин (9)[36], изохаманетин (10) [37], дихаманетин (11) [37] и мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13) [37] на основу њихових спектроскопских профила и поређења са вредностима у литератури. лХ- и 13Ц 1Д и 2Д-НМР спектри, као и масени спектри свих изолованих једињења, доступни су као додатни материјали.

Са хемофенетичког (нови термин за биљну хемосистематику/хемотаксономију биљака) тачке гледишта, важно је напоменути да су присуство Ц-бензилираних флаванона и Ц-бензилираних дихидрохалкона посебна врста флавоноида који су изведени из добро познатог флаванон пиноцембрина. а посебно су описани код врста из рода Уоариа који припадају породици Аннонацеае [3,38-42]. Присуство ових једињења у Д. цалицина указује на блиску хемофенетску везу са Уоариом. С друге стране, треба спровести даља истраживања са другим деловима биљке, као и другим врстама Дицлинанона да би се потврдила ова хемофенетска веза. Флаванони и халкони су широко распрострањени у вишим биљкама, али додавање бензил група је прилично ретко и изгледа да је ограничено у Аннонацеае на род Уоариа [3,39-42], а сада на род Дицлинанона. Бензил групе вероватно потичу из Ц6-Ц1 пута, али о-хидрокси функционалност је необична. Одсуство супституената у Б-прстену у свим овим флавоноидима Уоариа и Дицлинанона може се повезати са претходним запажањем у вези са флавоноидима Поповиа цаулифлора [38].

Алкалоиди добијени из изохинолина изоловани и описани у овом раду већ су регистровани у неколико врста Аннонацеае у различитим родовима. Неки од њих, као што су лириоденин и анонаин, сматрају се хемофенетским маркерима, а присуство ових алкалоида у Д.цалицина додатно појачава однос ових хемофенетских маркера у породици Аннонацеае [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Вреди напоменути да су, према Зидорну [44], хемофенетске студије дефинисане као студије које имају за циљ да опишу низ специјализованих секундарних метаболита у датом таксону, као што је већ примећено у неколико објављених радова [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Дакле, хемофенетске студије доприносе фенетском опису таксона, слично анатомским, морфолошким и кариолошким приступима, који су већ препознати као од великог значаја за успостављање „природних“ система, а који су и даље од изузетног значаја за опис класификованих организама уз помоћ савремених молекуларних метода [44].

2.2. Цитотокиц Ассаи

Ин витро цитотоксична активност изолованих једињења (Табела 2), осим једињења 2, 3, 5 и 8 (због њиховог ниског приноса), процењена је у односу наћелија ракалиније ХЛ-60 (хумана промијелоцитна леукемија), МЦФ-7(аденокарцином дојке код људи), ХепГ2(хумани хепатоцелуларни карцином), ХЦТ116 (карцином дебелог црева код људи) и неканцерозне ћелијске линије МРЦ{{5} } (фибробласт људских плућа) коришћењем Аламар блуе теста након 72 х инкубације.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 уг.мЛ-1). Дицхаманетин (11) је показао цитотоксичну активност против ХЛ-60 и ХЦТ116 са ИЦ50 вредностима од 15,78 уг·мЛ-1(33,70 μмол·Л-1) и 18,99 уг·мЛ-1(40,56 умол.Л-1) респективно. Мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13) показала је цитотоксичну активност против ХЛ-60, са вредношћу ИЦс0 од 9,74уг∶мЛ-1, и ХЦТ116, са вредношћу ИЦс0 од 17,31 уг∶мЛ{ {30}}. Међу бензилираним дихидрофлавонима, само је изорхамнетин (10) показао цитотоксичну активност против ХепГ2 са ИЦ50 вредношћу од 19,79 угс:мЛ-1(54,65 умол.Л-1). Према литератури, бензиловани дихидрофлавони су описани са цитотоксичним својствима [39-42]. Међу онима описаним у овом раду, изорхамнетин (10), дихамнетин (11) и уваринол (12) су описани у оквиру витро цитотоксичних својстава против хуманих туморских ћелијских линија карцинома назофаринкса (КБ) и П-388 лимфоцитне леукемије (ПС) са ИЦ50 вредностима од 5,3 и 4,1, 4,8 и 1,8 и 5,9 и 9,7, уг.мЛ-1, респективно [39,40]. Ове различите активности се могу приписати присуству једне или више хидрокси бензил група присутних у молекулима, као и позицији у којој су ове групе повезане. Међутим, потребно је даље истраживање да би се потврдило ово запажање.

Ин витро цитотоксичну активност алкалоида добијених изохинолина анонаина (2), лири-аденина (3) и (С)-( плус )-ретикулина (4) недавно су описали Менезес и сарадници.[2{{16] }}], Соуза ет ал. [6] и Цоста ет ал. [43] са нагласком на лириоденин, који је показао снажну цитотоксичну активност против ћелијских линија рака Б{{10}}Ф10 (мишји меланом), ХепГ2 (хумани хепатоцелуларни карцином), ХЛ{{13 }} (хумана промијелоцитна леукемија) и К562 (хумана хронична мијелоцитна леукемија) са вредностима ИЦ5с0 испод 10,0 μмол.Л-1【43】. Анонаин је показао умерену активност против Б16-Г2,ХЛ60 и К562 са вредностима ИЦ50 ниским од 19,0 умол.Л-1[20]. (С)-(плус )-Ретикулин је показао умерену активност само против ХепГ2 са вредностима ИЦ50 од 15,35 μмол Л-1【 6,20】.

3. Материјали и методе

3.1. Опште експерименталне процедуре

Оптичке ротације у метанолу (МеОХ) су забележене помоћу полариметра П{{0}} (Јасцо, Токио, Јапан) на 589 нм. 1Д и 2Д НМР експерименти су добијени у ЦДЦл. (хлороформ-д) или ЦДЦл плус кап ЦД, ОД (метанол-ду и ЦД, ЦОЦД3(ацетон-д6) на 298 К на АВАНЦЕ И ХД НМР спектрометру (Брукер, Биллерица, МА, САД) који ради на 11,75 Т (Рука 13Ц на 500 и 125 МХз, респективно) и на Брукер АВАНЦЕ И 600 НМР спектрометру који ради на 14,1 Т('Х и 13Цат 60{ {63}} и 150 МХз респективно). Сви лХ- и 13Ц-НМР хемијски помаци （δ） су представљени у ппм у односу на сигнал тетраметилсилана на 0.00 ппм као интерна референца, и константе спајања (Д) су дате у Хз. НМР спектрометар је био опремљен са 5-мм мултинуклеарном инверзном детекционом сондом (1Д и 2Д НМР експерименти) са з-градијентом. Једна веза (ХСКЦ) и два и Експерименти корелације са три везе (ХМБЦ)1Х-13Ц-НМР су оптимизовани за просечну константу спајања' ЈцХ и ЛРЈ(цХ од 140 и 8 Хз, респективно. За анализу масене спектрометрије ниске резолуције (ЛЦ-МС) узорци изолованих једињења су ресуспендовани у метанолу (ХПЛЦ квалитета), стварајући сто к раствора (1 мг·мЛ-1). Аликвоти (5 уЛ) основних раствора су даље разблажени до 5 уг·мЛ и анализирани директном инфузијом у троструки квадруполни масени спектрометар, модел ТСО Куантум Аццесс (Тхермо Сциентифиц, Сан Јосе, Калифорнија, САД), опремљен електроспреј јонизацијом (ЕСИ) или извори хемијске јонизације атмосферског притиска (АПЦИ). ЕСИ-МС услови: напон распршивања, 5кВ; плашт гас, 10 произвољна јединица (арб); помоћни гас, 5арб;свееп гас,0арб;температура капилара, 250 степени; капиларни напон, 40 В; цевно сочиво, 70 В; опсег масе, м/з 100 до 1000. Услови АПЦИ-МС: струја пражњења, 5 μА; температура испаривача, 350 степени; притисак гаса у омотачу,25 произвољна јединица （арб）; притисак гаса за чишћење јона,0,0 арб; притисак помоћног гаса, 10 арб; температура капилара, 250 степени Ц; оффсет цевног сочива,70 В; скимер оффсет,0 В; опсег масе,м/з 100 до 1000. Аргон је коришћен као колизиони гас, а МС/МС спектри су добијени коришћењем енергија судара у распону од 25 до 30 еВ. За колонску хроматографију (ЦЦ) коришћен је силика гел60 (Сигма-Алдрицх, Сан Луис, МО, САД, 70-230 месх), док је силика гел 60 Ф254 (Мацхереи-Нагел, Дирен, Немачка, 0,25 мм, алуминијум) је коришћен за аналитичку и препаративну хроматографију танке лавере (ПТЛЦ) (Мацхереи-Нагел, 1,00 мм, стакло). Једињења су визуелизована излагањем под УВ254/365 светлошћу, прскањем са п-анисалдехидним реагенсом, праћеним загревањем на врућој плочи и прскањем Драгендорфовог реагенса.

3.2. Биљни материјал

У овом истраживању, ботанички материјал (кора) Д.цалицина сакупљен је 27. маја 2017. у резервату Адолпхо Дуцке (географске координате: 02 степен 53'36.1С и 59 степен 58'28.9"В), Манаус, држава Амазонас , Бразил, а идентификовао га је проф. др Антонио Карлос Вебер, таксономиста биљака на Одсеку за биологију Универсидаде Федерал до Амазонас (ДБ/УФАМ). Узорак ваучера број 10,810 депонован је у Хербаријуму ДБ/УФАМ. приступ (пример) је регистрован у Система Национал де Гестао до Патримонио Генетицо е до Цонхецименто Традиционал Ассоциадо (СИСГЕН) са записом А70ЕДЦД.

3.3. Екстракција и изолација

Кора Д.цалицина је првобитно сушена на собној температури 24 х, а затим сушена у пећи са циркулацијом ваздуха 48 х на температури од 40 степени, а затим уситњена у млину са четири ножа (Марцони, Пирацицаба, СП , Бразил) за добијање прашкастог материјала (1340 г). Затим је извршена исцрпна мацерација са хексаном (8 × 4 Л), а затим МеОХ (8 × 4 Л). Добијени екстрактивни раствори су концентровани у ротационом испаривачу на сниженом притиску (40-50 степен) да би се добили екстракти хексана (24,85 г) и МеОХ (199,43 г), респективно.

ТЛЦ анализа откривена са Драгендорффовим реагенсом указала је на високо присуство алкалоида у МеОХ екстракту. Стога је аликвот МеОХ екстракта (188,30 г) првобитно подвргнут кисело-базној екстракцији да би се добиле алкалоидне (5,46 г) и неутралне (4,47 г) фракције. Након тога, део алкалоидне фракције (50г) је подвргнут хроматографској колони силика гела (ЦЦ) претходно третираној са 10% раствором НаХЦО3 [12], елуирано хексаном (100%), хексаном-ЦХЦл, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,в/о), ЦХ2Цл2 (100 посто), ЦХ2Цл 2-ЕтОАц(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,0/у), ЕтОАц (100 посто), ЕтОАц-МеОХ(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 и 10:90, в/о), и на крају МеОХ дајући 250 фракција (30 мЛ свака). Након ТЛЦ процене коришћењем смеше ЦХ2Цл2-МеОХ у пропорцијама 95:05, 90:10, 85:15 и 80:20 као систем за елуирање (в/о), слични узорци су спојени да би се добило 16 фракција (Ф1 до Ф16).

Фракција Ф5 (181,2 мг) из почетног ЦЦ елуирана хексаном-ЦХ,Цл2 (50:50 до 10:90, в/о) је подвргнута новом силика гелу ЦЦ, користећи исту методологију изнад, елуирана хексаном (100 процената), хексаном -ЦХ,Цл2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,в/о), ЦХ,Цл ,(100 процената), ЦХЦл2-ЕтОАц(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90 ,о/), ЕтОАц (100 процената), ЕтОАц-МеОХ (85:15,70:30,50:50, 30:70 и 15:85, /о), и МеОХ (100 процената) дајући 118 фракција ( по 15 мЛ) које су обједињене у 12 подфракција (Ф5.1 до Ф5.12), према процени ТЛЦ анализе коришћењем смеше ЦХ2Цл2-МеОХ у пропорцијама 95:05 и 90:10. Субфракција Ф5 .1 (28,9 мг) елуиран хексаном (100 процената) је подвргнут препаративној ТЛЦ, целуиран са ЦХ,Цл-МеОХ (95:05, в/в, два елуирања) дајући 2 (1,4 мг) и 3 (1,7 мг), редом. Субфракције Ф5.4 (21.5 мг) елуиране хексаном-ЦХ,Ц(80:20,во), Ф5.5 (16.7 мг)елуиране хексаном-ЦХ,Цл(80:20.70:30.60;40. и 50:50 ,в/), и Ф5.6 (15.4 мг) елуиран са хексаном-ЦХЦл2 (50:50,40:60 и 30:70, в/о) су обједињени (53,6 мг) и такође подвргнути препаративној ТЛЦ елуцији са ЦХ,Цл-МеОХ (95:05, в/у, два елуирања) дајући 3 (8,9 мг).

Фракција Ф6(2099,1 мг) из почетног ЦЦ елуираног са хексаном-ЦХЦл(10:90,в/)), ЦХ2Цл, (100 проценат ), а ЦХ,Цл2-ЕтОАц (90:10 до 10:90, о/о) је подвргнут новом силика гелу ЦЦ користећи исту методологију изнад, елуиран са истим системима растварача који дају 140 фракција (30 мЛ сваки). Након ТЛЦ процене коришћењем смеше ЦХ2Цл2-МеОХ у пропорцијама 95:05, 90:10 и 85:15 као елуентног система (о/о), слични узорци су спојени да би се добило 13 субфракција (Ф6 .1 до Ф6.13). Субфракција Ф6.6 (1541,3 мг) је подвргнута новом силика гелу ЦЦ користећи исту методологију изнад, елуиран са истим системима растварача дајући 120 фракција (30 мЛ свака) које су анализиране ТЛЦ (користећи исту методологију изнад) дајући 12 нових подфракције (Ф6.6.1 до Ф6.6.12). Подфракција Ф6.6.2 (17,0 мг) елуирана са хексаном-ЦХ,Цл, (60:40 и 50:50, в/в) је подвргнута препаративној ТЛЦ Целуирано са ЦХ2Цл2-МеОХ (90:10, в/о, једно елуирање) дајући 3 (1,4 мг). Субфракција Ф6.6.3 (643,3 мг) елуирана са хексаном-ЦХ2Цл2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, о/в), ЦХ2Цл2 (100 процената) и ЦХ2Цл2-ЕтОАц(90:10 и 80:20,о/о) је подвргнут препаративној ТЛЦ-целуцији са ЦХ2Цл2-МеОХ (90 :10, вфо, једно елуирање) дајући нову субфракцију Ф6.6.3.1 (161,8 мг) која је подвргнута новом препаративном ТЛЦ елуираном са ЕтОАц-МеОХ (90:10, в/о, једно елуирање) дајући 4 (148,2) мг).Субфракција Ф6.6.4 (90,2 мг) елуирана са ЦХ2Цл2-ЕтОАц (70:30 и 60:40,о/о) је подвргнута припремној ТЛЦ, елуирана са ЦХ2Цл-МеОХ (90:10, в/о, једно елуирање) дајући 1 (1,4 мг) и 4 (50,1 мг), респективно. Субфракција Ф6.6.5 (83,4 мг) елуирана са ЦХ,Цл-ЕтОАц (60:40 и 50:50, о/о) је такође подвргнута препаративној ТЛЦцелуцији са ЦХ,Цл2-МеОХ (90:10, уфо, једно елуирање) дајући поново 1 (1,5 мг) и 4 (45,5 мг), респективно. Субфракција Ф6.6.6 (101,4 мг) елуирана са ЦХ,Цл2-ЕтОАц (50:50 и 40:60, в/)) је подвргнута препаративној ТЛЦ елуираном са ЦХ,Цл-МеОХ (90: 10, вфо, једно елуирање) дајући 8 (3,4 мг) и другу подфракцију Ф6.6.6.1 (48,8 мг). Ова подфракција (Ф6.6.6.1) је подвргнута препаративној ТЛЦ, првобитно јелуирана са ЕтОАц-МеОХ (85 :15, во, једно елуирање) и постериорно ЦХЦл-МеОХ (90:10, в/в, једно елуирање) што је поново резултирало 4 (37,4 мг). За овај поступак, хроматографска плоча је иницијално елуирана са мобилном фазом ЕтОАц-МеОХ (85:15, в/о, једно елуирање). Након овог елуирања, хроматографска плоча је осушена да би се поново уклонио растварач и потом подвргнута новом елуирању са мобилном фазом ЦХ,Цл,-МеОХ (90:10,вф, једно елуирање) дајући 4.Субфракција Ф6.6.7 ( 109,0 мг) елуирано са ЦХ,Цл2-ЕтОАц(40:60,30:70,20:80 и 10:90,вфо) је подвргнуто препаративној ТЛЦ елуирано са ЦХ,Цл2-МеОХ (90:10,во, једно елуирање) дајући другу субфракцију Ф6.6.7.1 (24,8 мг) која је подвргнута новој препаративној ТЛЦ елуираној у почетку са ЕтОАц-МеОХ (85:15, в/о, једно елуирање) и накнадно ЦХ2Цл2-МеОХ (90:10, вфо, једно елуирање) што резултира 9 (11,1 мг). Процедура изолације коришћена за 9 је била иста као што је претходно описано за 4. Субфракција Ф6.6.10 (92,0 мг) елуирана са ЕтОАц-МеОХ (60:40 и 50:50, в/о) је подвргнута препаративној ТЛЦ, целуирана са ЦХ, Цл,-МеОХ (90:10, в/о, једно елуирање) дајући 5 (1,7 мг) и 6 (7,8 мг), респективно. Субфракција Ф6.6.11 (326,0 мг) елуирана са ЕтОАц-МеОХ (50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,в/о) је подвргнута препаративној ТЛЦ, елуираном са ЦХЦл- МеОХ (90:10, в/о, једно елуирање) са 1 (2,4 мг) и 7 (12,5 мг), респективно.

Фракција Ф7 (692,4 мг) из почетног ЦЦелутира са ЕтОАц (100 процената) и ЦХЦл2-ЕтОАц (95:05,90:10,85:15 и 75:25,офо) је подвргнута новом силика гелу ЦЦ Користећи исту методологију као што је описано за почетни ЦЦ са истим системима растварача који дају 110 фракција (по 30 мЛ). Након ТЛЦ процене коришћењем смеше ЦХ2Цл2-МеОХ у пропорцијама 95:05, 90:10 и 85 :15 као елуентни систем (о/о), слични узорци су спојени да би се добило 12 субфракција (Ф7.1 до Ф7.12).Ф7.8 (147,4 мг) елуираних са ЦХ,Цл2- ЕтОАц (50:50,40:60 и 30:70,в/о процената) је подвргнут препаративној ТЛЦ елуиран са ЦХЦл-МеОХ (95:05, вфо, једно елуирање) дајући 10 (5,4 мг) и 11( 120,6 мг), респективно. Ф7.9 (144,2 мг) елуиран са ЦХЦл2-ЕтОАц (30:70, 20:80 и 10:90, в/о процената) је такође подвргнут препаративној ТЛЦелуцији са ЦХ,Цл,-МеОХ( 95:05,во, једно елуирање) дајући 11 (91,2 мг) и смешу 12 и 13 (39,4 мг), респективно.

Талифолин (1): Смеђи аморфни прах;' Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [32]; ЛР-ЕСИ( плус )-МС [М плус Х]* плус м/з 208.

Анонаине (2): Смеђи аморфни прах; 1Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [33]; ЛР-ЕСИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 266.

Лириоденин (3): Жути кристали (ЦХ,Цл-МеОХ 3:1); 1Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [10,34]; ЛР-ЕСИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 276.

(С)-( плус )-Ретикулин(4): Смеђи аморфни прах; [ ]п25 плус 71,60(ц 0,05 г/100 мЛ, МеОХ); 1Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [27;ЛР-ЕСИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 30.

3,4-Дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон (Дехидро-оксонорретикулин)(5 ): Смеђи аморфни прах; 'Х и 13Ц-НМР подаци, видети табелу 1; ЛР-ЕСИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 328.

( плус ){{0}}С,2Р-ретикулин Н-оксид(6): Смеђи аморфни прах; [лп25 плус 136,4 (ц0,146 г/100 мЛ, МеОХ); 1Ханд 13Ц-НМР подаци, видети табелу 1; ЛР-АПЦИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/2346

( плус ){{0}}С,2С-ретикулин Н.-оксид (7): Смеђи аморфни прах; [ ]п25 плус 394,5 (ц 0,03 г/100 мЛ, МеОХ);'Х и 13Ц-НМР подаци, видети табелу 1; ЛР-АПЦИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з346.

Корексимин (8): светло жути аморфни прах;[ ]п25 плус 201.1(ц 0,08г/100мЛ, МеОХ)'Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом[34,35];ЛР- ЕСИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 328.

Биснораргемонин (9): Смеђи аморфни прах; 1Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [36]; ЛР-АПЦИ( плус )-МС [М плус Х] плус м/з 328.

Исоцхаманетин (10): Светло жути аморфни прах; [п25-12.4(ц 0,5 г/100 мЛ, МеОХ)'Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом[37;ЛР-АПЦИ(-)-МС [МХ]-м/з361.

Дицхаманетин (11): Жути аморфни прах;[ ]Д25-10.7(ц 0.5г/100 мЛ, МеОХ); 1Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [37]; ЛР-ЕСИ(-)-МС [МХ]-м/з467.

Мешавина уваринола(12) и изоуваринола(13): Жути аморфни прах; Х-НМР и 13Ц-НМР у складу са литературом [37]; ЛР-ЕСИ(-)-МС [МХ]- м/з 573.

3.4. Ин витро цитотоксични тест

3.4.1.Ћелије

ХЛ-60 (хумана промијелоцитна леукемија), МЦФ-7 (аденокарцином дојке код људи), ХепГ2 (хумани хепатоцелуларни карцином), ХЦТ116 (карцином дебелог црева човека) и МРЦ-5 (људски фибробласт плућа) ћелијске линије су добијене из Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ, Манассас, ВА, УСА) и култивисане су према препоруци АТЦЦ водича за културу животињских ћелија. Све ћелијске линије су тестиране на микоплазму коришћењем комплета за бојење микоплазме (Сигма-Алдрицх) да би се потврдила употреба ћелија без контаминације.

3.4.2. Цитотокицити Ассаи

За тест цитотоксичности, виталност ћелија је квантификована методом Аламар блуе, као што је претходно описано [{{0}}]. За све експерименте, ћелије су постављене у 96-плоче са бунарима. Хемијски састојци су растворени у диметил сулфоксиду (ДМСО, Ветец Оуимица Фина Лтда., Дукуе де Цакиас, РЈ, Бразил) и додати у сваки бунар и инкубирани 72 х. Доксорубицин (доксорубицин хидрохлорид, чистоћа већа или једнака 95 процената, Лабораторија ИМА САИЦ, Буенос Аирес, Аргентина) је коришћен као позитивна контрола. На крају третмана, 20 μЛ основног раствора (0,312 мг/мЛ) ресазурина (Сигма-Алдрицх Цо.) је додат у сваки бунар. Апсорбанције на 570 нм и 600 нм су мерене коришћењем СпецтраМак190 Мицроплате Реадер-а (Молецулар Девицес, Суннивале, Калифорнија, САД). Полуинхибициона концентрација (ИЦ50) је добијена нелинеарном регресијом са интервалима поверења од 95 процената (ЦИ95 процената) користећи софтвер ГрапхПад Присм (Интуитивни софтвер за науку; Сан Дијего, Калифорнија, САД).

4. Закључци

Фитокемијско испитивање коре Д.цалицина довело је до изолације и идентификације тринаест једињења (1-13); девет алкалоида добијених изохинолина (1-9) и четирифлавоноиди(10-13). Алкалоиди припадају следећим подкласама: прости изохинолин, тали онлине (1); апорфин, анонаин (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензил-тетрахидроизохинолини, ( плус )-ретикулин(4), де хидро-оксонорретикулин(3,4-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)({{13} }хидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5), 1С,2Р-ретикулин Нг-оксид(6) и 1С,2С-ретикулин Н.-оксид (7); тетрахидро протоберберин, корексимин (8); и павин, биснораргемонин (9). Док флавоноиди припадају бензилираним дихидрофлавонима, изорхамнетин (10), дихаманетин (11) и мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13). Изолована једињења су први пут описана у Д.цалицина као иу роду Дицлинанона.

Цитотоксична активност изолованих једињења (осим анонаина, лириоденина, 1,2-дихидро-оксоноретикулина и корексимина) је процењена против рака (ХЛ-60, МЦФ-7, ХепГ2 и ХЦТ116) и неканцерозне (МРЦ-5) ​​ћелијске линије. Међу њима, резултати који највише обећавају уочени су за бензилиране дихидрофлавоне дихаманетин (10), и

мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13) која је показала умерену цитотоксичну активност против тестираних ћелијских линија рака (<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 уг·мЛ-'). Дицхаманетин (11) је показао цитотоксичну активност против ХЛ-60 и ХЦТ116 са ИЦ50 вредностима од 15,78уг·мЛ-1 (33,70 μмол-Л-1}) и 18,99 уг·мЛ-И5 (40мол). .Л-1）, док је мешавина уваринола (12) и изоуваринола (13) показала цитотоксичну активност против ХЛ-60, са ИЦ50 вредношћу од 9,74 уг∶мЛ-И, и ХЦТ116, са ИЦ50 вредност од 17,31 уг·мЛ-1. Ови резултати на ћелијским линијама тумора су такође по први пут описани за бензилиране дихидрофлавоне. Претходно су утврђене цитотоксичне активности ретикулина, анонаина и лириоденина, у којима је лириоденин најмоћније једињење.

Резултати добијени у овом раду указују на то да су врсте породице Аннонацеае перспективан извор биолошки активних једињења са цитотоксичним својствима и сугеришу наставак њиховог истраживања у другим моделима биолошких тестова.

Референце

1. Цоувреур, ТЛП; Пирие, МД; Цхатроу, ЛВ; Саундерс, РМК; Су, ИЦФ; Рицхардсон, ЈЕ; Еркенс, РХЈ Рана еволуциона историја породице цветних биљака Аннонацеае: Стална диверзификација и бореотропска геодисперзија. Ј. Биогеогр. 2011, 38, 664–680. [ЦроссРеф]

2. Цорреа, МП Диционарио дас Плантас Утеис до Брасил е дас Екотицас Цултивадас; ИБДФ Министерио да Агрицултура: Рио де Жанеиро, Бразил, 1984.

3. Лебоеуф, М.; Цаве, А.; Бхаумик, ПК; Мукхерјее, Б.; Мукхерјее, Р. Тхе пхитоцхемистри оф тхе Аннонацеае. Пхитоцхемистри 1982, 21, 2783–2813. [ЦроссРеф]

4. Руппрецхт, ЈК; Хуи, И.-Х.; МцЛаугхлин, ЈЛ Аннонацеоус ацетогенинс: Преглед. Ј. Нат. Прод. 1990, 53, 237–278. [ЦроссРеф]

5. Луцио, АССЦ; Алмеида, ЈРГДС; Да-Цунха, ЕВЛ; Таварес, ЈФ; Филхо, ЈМБ Алкалоиди Аннонацеае: Појава и компилација њихових биолошких активности. У Алкалоидима; Кнолкер, Х.-Ј., Ед.; Елсевиер: Амстердам, Холандија, 2015; Поглавље 5; Том 74, стр. 233–409. [ЦроссРеф]

6. Соуза, ЦАС; Нардели, ВБ; Паз, ВХП; Пинхеиро, МЛБ; Родригуес, АЦБЦ; Бомфифим, ЛМ; Соарес, МБП; Безерра, ДП; Чаар, ЈС; Коолен, ХХФ; ет ал. Фенилпропаноиди добијени из азарона и алкалоиди изведени из изохинолина из коре Дугуетиа пицнастера (Аннонацеае) и њихова цитотоксичност. Куим. Нова 2020, 43, 1397–1403. [ЦроссРеф]

7. Араујо, МС; Силва, ФМА; Коолен, ХХФ; Цоста, ЕВ Алкалоиди добијени изохинолином из коре Гуаттериа оливацеа (Аннонацеае). Биоцхем. Сист. Ецол. 2020, 92, 104105. [ЦроссРеф]

8. Нгоуонпе, АВ; Мбобда, АСВ; Хаппи, ГМ; Мбиантцха, М.; Татуедом, ОК; Али, МС; Латееф, М.; Тцхоуанкеу, ЈЦ; Коуам, СФ Природни производи од лековите биљке Дугуетиа стаудтии (Аннонацеае). Биоцхем. Сист. Ецол. 2019, 83, 22–25. [ЦроссРеф]

9. Сантос, РЦ; Соуза, АВ; Андраде-Силва, М.; Цруз, КЦВ; Кассуиа, ЦАЛ; Цардосо, ЦАЛ; Виеира, МЦ; Формаггио, АСН Антиоксидативно, антиреуматско и антиинфламаторно испитивање екстракта и дицентринона из Дугуетиа фурфурацеа (А. Ст.-Хил.) Бентх. & Хоок. ф. Ј. Етхнопхармацол. 2018, 211, 9–16. [ЦроссРеф]

10. Коста, ЕВ; Пинхеиро, МЛБ; Соуза, АДЛ; Барисон, А.; Цампос, ФР; Валдез, РХ; Уеда-Накамура, Т.; Диас Филхо, БП; Накамура, ЦВ Трипаноцидна активност оксоапорфина и пиримидин{2}}карболинских алкалоида из грана Аннона фоетида Март. (Анонацеае). Молецулес 2011, 16, 9714–9720. [ЦроссРеф]

11. Силва, ДБ; Тулли, ЕКО; Милита, ГЦГ; Коста-Лотуфо, ЛВ; Пессоа, Ц.; Мораес, МО; Албукерки, С.; Сикуеира, ЈМ Антитуморска, трипаноцидна и антилешманијална активност екстракта и алкалоида изолованих из Дугуетиа фурацеа. Фитомедицина 2009, 16, 1059–1063. [ЦроссРеф] [ПубМед]

12. Коста, ЕВ; Пинхеиро, МЛБ; Ксавиер, ЦМ; Силва, ЈРА; Амарал, АЦФ; Соуза, АДЛ; Барисон, А.; Цампос, ФР; Ферреира, АГ; Мацхадо, ГМЦ; ет ал. Пиримидин{1}}карболин и други алкалоиди из Аннона фоетида са антилешманијалном активношћу. Ј. Нат. Прод. 2006, 69, 292–294. [ЦроссРеф]