Поглавље 2: Бубрежни тубуларни пероксизоми су неопходни за нормалну функцију бубрега

За више информација. контактtina.xiang@wecistanche.com

Дискусија

Велика количина пероксизома у проксималном тубулу заједно са присуством бубрежних абнормалности код пацијената са ЗСД снажно сугерише важну улогу пероксизома убубрега. Штавише, експресија неколико пероксизомалних ензима специфична за бубреге подржава идеју да пероксизоми бубрега могу имати биолошке функције делимично различите од оних у другим ткивима (15). Да бисмо тестирали ове хипотезе, испитали смобубрежна функцијакод мишева лишених пероксизома, посебно убубрежни тубул. Међу различитим моделима мишева који су коришћени за проучавање улоге пероксизома, одабрали смо мишеве који омогућавају условну генетску инактивацију Пек5 који кодира фактор биогенезе пероксизома ПЕКС5 који је неопходан за формирање пероксизома. Овај модел је изабран јер (и)Пек5-нулл мишеви показују вишеструке биохемијске и функционалне абнормалности које подсећају на оне уочене код пацијената са ЗСД(11) и (и) велики спектар мишјих модела са аблацијом Пек5 специфичном за ткиво је анализиран(16), што нам омогућава да упоредимо функционалне последице пероксизомалног недостатка у бубрежним тубулима са онима уоченим у другим ткивима. Као што су показали Баес ет ал., Пек5-нулл мишеви су испољили интраутерино успоравање раста, малформације мозга и тешку хипотонију и умрли су у прва 72 сата живота (11). Биохемијске анализе су откриле неколико обележја ЗСД, укључујући смањење плазмалогена у јетри и мозгу и снажно повећање нивоа ВЛЦФА у плазми. Нису пронађене кортикалне бубрежне цисте у бубрегу Пек{{1{11}}}}нулл мишева на П0,5, али је примећено успоравање интраутериног сазревања гломерула. Присуство депозита калцијум оксалата није испитивано.

Кликните овде да бисте се упознали са предностима биљке цистанцхе

Код цКОм мишева, аблација пероксизомалне биогенезе у бубрежним тубулима није изазвала никакав већи фено-тип, осим смањења КВ и БВ код новорођенчади цКОм мишева и смањеног односа КВ/БВ код одраслих цКОм мишева. Код цКОф мишева, непотпуна ексцизија флоксираног Пек5 алела заједно са много блажим ефектом делеције Пек5 на бубрежни транскриптом и метаболом сугерише да неки резидуални пероксизоми могу остати у бубрежним тубулима. Међутим,секне може се искључити ни специфичност пероксизомалних функција у бубрегу. Нисмо пронашли никакву значајну морфолошку разлику у бубрезима цКОм мишева која би могла објаснити нижи однос КВ или КВ/БВ. Међутим, тенденција смањене ширине проксималне ћелије може бити могући узрок ове разлике. Важно је да се хомеостатска функција бубрега одржава код цКОм мишева упркос значајним променама у нивоима експресије транскрипата који кодирају протеине укључене у трансепителни транспорт јона, воде, амино киселина, органских ањона и катјона, фосфата, урата и мултили- ендоцитни пут жлијезда. Треба напоменути да је већина ниже регулисаних транскрипата кодирала транспортере изражене у проксималном тубулу, док је већина појачано регулисаних транскрипата кодирала транспортере изражене у дисталнијим деловима нефрона. На пример, повећана експресија Нкцц2, Цлц-Кб, Нцц и ЕНаЦ транскрипата сугерише компензаторну регулацију постпроксималне реапсорпције натријума. Интегрисана анализа бубрежног транскриптома и метаболома открила је дубоке промене у различитим ћелијским путевима који се односе на ћелијски метаболизам, састав липидних мембрана и редокс хомеостазу. У бубрезима цКОм мишева, око 8 процената транскриптома и око 24 процената откривених метаболита показало је различите нивое у поређењу са Цтрл мишевима. Као што се очекивало, многи од ових транскрипата и метаболита били су повезани са пероксизомалном функцијом. Уочено је драматично смањење у обиљу етарских фосфолипидних плазмалогена који се синтетишу у пероксизомима (~67 процената код цКОм мишева и ~50 процената код цКОф мишева, непондерисани збир свих откривених врста плазмалогена). Плазмалогени су главни фосфолипиди ћелијске мембране са све већим бројем приписаних функција, укључујући интегритет мембране, ћелијску сигнализацију и антиоксидантну одбрану. У бубрезима, плазмалогени представљају приближно 20 процената укупних фосфолипида(17), што сугерише да се најмање 10 процената фосфолипидног састава разликује у бубрезима цКОм и цКОф мишева од одговарајућих контрола. Смањење плазмалогена је потенцијално компензовано повећаним бројем структурно сличних фосфатидилетаноламина (ПЕ) и фосфатидилхолинима (ПЦ), који су показали значајно обогаћивање бубрега и код цКОм и цКОф мишева. Треба напоменути да је сличан компензаторни пораст ПЕ и ПЦ уочен у бубрезима пацијената са ЗСД (17).

Метаболизам проксималних тубула углавном се ослања на оксидацију масних киселина, коју карактерише висока генерација РОС произведених у митохондријима и пероксизомима. Код цКО мишева, путеви који се односе на деградацију/биосинтезу масних киселина су значајно појачани, што потенцијално указује на компензаторно повећање производње енергије митохондрија из ових супстрата. Пошто је једна од главних функција пероксизома детоксификација РОС-а, претпоставили смо да би аблација биогенезе пероксизома индуковалаоксидативни стресу бубрезима цКО мишева. Међутим, молекуларне анализе нису откриле промене у антиоксидативном капацитету и биомаркерима оксидативног стреса. Изазов са ХФД није изазвао промене у функционалном фенотипу, осим благог повећања запремине урина и излучивања калцијума и урата у урину код цКОм мишева. Интегрисана анализа транскриптома и метаболома омогућила је идентификацију пута глутатиона као могућег компензационог механизма за одржавање укупног антиоксидативног капацитета у ћелијама проксималних тубула бубрега којима недостају пероксизоми.

Условна делеција Пек5 у феталној јетри(12), у ћелијама панкреаса(18) иу различитим типовима ћелија централног нервног система (прегледано у реф.16) узрокује променљива, али углавном озбиљна функционална погоршања специфична за органе. То није био случај са бубрезима. У овој студији идентификовали смо неколико интринзичних бубрежних механизама који потенцијално омогућавају суочавање са недостатком пероксизома. Како је бубрег орган који показује високу перфузију крви, друга могућност лежи у екстрареналном пореклу бар дела метаболита које бубрег не производи у одсуству пероксизома, али који су неопходни за нормалну функцију бубрега. Наши подаци заједно сугеришу да су бубрежни тубуларни пероксизоми неопходни за нормалну функцију бубрега и да су патофизиолошке промене у бубрезима пацијената са ЗСД екстрареналног порекла.

Методе

Животиње. Поступци коришћени за генерисање Пек5а/ла/Пак8-нтТА/ЛЦ-1 Цре мишева су претходно описани (13). 3 линије миша коришћене у овој студији су инбред сојеви, узгајани на генетској позадини Ц57БЛ/6Ј миша (Тхе Јацксон Лаборатори). Пре свих експеримената, мишеви су прилагођени циклусу од 12-сат светлости/12-сат мрака. Сви експерименти су изведени у циркадијалном времену ЗТ3 (ЗТ0је време када је светло укључено, а ЗТ12 је време када је светло искључено).

Коришћени су Пек5бкло/Пак8-ртТА/ЛЦ1 троструки трансгени мушки или женски мишеви (који се називају цКОм и цКОф) и Пек5л/а мишеви (који се називају Цтрл или Цтрл). Рекомбинација Пек5 код новорођенчади је изведена додавањем 0.2 процента ДОКС-а и 2 процента сахарозе у воду за пиће трудних женки мишева током 2 недеље, почевши од њиховог 14. дана гестације. За рекомбинацију Пек5 код одраслих мишева, ДОКС и сахароза су додати у воду за пиће 8-недељних мишева. Структура и функција бубрега су процењени 4 недеље након завршетка третмана ДОКС код4-недељних беба мишева или 14-недељних одраслих мишева. Након одвикавања од 3 недеље, мишеви су храњени стандардном контролном исхраном која је садржала 4,2 процента масти (контролна дијета са ниским садржајем масти Снифф) или, када је поменуто, 4 недеље са одговарајућим ХФД који садржи 20,7 процената масти (углавном ЛЦФА).

Метаболички кавези и хемија крви и урина. Мишеви су смештени у појединачне метаболичке кавезе (Тецнипласт). Сакупљање урина је обављено након 3-дневног периода адаптације. Хемијски састав урина и крви је анализиран као што је претходно описано (19). Састав плазме и урина мерен је у Лаборатоире Централ де Цхимие Цлиникуе, Универзитетска болница Центре Хоспиталиер Университаире Ваудоисе (Лозана, Швајцарска).

Електронска микроскопија. Узорци бубрега су исечени на комаде величине око 1 мм³ и фиксирани у раствору глутаралдехида (ЕМС) 2,5 процената у фосфатном пуферу (ПБ,0.1 М пХ7,4) (МиллипореСигма) током 2 сата на собној температури (РТ). Затим су испрани 3 пута, сваки по 5 минута, у ПБ пуферу, а затим накнадно фиксирани свежом мешавином осмијум тетроксида 1 проценат (ЕМС) са 1,5 процената калијум фероцијанида (МиллипореСигма) у ПБ током 2 сата на собној температури. Узорци су затим испрани 3 пута у дестилованој води и дехидрирани у раствору ацетона (МиллипореСигма) у степенастим концентрацијама (30 процената 90 минута; 70 процената 90 минута; 100 процената 120 минута; 100 процената 240 минута). Затим је уследила инфилтрација у Епон смолу (МиллипореСигма) у степенованим концентрацијама (Епон/ацетон [1/3; в/в] 4 сата; Епон/ацетон [3/1; в/в] 4 сата, Епон/ацетон [1 /1;в/в] 8 сати; Епон/ацетон [1/1; в/в] 24 сата) и на крају полимеризација 48 сати на 60 степени у пећници. Ултратанки пресеци од 50 нм су исечени на Леица Ултрацут (Леица Микросистеме ГмбХ) и покупљени на бакарној мрежи с прорезима, 2 × 1 мм (ЕМС), обложеном полистиренским филмом (МиллипореСигма). Секције су накнадно обојене уранил ацетатом (МиллипореСигма) 2 процента у Х, О током 10 минута, испиране неколико пута са Х, О, а затим Реинолдсовим оловним цитратом током 10 минута, и испране неколико пута са Х, О.

Стереологи. За стереолошку анализу, анализирана су 3 комада кортекса бубрега по мишу, 15 микрографија по узорку са величином пиксела од 4,08 нм, коришћењем систематског равномерног случајног узорковања трансмисионим електронским микроскопом (Пхилипс ЦМ100, Тхермо Фисхер Сциентифиц) при напону убрзања од 80 кВ са дигиталном камером ТВИПС ТемЦам-Ф416 (ТВИПС ГмбХ).

Транскриптомска анализа. Сви подаци о секвенцирању су јавно доступни преко НИХ Гене Екпрессион Омнибус (приступни број ГСЕ179202). РНА-Сек библиотеке су припремљене коришћењем 200 нг укупне РНК бубрега као што је описано у Николаева ет ал. (19). Коришћени су реагенси Иллумина ТруСек СР Цлустер Кит в4. Подаци о секвенцирању су обрађени коришћењем Мус мусцулус. Анотација гена ГРЦм38.86, Статистичка анализа је обављена у Р (верзија 3.4.0). Транскрипти са малим бројем филтрирани су према правилу 1 број на милион (ЦПМ) у најмање 1 узорку. Величине библиотеке су скалиране коришћењем ТММ нормализације и лог-трансформисане у ЦПМ коришћењем воом-а (20). Анализа главних компоненти показала је малу варијабилност између реплицираних узорака. Диференцијална експресија између цКО и Цтрл мишева је израчуната у 1 Ф тесту коришћењем лимма (21). П вредности су подешене као што је описано (22) у ФДР вредности да би се узела у обзир вишеструка поређења, користећи резултате свих транскрипата код мушкараца и жена или резултате одабраних транспортера или транскрипта повезаних са пероксизомом само код мушкараца. Транскрипти са ФДР-ом<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Метаболомска анализа. Метаболити из замрзнутих узорака бубрега идентификовани су течном хроматографијом ултрависоких перформанси-тандем масеном спектроскопијом и квантификовани коришћењем АУЦ (Метаболон Инц). Необрађене вредности су логаритамске трансформисане и нормализоване у смислу броја сирових површина. Двосмерни АНОВА контрастни тестови су коришћени за идентификацију биохемикалија које су се значајно разликовале између цКО и Цтрл мишева оба пола. П вредности су подешене као што је описано (22) у ФДР вредности да би се узела у обзир вишеструка поређења, а метаболити са ФДР<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Заједничка анализа транскриптом-метаболома. Интегрисана анализа метаболичког пута која комбинује резултате добијене из студија експресије гена и метаболомских студија спроведена је коришћењем модула Јоинт Патхваи Аналисис на веб локацији МетабоАналист 5.0(24). Сложени назив метаболита и званични симбол гена транскрипата значајно више или мање у изобиљу (ФДР<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Боје. Бојење глобалне структуре бубрега, депозита калцијум оксалата или неутралног таложења липида изведено је на попречним резовима бубрега дебљине 5 μм. Осим неутралног бојења липида, мишеви су анестезирани, а њихов леви бубрег је перфузиран кроз абдоминалну аорту са 4 процентним раствором параформалдехида пре сакупљања ткива. За анализу глобалне структуре бубрега, резови бубрега уграђени у парафин су депарафинизовани, рехидрирани, обојени Х&Е, дехидрирани и монтирани у РОТИ Хистокитт (Царл Ротх ГмбХ). Неутрални липиди су обојени у резовима бубрега уграђеним у ОЦТ једињење (Тиссуе-Тек) коришћењем Оил Ред О раствора. Наслаге калцијум оксалата су бојене према методи коју је описао Пиззолато (25). Укратко, кришке бубрега уграђене у парафин су депарафинизоване и рехидриране, затим потопљене у 1:1 раствор сребрног нитрата 5 процената в/в и водоник пероксида 30 процената и стављене под сијалицу од 60 В на 30 минута. Слајдови су темељно опрани у дестилованој води и обојени Нуцлеар Фаст Ред (МиллипореСигма), затим дехидрирани пре постављања уРОТИ Хистокитт. Уздужни резови бубрега миша третираног дијетом изазваном калцијум-оксалатном нефропатијом (1,5 процената калцијума плус 1,5 процената хидроксипролина помешано у стандардној храни током 3 недеље) служили су као позитивна контрола наслага калцијум оксалата у бубрезима. Резултати су анализирани коришћењем Зеисс АкиоСцан.З1 скенера слајдова при оригиналном увећању од 100× или 200×.

ЕЛИСА и Тролок тест.4-ХНЕ су мерене коришћењем комплета за анализу пероксидације липида (4-ХНЕ) компаније Абцам (аб238538). Укупни и неензимски антиоксидативни капацитети су процењени Тролок комплетом за анализу од Абцам-а (аб65329).

Статистика. Сви подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ. Статистички тестови и праг значајности описани су у легендама слика или одговарајућим одељцима Методе. Статистичка анализа је извршена коришћењем Р пакета или софтвера ГрапхПад Присм верзије 8.2.1. Сви т-тестови су били 2 таилед.

Одобрење студије. Сви експерименти са животињама изведени су према швајцарским смерницама за бригу о животињама, које су у складу са смерницама Националног института за здравствену негу животиња, и одобрене од стране швајцарских кантоналних (Цантон де Вауд) и савезних ветеринарских власти (овлашћење 31827 за ДФ) (Дирецтион генерале де П'агрицултуре, де ла витицултуре ет дес аффаирс ветеринаирес, Епалингес, Швајцарска).

Претходно објављивање: Део овог рада је достављен као сажетак на Годишњем састанку Америчког друштва за нефрологију 2021. (4. новембар 2021. хттпс://ввв.асн-онлине.орг/едуцатион/киднеи-веек/2021 /програм-абстрацт.аспк?цонтролИд=3605774).