Флоретин потискује неуроинфламацију активацијом Нрф2 посредованом аутофагијом у макрофагима

Контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Апстрактан

Позадина: Макрофаги играју двоструку улогу у неуроинфламаторним поремећајима као што је мултипла склероза (МС). Они су укључени у настанак и прогресију лезије, али такође могу промовисати разрешењеупалаи поправку оштећеног ткива. У овој студији истражујемо да ли и какофлоретин, флавоноид обилно присутан у јабукама и јагодама, смањује инфламаторни фенотип макрофага и потискујенеуроинфламација.

Методе: Транскрипционе промене у макрофагима добијеним из коштане сржи миша након излагања флоретину процењене су секвенционирањем РНК у маси. Основни путеви повезани са упалом, одговором на оксидативни стрес и аутофагијом потврђени су квантитативним ПЦР, флуоресцентним и тестовима апсорпције, нокаут мишевима везаним за нуклеарни фактор еритроид 2-фактор 2 (Нрф2), вестерн блот и имунофлуоресценцијом. Експериментални модел аутоимуног енцефаломијелитиса (ЕАЕ) је коришћен за проучавање утицаја флоретина на неуроинфламацију ин виво и потврђивање основних механизама.

Резултати: Показали смо да флоретин смањује инфламаторни фенотип макрофага и значајно потискује неуроинфламацију у ЕАЕ. Флоретин посредује свој ефекат активирањем Нр2 сигналног пута. Активација Нрф2 је приписана 5'АМП-активираној протеин кинази (АМПК)-зависној активацији аутофагије и накнадној деградацији протеина 1(Кеап1) повезаног са ЕЦХ-ом сличном келцху.

Закључци: Ова студија отвара будуће перспективе за флоретин као терапијску стратегију за неуроинфламаторне поремећаје као што је МС.

Пробна регистрација: Није применљиво.

Кључне речи: Флоретин, Макрофаги, Неуроинфламација, Мултипла склероза, Аутоимуност

Кликните овде да бисте сазнали више информација

Позадина

Лезије активне мултипле склерозе (МС) карактерише присуство бројнихмакрофаги[1-5]. Ране студије су показале да макрофаги усвајају проинфламаторни фенотип у лезијама МС, чиме се промовишунеуроинфламација, демијелинизација и неуродегенерација. Ефекторске функције које промовишу болест укључују представљање антигена добијених из централног нервног система (ЦНС) аутореактивним Т ћелијама и производњу инфламаторних медијатора као што су проинфламаторни цитокини, реактивне врсте кисеоника (РОС) и азот оксид (НО)[ 6,7]. Недавно је откривено да макрофаги такође имају корисне функције у лезијама МС јер могу преобликовати свој фенотип у онај који је типично повезан са имуносупресијом и поправком ЦНС-а. Овај заштитни фенотип карактерише смањена производња проинфламаторних медијатора, производња антиинфламаторних медијатора и фактора раста, и активација антиоксидативних путева као што је пут еритроидног 2-сродног фактора 2(Нрф2) нуклеарног фактора [8-14]. Пошто је инфламаторни статус макрофага повезан са прогресијом МС и развојем хроничних активних лезија, сматра се да је довођење макрофага у користан фенотип обећавајућа стратегија за ограничавање прогресије МС [15].

Дијететске компоненте покрећу функцију макрофага и неуроинфламацију [16]. Посебно се све више признаје да породица флавоноида садржи обећавајућа једињења која утичу на патогене путеве и модулирају фенотип имуних ћелија као што су макрофаги[17,18]. Флавоноиди чине једну од највећих породица фитонутријената која садржи преко 8000 фенолних једињења са разноликом биоактивношћу. Неколико чланова породице флавоноида показује антиинфламаторне и антиоксидативне ефекте на макрофаге [19-21]. Флавоноид флоретин је члан дихидрохалкона и присутан је у воћу који се обично конзумира као што су јабуке и јагоде. Познато је да флоретин има имуномодулаторна својства и да се широко користи за негу коже због својих антиоксидативних карактеристика [22-24]. Штавише, флоретин је инхибитор транспортера глукозе (ГЛУТ), карактеристика која утиче на фенотип макрофага пошто је активација макрофага подстакнута ГЛУТ-ом [25, 26]. Све у свему, ове карактеристике чине флоретин обећавајућим једињењем за модулацију фенотипа макрофага и неуроинфламације. У овој студији, показали смо да флоретин покреће макрофаге ка мање инфламаторном фенотипу и ублажава неуроинфламацију у експерименталном моделу аутоимуног енцефаломијелитиса (ЕАЕ). Секвенцирање РНК и функционални експерименти идентификовали су пут Нрф2 као чвориште и покретач овог заштитног фенотипа макрофага индукованог флоретином. Утврђено је да активација аутофагијске машинерије зависна од АМПК и накнадна СКСТМл/п62-посредована (у даљем тексту п62) деградација Кеапл, адаптера који олакшава протеазомалну деградацију Нрф2, лежи у основи активације Нрф2 у макрофагима. Ови налази показују да флоретин има потенцијал да се користи у терапијским стратегијама за неуроинфламаторне поремећаје.

Методе

Антитела и хемијски реагенси

Флоретин(Сигма Алдрицх) је растворен у 50 мМ КОХ у 15 мМ основни раствор и чуван на -20 степену. Даља разблажења су направљена у медијуму РПМИ1640 (Гибцо). За ин виво третман, флоретин је растворен у 1 Н НаОХ, након чега је пХ поново подешен на 7,2 са 1 Н ХЦЛ, а раствор је даље разблажен у физиолошкој води да се добије концентрација од 50 мг/кг. БМЛ-275(1 μМ, Санта Цруз Биотецхнологи) је додат 1 х пре третмана флоретином да би се инхибирала активација АМПК. Бафиломицин А1 (БАФ, 0,1 μМ, ИнвивоГен) је додат 2 сата пре сакупљања да би се блокирала фузија аутофагозома и лизозома. Липополисахарид (ЛПС, 100 нг/мл, Сигма-Алдрицх) је коришћен за стимулацију ћелија за инфламаторну фенотипизацију. Форбол 12-миристат 13-ацетат (ПМА, 100 нг/мл, Сигма-Алдрицх) је коришћен за индукцију производње РОС. За вестерн блот коришћена су следећа антитела: мишји анти- -актин (1:10,000;сц-47778, Санта Цруз Биотецхнологи), мишји анти-ГАПДХ (1:{{29 }};АБ_2537659, Инвитроген), зечји анти-АМПК (1:1000;5831С, технологија ћелијске сигнализације), зечји антифосфориловани АМПК(1:1000; 2535С, технологија ћелијске сигнализације), зечји анти-ЛЦ3 (1:1000;Л7543,Сигма-Алдрицх),зечји анти-п62(1:1000; 23214, Технологија ћелијске сигнализације). За имунофлуоресценцију су коришћена следећа антитела: пацовски анти-ЦД3(1:150; МЦА500Г, Био-Рад), пацов анти-Ф4/80(1:100; МЦА497Г, Био-Рад), зечји анти-ЛЦ3(1:1000 ;Л7543, Сигма-Алдрицх), зечји анти-п62 (1:500;23214, технологија ћелијске сигнализације), зец анти-Кеап1(1:500;60027-1-Иг,Протеинтецх Еуропа), зец анти-ТМЕМ119(1 :100, аб209064, Абцам). Одговарајућа секундарна антитела су купљена од Инвитрогена.

Мишеви

Дивљи тип (ВТ) Ц57БЛ/6ЈОлаХсд мишеви су купљени од Енвига. Животиње су храњене редовном исхраном и смештене у објекту за животиње Биомедицинског истраживачког института Универзитета Хаселт. Сви експерименти су изведени у складу са институционалним смерницама и одобрени су од стране етичког комитета за експерименте на животињама Универзитета Хаселт.

Ћелијска култура

Произведен из коштане сржимакрофаги(БМДМ) изоловани су од ВТ и Нрф2 нокаутираних (КО) мишева Ц57БЛ/6ЈОлаХсд, купљених од Енвиго-а и обезбеђених од стране РИЕН БРЦ-а према МТА-у проф. С. Кердине-Ромеру [27,28]. БМДМ су добијени као што је претходно описано [29]. У кратким ћелијама тибијалне и феморалне коштане сржи од 12-недељних ВТ и Нрф2 КО Ц57БЛ/6ЈОлаХсд мишева узгајане су у 10-цм Петријевим плочама у концентрацији од 10×106 ћелија/ плоча, у медијуму РПМИ1640 са додатком 10% феталног телећег серума (ФЦС, Гибцо), 50У/мл пеницилина (Инвитро-ген), 50 У/мл стрептомицина (Инвитроген) и 15% Л929-кондиционираног медијума (ЛЦМ ). Након диференцијације, БМДМ су одвојени на 37 степени са 10 мМ ЕДТА у ПБС (Гибцо) и култивисани (0,5×10 степени ћелија/мл) у РПМ1640 допуњен са 10 процената ФЦС, 50У/мл пеницилина, 50У/мл стрептомицина (5 процената ЛЦМ). 37 степени Ц, 5 процената ЦО2). Културе микроглије су изоловане из мозга постнаталних штенаца П1-3 Ц57БЛ/6/ОлаХсд. Након што су мождано стабло, хороидни плексус и мождане овојнице уклоњени, мозгови су механички раздвојени и ензимски дигестирани 15 минута са 1× трипсином (Гибцо) на 37 степени. Након тога, ћелијска суспензија је засејана у ДМЕМ медијум са високим садржајем глукозе (Сигма) са додатком 30 процената ЛЦМ, 10 процената ФЦС, 50 У/мл пеницилина и 50 У/мл стрептомицина у боци за културу Т75. Два до 3 дана касније извршена је потпуна промена медија. Мешане глијалне културе су протресане (230 обртаја у минути, 3 х, 37 степени) после 6-7 дана да би се добиле чисте културе микроглије.

РНК секвенцирање

Ћелије су претходно третиране флоретином (50 μМ) током 20 х и ЛПС-стимулисане (100 нг/мл) током 6 х. Лиза ћелија је изведена коришћењем реагенса Киазол Лисис (Киаген). РНК је екстрахована из ћелија коришћењем РНеаси мини кита (Киаген). Узорке је затим обрадио Геномицс Цоре Леувен (Белгија). Припрема библиотеке је обављена са Лекоген-овим КуантСек китом да би се генерисале Иллумина компатибилне библиотеке. Библиотеке су секвенциониране на Иллумина ХиСек4000 систему секвенцирања. Поравнавање у складу са спајањем је изведено са СТАР в2.6.1б[30]. Квантификација очитавања по гену је изведена са ХТ-сек Цоунт в2.7.14. Анализа диференцијалне експресије заснована на бројању је урађена са Р-басед (Тхе Р Фоундатион фор Статистицал Цомпутинг, Беч, Аустрија) биокондукторским пакетом ДЕСек2. Листа различито експримираних гена је одабрана на ап<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Квантитативна реверзна транскрипција ПЦР

Ћелије су претходно третиране флоретином (50 μМ) током 20 х и ЛПС стимулисане (100 нг/мл) током 6 х. Лиза је изведена коришћењем Киазол Лисис реагенса (Киаген). РНК је екстрахована коришћењем РНеаси мини кита (Киаген). Концентрација и квалитет РНК су одређивани нано-дроп спектрофотометром (Исоген Лифе Сциенце). Синтеза цДНК је спроведена коришћењем Куанта кСцрипт цДНА СуперМик (Куанта Биосциенцес) према упутствима произвођача. кПЦР је изведен на СтепОне-Плус" ПЦР систему у реалном времену (Апплиед Биосистемс) коришћењем СИБР зелене мешавине која садржи 1× СИБР греен (Апплиед Биосистемс), 0,3 μМ прајмера (Интегрисане ДНК технологије), 12,5 нг цДНК и воде без нуклеаза За квантификацију експресије гена коришћена је компаративна Цт метода Подаци су нормализовани на најстабилније референтне гене циклин А и хипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1. Прајмер секвенце су доступне на захтев.

Одређивање реактивних врста кисеоника

Ћелије су претходно третиране флоретином (50 уМ) током 2 х. Након тога, ћелије су стимулисане са ПМА (15 мин, 100 нг/мл) и производња РОС је мерена коришћењем флуоресцентне сонде 2',7'-дихлородихидрофлуоресцеин диацетата на 10 μМ у ПБС током 30 минута. Флуоресценција је мерена коришћењем флуоресцентног читача микроплоча ФЛУОстар оптима (БМГ Лабтецх, Ортенберг, Немачка) (ексцитација: 495 нм, емисија: 529 нм).

Мерење азотног оксида

Ћелије су претходно третиране флоретином (50 μМ) током 2 х. Након тога, ћелије су стимулисане са ЛПС (24 х, 100 нг/мл). НО је индиректно праћен коришћењем комплета за мерење нитрита Гриесс реагенса (Абцам). Укратко, нитрат реагује са сулфаниламидом и Н-(1-нафтил)етилен-диамин дихидрохлоридом да би се добила ружичаста азо-боја. Апсорбанција овог азо деривата је затим измерена на 540 нм коришћењем читача микроплоче (иМарк, Био-Рад).

Вестерн блот

Ћелије су третиране флоретином (5{{10}} μМ) и ЛПС (100 нг/мл) током 1 х или 24 х да би се одредила активација АМПК или нивои протеина п62, ЛЦ3 и Кеапл респективно. Ћелије су лизиране коришћењем РИПА-пуфера (150 мМ НаЦл, 1 проценат Тритон Кс-100, 0,5 процената натријум деоксихолата, 1 проценат СДС, 50 мМ Трис) и раздвојене електрофорезом натријум додецил сулфата у полиакриламидном гелу. Гелови су пребачени на ПВДФ-мембрану (ВВР) и мрље су блокиране на 1 х у 5% говеђег серумског албумина у Трис-пуферисаном физиолошком раствору који садржи 0,1% Твеен-20(ТБС-Т). Мембране су испитане примарним антителима преко ноћи на 4°Ц, испране са ТБС-Т и инкубиране са одговарајућим секундарним антителом обележеним пероксидазом рена 1 х на собној температури (РТ). Имунореактивни сигнали су детектовани појачаном хемилуминисценцијом (ЕЦЛ Плус, Тхермо Фисхер) коришћењем Амерсхам Имагер 680 (ГЕ Хеалтхцаре Лифе Сциенцес) Густине трака су одређене коришћењем ИмагеЈ.

Имунофлуоресценција

Криосекције кичмене мождине су осушене на ваздуху и фиксиране у ледено хладном ацетону 10 минута на - 20 степени. Мишји БМДМ су култивисани на стакленим поклопцима и фиксирани у ледено хладном метанолу 10 минута на -20 степену. Секције и БМДМ су блокирани 30 минута коришћењем Дако протеинског блока (Аги-лент). Након тога, инкубирани су преко ноћи на 4"Ц са примарним антителима, испрани и инкубирани са одговарајућим секундарним антителима 1 х на собној температури. Слике ткива кичмене мождине су снимљене коришћењем Никон Ецлипсе 80и микроскопа (10× објектив) и НИС Елементс БР 3.10 софтвер (Никон). Слике БМДМ обојених на п62, ЛЦ3 и Кеапл су снимљене коришћењем конфокалног микроскопа Зеисс ЛСМ 880 и исправљене су Аирисцан-ом (објектив 63×).П62-и ЛЦ3- Позитивне пункте су одређене полуаутоматизованом анализом пункта имагеЈ. Укратко, након што је слика направљена бинарно и ћелије су одабране ручно, пункте су анализиране по ћелији. П62 и Кеапл колокализација је извршена коришћењем колокализационог цевовода у софтверу ЦеллПрофилер [31 ]. Слике приказане на сликама су дигитално побољшане.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, терапијска поставка). Мишеви су свакодневно мерени и оцењивани за неуролошке знаке болести у складу са ЕАЕ водичем за бодовање за мишеве:0:нема клиничких симптома,0.5:врх репа је млохав, 1:млакав реп , 1,5: млохав реп и инхибиција задњих ногу 2: млохав реп и слабост задњих ногу, 2,5: млохав реп и вуцање задњих ногу,3: млохав реп и потпуна парализа задњих ногу, 3,5: млохав реп и потпуна парализа задњих ногу ноге и миш нису у стању да се усправљају када се ставе на бок, 4: парализа дијафрагме, 5: смрт од ЕАЕ.

Статистичка анализа

ГрапхПад Присм је коришћен за статистичку анализу података, који су представљени као средња вредност±сем Д'Агостино, а Пеар-сонов омнибус тест нормалности је коришћен за тестирање нормалне дистрибуције. Двострани неупарени Студентов т-тест (са Велчовом корекцијом ако је потребно) коришћен је за нормално распоређене податке. Ман-Вхитнеи анализа је коришћена за податке који нису прошли тест нормалности.п-вредности<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Резултати

Транскрипционе промене повезане са третманом макрофага флоретином

Да бисмо утврдили потенцијалне антиинфламаторне ефекте и идентификовали основне механизме третмана флоретином на макрофагима, извршили смо масовно секвенцирање РНК (додатна слика 1). Анализа пута активираних макрофага третираних флоретином показала је да су различито експримирани гени презаступљени у канонским путевима који се односе наупала, као што је иНОС(з-сцоре:-2.449), рецептор сличан путарини(з-сцоре:-2.236), сигнализација интерферона (з-сцоре:- 2), и пут одговора акутне фазе (з-сцоре:- 1.633) (Сл. 1А, Б). Слично анализи канонског пута, узводна анализа РНА-сек података је предвидела да флоретин смањује активацију кључних проинфламаторних регулатора транскрипције као што су ИРФ7 (з-сцоре:2.229), ИРФ1(з-сцоре:-2. 025)и СТАТ1(з-сцоре:-2.022)(слика 1Д). Поред смањења проинфламаторних путева макрофага, РНА-сек анализа макрофага третираних флоретином показала је да је, између осталих путева, флоретин снажно активирао Нрф2 пут (з-сцоре:1,897), што је доказано повећањем регулације Нрф{35} гени као што су мафГ и проки (Слика 1А, Ц). Штавише, Нрф2 (НФЕ2Л2) је идентификован као најактивнији узводни регулатор транскрипције (з-сцоре: 2,801), а регулација нивоа РОС је идентификована као једна од најрегулисанијих биолошких функција у БМДМ третираним флоретином (з-сцоре: 2,008 )(Слика 1Д, Е). Колективно, налази показују да флоретин активира Нрф2 и потискује инфламаторни фенотип макрофага.

Нрф2 пут контролише фенотип макрофага третираних флоретином

Затим смо потврдили антиинфламаторни ефекат флоретина и утврдили да ли модулира инфламаторни фенотип макрофага делујући на Нрф2. Смањени нивои РОС примећени су у ВТ БМДМ третираним флоретином стимулисаним ПМА (слика 2А). Штавише, смањена производња НО и нивои мРНА проинфламаторних гена НОС2, И-6, ЦОКС2 и И-12 примећени су у ВТ БМДМ третираним флоретином стимулисаним ЛПС (Слика 2Б, Ц). У вези са кључном улогом Нрф2 у изазивању мање инфламаторног фенотипа, наши подаци показују да флоретин активира Нрф2- гене одговора ХО1 и НКО1 у ВТ, али не и Нрф2 КО БМДМс стимулисане ЛПС (слика 2Д). Штавише, третман флоретином је смањио производњу РОС у ВТ, али не и у Нрф2 КО БМДМ (слика 2Е). Осим контроле антиоксидативних одговора, наводи се да Нрф2 потискује инфламаторни фенотип макрофага [12]. У прилог овом последњем, флоретин није био у стању да смањи експресију проинфламаторних гена НОС2, ИЛ-6, ЦОКС2 , и ИЛ-12 у активираним Нрф2-дефицијентним БМДМ (слика 2Ф). Све у свему, ови резултати указују на то да Нрф2 покреће промену инфламаторног фенотипа макрофага посредованом флоретином.

Флоретин промовише активацију АМПК

Флоретин је добро дефинисан ГЛУТ инхибитор и недавне студије истичу важност ГЛУТ-посредованог преузимања глукозе за активацију макрофага [26,32]. Стога смо утврдили да ли флоретин може да активира енергетски сензор АМПК, који се активира при ниским нивоима енергије/глукозе. Наши резултати показују да третман флоретином доводи до фосфорилације и активације АМПК (Слика 3А, Б). Штавише, додатак АМПК инхибитора БМЛ-275 у великој мери спречава активацију АМПК у БМДМ третираним флоретином (Слика 3А, Б). Штавише, наши налази показују да је активација АМПК неопходна за флоретин да потисне производњу РОС, као што показују виши нивои РОС у БМДМ третираним и флоретином и АМПК инхибитором у поређењу са БМДМ леченим само флоретином (Слика 3Ц). Укупно, наши подаци сугеришу да је активација АМПК изазвана флоретином кључна за усмеравање макрофага ка мање инфламаторном фенотипу.

Флоретин стимулише аутофагију на АМПК зависан начин

Пошто је активација АМПК повезана са активацијом катаболичких процеса као одговор на недостатак хранљивих материја [33], затим смо истражили да ли флоретин може да активира аутофагију. Аутофагија је очувани катаболички процес који се индукује гладовањем и другим одговорима на стрес, који промовише лизозомску деградацију интрацелуларног терета издвојеног у везикуле који се називају аутофагозоми. РНА-сек анализа је предвидела аутофагију као један од низводних биолошких процеса који показује повећану активност у БМДМ третираним флоретином (з-сцоре: 0.779) (слика 4А). Штавише, имуноцитокемијска анализа БМДМ третираних флоретином и инхибитором аутофагије бафиломицином Ал показала је повећану акумулацију маркера аутофагије МАП1ЛЦ3/ЛЦ3 (протеин 1 лаки ланац 3 повезан са микротубулама) и п62 у поређењу са БМДМ третираним бафиломицином А1- 4Б-Д), што указује на повећан аутофагични флукс након третмана флоретином [34]. Након индукције аутофагије, ЛЦ3 се претвара из ЛЦ3И облика у липидовани ЛЦ3И облик, што је у корелацији са бројем аутофагозома. У складу са овим, виши нивои протеина ЛЦ3ИИ и п62 су одређени у БМДМ стимулисаним флоретином помоћу вестерн блота (Слика 4Е, Ф). Занимљиво је да је ово повећање п62 и ЛЦ3ИИ од стране флоретина спречено третирањем БМДМ са АМПК инхибитором БМЛ-275(Слика 4Е-Ф). Заједно, наши подаци показују да флоретин стимулише аутофагију на начин зависан од АМПК.

Флоретин активира пут Нрф2 кроз деградацију Кеап1 посредовану аутофагијом

Наши подаци показују да флоретин активира Нрф2 и стимулише аутофагију у макрофагима. Занимљиво је да рецептор аутофагије п62 може да се такмичи са Нрф2 за везивање за Кеапл, адаптер који олакшава убиквитинацију и деградацију Нрф2 у нормалним условима. Ова п62-посредована дисоцијација Кеап1/Нрф2 ће стога спречити деградацију Нрф2 и на крају довести до активације Нрф2 [35]. Из тог разлога смо утврдили да ли флоретин промовише интеракцију п62/Кеапл, чиме се активира Нрф2 пут. Овде показујемо да флоретин активира Нрф2 пут кроз п{{13}посредовану Кеапл деградацију у макрофагима. Коришћењем Аирисцан конфокалне микроскопије високе резолуције у комбинацији са анализом колокализације, показали смо да флоретин стимулише интеракцију п62 и Кеапл, што показује повећана вредност параметра колокализације (Пеарсонов коефицијент) у БМДМ третираним флоретином (слика 5А , Б). Штавише, наши налази показују да су нижи нивои протеина Кеапл присутни у БМДМ третираним флоретином, потврђујући деградацију Кеапл (слика 5Ц). Да бисмо потврдили да је деградација зависна од аутофагије, додали смо инхибитор аутофагије бафиломицин А1 у третиране флоретином БМДМс. Занимљиво је да је ово смањење Кеапл-а поништено третманом бафиломицином Ал (слика 5Ц). Ови резултати су потврђени Вестерн блот-ом, показујући смањење нивоа Кеапл протеина у БМДМ третираним флоретином, што је спречено бафиломицином А1 (Слика 5Д, Е).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), флоретин је смањио тежину болести (слика 6Б). Смањена тежина болести код животиња третираних флоретином била је упоредна са смањеном експресијом инфламаторних гена МХЦИ,

ЦД86,Нос2,ТНФа,ИЛ-6,ЦЦЛ4, ЦЦЛ5 и ЦКСЦЛ2 у кичменој мождини (слика 6Ц). Штавише, смањена количина Ф4/80т ћелија је пронађена у кичменој мождини животиња третираних флоретином (Слика 6Е, Ф). Пошто и Ф4/80*микроглија и Ф4/80* макрофаги доприносе неуроинфламацији, детаљнија анализа је показала да је флоретин значајно смањио количину Ф480 плус ТМЕМл19-

макрофага код ЕАЕ мишева (додатна слика 2 ДФ), док је примећен незнатан тренд ка редукцији у Ф480 плус ТМЕМл19 плус микроглија. У складу са овим налазом, флоретин је потиснуо производњу инфламаторних медијатора у микроглији, али је ово супресија било мање изражено у поређењу са макрофагима (додатна слика 2 АЦ). Ови налази сугеришу да је побољшање ЕАЕ помоћу флоретина углавном вођено макрофагом. Поред смањења експресије инфламаторних гена, флоретин је повећао експресију антиинфламаторних и неуротрофичних фактора, односно ИЛ-4, ЦНТФ и ИГФ-1 у кичменој мождини ЕАЕ животиња (Слика 6Д ). Ови налази снажно сугеришу да флоретин смањује тежину болести ЕАЕ тако што подстиче макрофаге ка фенотипу који решава болест. У складу са нашим претходним ин витро налазима, такође смо открили повишен сигнал Нрф2 у ЦНС-у ЕАЕ животиња третираних флоретином, на шта указује повећана експресија мРНК Нрф2 и његових низводних циљева НКО1 и ГПКС1 (слика 6Г). Све у свему, ови подаци показују да флоретин потискује неуроинфламацију иу профилактичком и у терапијском окружењу. Штавише, наши налази показују да флоретин може смањити неуроинфламацију сузбијањем инфламаторних карактеристика макрофага кроз активацију Нрф2.

Дискусија

У овој студији смо показали да флоретин покреће макрофаге ка мање инфламаторном фенотипу на Нрф2-зависан начин. Утврђено је да АМПК зависна активација аутофагије и накнадна Кеапл деградација лежи у основи активације Нрф2 флоретином. Штавише, потврђујемо антиинфламаторне ефекте флоретина у моделу ЕАЕ где смањује тежину болести и ублажава зависне од макрофаганеуроинфламација.

Показали смо да флоретин потискује инфламаторни фенотип макрофага. Ово је у складу са налазима Веи-Тиен Цханг-а ет ал. који су показали да флоретин има антиинфламаторна својства у ћелијској линији макрофага [36]. Показали смо да индукција ове промене фенотипа зависи од Нрф2. Нрф2 је главни регулатор антиоксидативних одговора и познато је да његова активација покреће макрофаге ка антиинфламаторном фенотипу [1л, 12, 37]. Поред тога, неколико студија је дефинисало да активација Нрф2 ублажава неуроинфламацију и неуродегенерацију код поремећаја ЦНС [{{10 }}]. Међутим, иако наши налази показују да Нрф2 лежи у основи промене фенотипа макрофага третираних флоретином, подаци о секвенцирању РНК су илустровали да су, међу активацијом Нрф2, други путеви били појачани. Конкретно, регулација ППАР пута је од интереса због његових антиинфламаторних карактеристика и унакрсног разговора са Нрф2 [41-45]. Поред тога, пошто је флоретин добро дефинисан ГЛУТ инхибитор и прелазак на гликолизу је кључни метаболички догађај за активацију макрофага, промене фенотипа такође могу бити делимично изазване директним метаболичким ефектима флоретина на ове транспортере глукозе [46,47]. Додатна истраживања су оправдана да би се дефинисала релевантност ППАР-а у активацији Нрф2 изазваној флоретином и у ком степену на имуномодулацију изазвану флоретином утичу директне метаболичке промене. Све у свему, наши налази јасно показују да активација Нрф2 игра суштинску улогу у промени фенотипа посредованом флоретином.

Наши налази показују да је активација Нрф2 флоретином посредована активацијом АМПК. АМПК игра кључну улогу у обнављању хомеостазе ћелијске енергије у случају стресова који троше АТП што доводи до повећаног односа АДП: АТП, чиме се укључују алтернативни катаболички путеви који генеришу АТП, док искључују анаболичке путеве који троше АТП [48]. Сходно томе, флоретин је добро успостављен инхибитор ГЛУТ-а и снижава нивое ћелијске глукозе [49-51]. Неколико студија је показало да активација АМПК у макрофагима индукује имуносупресивни фенотип, што потврђује наше резултате који показују да је активација АМПК неопходна за флоретин за смањење упале[52,53]. Наши подаци су такође у складу са претходним студијама у којима је показано да флоретин активира АМПК у другим типовима ћелија укључујући адипоците и ендотелне ћелије [50, 54-56]. Флоретин може да активира АМПК индиректно повећањем АМП и снижавањем нивоа АТП, пошто АМП и АТП алостерички стимулишу или инхибирају активацију АМПК, респективно [48, 57]. Без обзира на то, ЦаМКК, која је киназа узводно од АМПК, може промовисати активацију АМПК као одговор на повећане ћелијске нивое Ца2 плус без икаквих промена у нивоима АМП/АТП [58]. Поред тога, с обзиром на широку мрежу интеракције између АМПК и узводних и низводних путева, потребна су даља истраживања да би се разјаснио основни механизам активације АМПК изазване флоретином.

Наши подаци сугеришу да активација АМПК посредована флоретином стимулише аутофагију у макрофагима. Као што је горе поменуто, АМПК активација је самозаштитни процес који има за циљ обнављање енергетске равнотеже ћелије [48]. Иако ниједна студија никада није показала да је флоретин био у стању да стимулише фенотип макрофага промовисањем аутофагије, неке студије су ипак показале ефекат флоретина на путеве аутофагије у ћелијама рака и хепатоцитима [59-61]. Штавише, различите студије показују да низводни катаболички процеси активације АМПК могу активирати аутофагију [60, 62, 63]. Занимљиво, као одговор на гладовање глукозом, аутофагија посредована АМПК је индукована фосфорилацијом иницијатора аутофагије увозног мрава унц-51 попут киназе која активира аутофагију [64,65]. С обзиром на ово, спекулишемо да АМПК стимулише аутофагију да обнови АТП из ћелијских компоненти као одговор на смањење глукозе изазвано флоретином. Међутим, гладовање глукозом такође може да активира аутофагију на АМПК независан начин [66-68]. Стога је потребно више истраживања да би се утврдило да ли се активација аутофагије флоретином такође јавља делимично независно од АМПК.

Недавне студије су показале важност аутофагије за покретање функционалног фенотипа макрофага. У овом контексту, дисрегулација аутофагије у макрофагима је значајно повезана са појавом атеросклерозе и неуролошких болести [69-72]. Овде пружамо везу између третмана флоретином, индукције аутофагије и активације Нрф2 показујући да флоретин промовише активацију Нрф2 путем п62-посредоване деградације Кеап1. До недавно, повећање п62 пунцта се сматрало знаком смањене аутофагије јер се п62 разграђује у аутофагозомима након активације аутофагије [34]. С тим у вези, акумулација п62 је повезана са дисфункцијом аутофагије у атеросклеротским лезијама [73]. Међутим, овај појам је доведен у питање последњих година и сада се сматра да је п62 неопходан за формирање аутофагозома и да повећање нивоа п62 паралелно са повећањем ЛЦ3Ил пунцта може бити знак индукције аутофагије [74]. Стога, заједно са способношћу флоретина да активира АМПК и његовом познатом улогом у активацији аутофагије, наши резултати сугеришу да је акумулација П62 и ЛЦ3 након третмана бафиломицином А1 у макрофагима стимулисаним флоретином последица повећаног аутофагног флукса, а не због оштећења аутофагија. Занимљиво, Лее И ет ал. недавно је показало да, осим активирања Нрф2, п62 везивање за Кеапл такође учествује у формирању аутофагозома, што сугерише да је активација аутофагије посредована флоретином директно повезана са повећаном активношћу п62 с једне стране, али и са већом интеракцијом Кеапл-п62 с друге стране [ 75]. Кеапл је адаптер убиквитин лигазе засноване на Кулину-3- који формира хомодимер са Нрф2 у хомеостатским условима, чиме се промовише убиквитинација Нрф2 и протеазомска деградација [76]. Поремећај Кеапл-Нрф2 комплекса доводи до стабилизације Нрф2 и транслокације у језгро [77, 78]. Добро је документовано да се поремећај овог комплекса дешава било модификацијом Кеапл цистеинских остатака електрофилним молекулима, директном интеракцијом малих молекула са Кеапл-ом, или п{{36}посредованом Кеапл деградацијом [35]. Иинг И и сарадници предлажу директну интеракцију флоретина и Кеапл-а на основу ин силицо експеримената, што затим доводи до активације Нрф2 пута у ћелијској линији кардиомиоцита [79]. Овде смо успоставили додатни механизам повезан са аутофагијом којим флоретин активира Нрф2.

Користећи ЕАЕ модел, установили смо да флоретин ублажава неуроинфламацију ин виво. Наши подаци снажно сугеришу да флоретин побољшава ЕАЕ сузбијањем инфламаторног одговора посредованог макрофагима и активирањем Нрф2 пута. У другим моделима болести, такође је пријављено да флоретин испољава неуропротективне и имуномодулаторне карактеристике. Конкретно, откривено је да флоретин активира Нрф2 пут у мозгу након церебралне исхемије и смањује акумулацију бета амилоида у моделу Алцхајмерове болести пацова [80-84]. Флоретин такође може утицати на друге имуне ћелије ин виво, пошто је утврђено да ово једињење инхибира активацију Т ћелија и дендритских ћелија ин витро [85, 86]. С обзиром на то да неуроинфламација у ЕАЕ моделу није искључиво зависна од макрофага, било би од интереса да се дефинише у којој мери смањење неуроинфламације посредују друге имуне ћелије. С обзиром на ово, иако наши подаци сугеришу да је побољшање ЕАЕ углавном вођено макрофагима и мање зависи од модулације микроглије, потребни су даљи експерименти да би се разјаснило у којој мери флоретин утиче на микроглију код неуроинфламаторних болести. Све у свему, наши налази показују да флоретин смањује неуроинфламацију утичући на фенотип макрофага, показујући терапеутски потенцијал флоретина за неуроинфламаторне поремећаје.

Закључци

Наша студија показује да је флоретин моћан имуномодулаторни агенс који модулира инфламаторна својства макрофага код неуроинфламаторних поремећаја. Активација Нрф2 пута, посредована АМПК-зависном активацијом аутофагије и каснијом деградацијом Кеапл, установљена је да покреће ову промену фенотипа. Дакле, флоретин је обећавајући природни агенс који се може користити за смањење инфламаторног оптерећења неуроинфламаторних болести као што је МС.

Референце

1. Зенг И, Пенг И, Танг К, Ванг ИК, Зхао ЗИ, Веи КСИ, ет ал. Дихидромирицетин побољшава формирање пенастих ћелија преко ЛКСРалпха-АБЦА1/АБЦГ1-зависног одлива холестерола у макрофаге. Биомед Пхармацотхер. 2018;101:543–52. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.биопха.2018.02.124.

2. Ксиа М, Хоу М, Зху Х, Ма Ј, Танг З, Ванг К, ет ал. Антоцијанини индукују ефлукс холестерола из мишјих перитонеалних макрофага: улога рецептора {гама}- јетре Кс рецептора {алфа}- АБЦА1 активираног пролифератором пероксизома. Ј Биол Цхем. 2005;280(44):36792–801. хттпс://дои.орг/10.1 074/јбц.М505047200.

3. Цханг ИЦ, Лее ТС, Цхианг АН. Кверцетин побољшава експресију АБЦА1 и ефлукс холестерола путем ап38-зависног пута у макрофагима. Ј Липид Рес. 2012;53(9):1840–50. хттпс://дои.орг/10.1194/јлр.М024471.

4. Грајцхен Е, Хендрикс ЈЈА, Богие ЈФЈ. Физиологија пенастих фагоцита код мултипле склерозе. Ацта Неуропатхол Цоммун. 2018;6(1):124. хттпс://дои. орг/10.1186/с40478-018-0628-8.

5. Богие ЈФ, Стиниссен П, Хендрикс ЈЈ. Подгрупе макрофага и микроглија код мултипле склерозе. Ацта Неуропатхол. 2014;128(2):191–213. хттпс://дои.орг/1 0.1007/с00401-014-1310-2.

6. Баецхер-Аллан Ц, Касков БЈ, Веинер ХЛ. Мултипла склероза: механизми и имунотерапија. Неурон. 2018;97(4):742–68. хттпс://дои.орг/10.1016/ј. неурон.2018.01.021.

7. Богие ЈФЈ, Грајцхен Е, Воутерс Е, Цорралес АГ, Диерцкк Т, Ванхерле С, ет ал. Стеароил-ЦоА десатураза-1 нарушава репаративне особине макрофага и микроглије у мозгу. Ј Екп Мед. 2020; 217(5).

8. Богие ЈФ, Стиниссен П, Хеллингс Н, Хендрикс ЈЈ. Макрофаги који фагоцитирају мијелин модулирају аутореактивну пролиферацију Т ћелија. Ј Неуроинфламација. 2011;8(1):85. хттпс://дои.орг/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Богие ЈФ, Тиммерманс С, Хуинх-Тху ВА, Иртхум А, Смеетс ХЈ, Густафссон ЈА, ет ал. Липиди добијени од мијелина модулирају активност макрофага активацијом Кс рецептора јетре. ПЛоС Оне. 2012;7(9):е44998. хттпс://дои.орг/10.1371/ јоурнал.поне.0044998.

10. Богие ЈФ, Јориссен В, Маиллеук Ј, Нијланд ПГ, Зелцер Н, Ванмиерло Т, ет ал. Мијелин мења инфламаторни фенотип макрофага активирањем ППАР-а. Ацта Неуропатхол Цоммун. 2013;1(1):43. хттпс://дои.орг/10.1186/2 051-5960-1-43.