Мета-анализе идентификују метилацију ДНК која је повезана са функцијом и оштећењем бубрега

edmund.chen@wecistanche.com

Хроничниобољење бубрегапредставља велики терет за јавно здравље. Повишен однос албумина и креатинина у урину је мера заоштећење бубрега,и користи се за дијагнозу и стадијум хроничногобољење бубрега. Проширити знање о регулаторним механизмима који се односе нафункцију бубрегаи болести, спровели смо студију повезаности епигенома засновану на крви за процењену брзину гломеруларне филтрације (н=33, 605) и однос албумина у урину према креатинину (н=15, 068) и открили 69 и седам ЦпГ места где је метилација ДНК била повезана са одговарајућом особином. Већина ових налаза показала је конзистентну повезаност са одговарајућим клиничким исходима хроничне болестиобољење бубрегаи умерено повећана албуминурија. Асоцијације метилације ДНК сафункцију бубрега, као што су ЦпГ на ЈАЗФ1, ПЕЛИ1 и ЦХД2 су валидирани уткиво бубрега. Метилација на ПХРФ1, ЛДБ2, ЦСРНП1 и ИРФ5 указује на узрочне ефекте нафункцију бубрега. Анализе обогаћивања откриле су путеве повезане са хемостазом и миграцијом крвних зрнаца за процењену брзину гломеруларне филтрације, и активацију имуних ћелија и одговор на ЦпГ повезане са односом албумин-креатинин у урину.

Кључне речи:обољење бубрега; оштећење бубрега; функција бубрега; ткиво бубрега; структура бубрега

хроничнаобољење бубрега(ЦКД) представља велики терет за јавно здравље. Погађа више од 10 процената одраслих широм света и више од 40 процената особа старијих од 70 година1,2. ХББ је водећи узрок смрти широм света3 и главни је допринос кардиоваскуларном морбидитету и морталитету2,4,5. ЦКД се дефинише као трајно присуство абнормалностибубрегаструктуру или функцију. Тхефункцију бубрегамере које се најчешће користе су брзина гломеруларне филтрације, која се обично процењује на основу концентрације креатинина у серуму (еГФР), и однос албумина и креатинина у урину (УАЦР)6. Повишени УАЦР је мера заоштећење бубрега, који се користи за дијагнозу и стадијум ЦКД7, а повезан је са дијабетичарима и хипертоничаримаобољење бубрега8. Чак и умерено повишен УАЦР је фактор ризика за кардиоваскуларне болести, независно од другихфункцију бубрега markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 генетских локуса који су повезани сафункцију бубрега10,12,13. Варијанте индекса на познатим локусима повезаним са еГФР објашњавају процењених 8,9 процената варијансе еГФР12.Недавна ГВАС мета-анализа еГФР интегрисала је отворене регионе хроматина са малим скуповима појединачних нуклеотидних полиморфизама (СНП)10. Резултати ове студије потврђују важност измењене регулације транскрипције као механизма који доприноси хроничној болести бубрега. Да се ​​истражи метилација ДНК, с обзиром нафункцију бубрега, спроведене су студије асоцијације широм епигенома (ЕВАС) еГФР и ЦКД. Као кључни регулатор транскрипције који се може проценити на исплатив и високопропусни начин, метилација ДНК је проучавана на ЦпГ местима (ЦпГ) са резолуцијом са једном базом. Претходно смо спровели ЕВАС укључујући 4859 одраслих из две студије засноване на популацији и идентификовали 18 валидираних, различито метилираних места у пуној крви повезаних са еГФР14. Иако је ова студија открила увид у механизме регулације генабубрегафункције, повезани ЦпГс објашњавају само 1,2 процента варијансе еГФР. Друге претходне студије биле су фокусиране на пацијенте са ЦКД и/или пацијенте са дијабетесом или пацијенте са инфекцијом вирусом хумане имунодефицијенције, или су биле ограничене малом величином узорка, недостатком репликације, недостатком прилагођавања за потенцијалне збуњујуће факторе или њиховом комбинацијом14–19. Друге студије су се фокусирале на обрасце метилације ДНК дијабетичараобољење бубрега(ДКД) пацијенти 20–22.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛЕСТИ БУБРЕГА/БУБРЕГА

Овде смо спровели ЕВАС одфункцију бубрегаособине за идентификацију додатних ЦпГ-ова повезаних са регулаторним механизмима гена од потенцијалног значаја за ЦКД. Проширили смо ранији ЕВАС за еГФР и ЦКД тако што смо значајно повећали величину узорка на 33.605 особа. Штавише, укључили смо УАЦР и умерено повећану албуминурију (микроалбуминурију) као додатне особине. ЕВАС је спроведен у претежно популацијским студијама које су прилагођавале пол, старост, дијабетес, хипертензију, индекс телесне масе (БМИ), статус пушења и најзаступљеније пропорције белих крвних зрнаца. Реплицирали смо наше ЕВАС резултате у одвојеним узорцима, повезали ЦпГ места са нивоима експресије гена у различитим ткивима, применили налазе на клиничке исходе и проценили узрочност између метилације ДНК ифункцију бубрега(Допунска слика 1).

Резултати

Проучите карактеристике узорка. У овој истрази, 36 студија са укупно 33.605 учесника допринело је ЕВАС-у еГФР-а и 15.068 ЕВАС-у УАЦР-а. Њихове обједињене карактеристике су приказане у табели 1, а описи појединачних студија дати су у додатним подацима 1 и 2.

ЕВАС од еГФР и УАЦР.Истражили смо повезаностбубрегаособине са метилацијом ДНК у крви до 441.870 ЦпГс, преклапање ЦпГ-ова покривених Иллумина МетхилатионнЕПИЦ БеадЦхип и Иллумина ХуманМетхилатион450 БеадЦхип низом, који су коришћени за мерење у свим студијама осим у једној (додатни подаци 3). Све студије су извршиле чишћење низова података и примениле централно развијене скрипте за припремубубрегавредности особина, које су накнадно повезане са метилацијом ДНК коришћењем модела линеарне регресије прилагођених коваријацијама са вредностима метилације као зависном варијаблом према унапред специфицираним протоколима истраживања (видети Методе). Приметили смо никакву или малу инфлацију у ЕВАС специфичној за студију (еГФР средња инфлација=1.00, УАЦР средња инфлација=1.00, додатни подаци 1 и 2). У трансетничком ЕВАС прилагођеном мултиваријабилном, 69 ЦпГ је значајно повезано са еГФР и реплицирано (Слика 1А, Додатни подаци 4, видети Методе), укључујући оне претходно пријављене14. Реплицирана места су показала јасан образац ниже метилације (60 ЦпГ, Пбином=2.2Е-10; слика 1А).

Слика 1 ЕВАС резултати еГФР и УАЦР. Чикашки графикони резултата студије асоцијације широм епигенома (ЕВАС) за процењену брзину гломеруларне филтрације (еГФР) (А) и однос албумина и креатинина у урину (УАЦР) (Б) коришћењем комбинованог узорка открића и репликације. Локације су поређане према њиховом хромозомском положају на к-оси, са њиховом –лог10 П-вредношћу асоцијацијског Валд-теста датом на и-оси. ЦпГ позитивно корелирани са особином су уцртани у горњем делу, а места са негативном корелацијом у доњем делу. Испрекидане хоризонталне линије представљају ниво значајности (П-вредност < 1,1е−7).="" нове="" реплике="" локације="" су="" обојене="" у="" наранџасто,="" познате="" реплициране="" локације="" су="" обојене="" у="" тиркизно,="" а="" локације="" које="" су="" додатно="" повезане="" са="" одговарајућом="" бинарном="" особином="">обољење бубрега[ЦКД]/ микроалбуминурија [МА]) означени су крстом.

У мета-анализи, најниже П-вредности су уочене за познате асоцијације еГФР укључујући цг17944885 (ЗНФ788,=−1,75Е−04, П-вредност=8}.7Е−41), цг23597162 (ЈАЗФ1 ,=−1.48Е−04, П-вредност=3.2Е−24) и цг06158227 (ЗСЦАН29,=−1.08Е−04, П-вредност=8 .7Е−20)14, након чега следи нови налаз на цг20777437 (ЦДЦП2,=−8.28Е−05, П вредност=1.1Е−17). Само 69 ​​реплицираних ЦпГ-ова повезаних са еГФР објаснило је 15,7 процената варијације еГФР у посебном узорку студије од 1888 учесника (погледајте Методе). Када се додају све коваријате (пол, старост, дијабетес, хипертензија, БМИ, пушење и пропорције белих крвних зрнаца) у модел асоцијације, укупан удео објашњене варијансе у еГФР порастао је на 36,3 процента, са варијацијом од 2,4 процента која се приписује 69 ЦпГс независно од осталих коваријата.

У трансетничкој анализи УАЦР-а, седам ЦпГ-а је значајно повезано и реплицирано (Слика 1Б, Додатни подаци 5, видети Методе). Од налаза, цг18181703 (СОЦС3,=−2.58Е−03, П-вредност=2.6Е−13) и цг02711608 (СЛЦ1А5,=−1.63 Е−03, П-вредност=9.9Е−13) је имала најмању П-вредност асоцијације мета-анализе. Код шест од седам ЦпГ, нижа метилација је била повезана са вишим УАЦР. Због броја реплицираних места, снага биномног теста је била ограничена (6 ЦпГ, пбином=0.13; слика 1Б). Реплицирани ЦпГ-ови су објаснили 3,9 процената, а потпуни модел 14,6 процената варијације у нивоима УАЦР-а, при чему је 0,07 процената приписано ЦпГ-овима независно од других коваријата.

Било је мало преклапања између реплицираног ЕВАС и претходно пријављених ГВАС локуса за оба еГФР (преклапање=10 од 69; додатни подаци 4) и УАЦР (преклапање=1 од 7; додатни подаци 5). Није било преклапања реплицираних ЦпГ између еГФР и УАЦР, што указује на профиле метилације ДНК специфичне за особине у крви. Чак и међу 967 и 270 сугестивних асоцијација (П-вредност < 1е-05)="" комбиноване="" мета-анализе="" узорака="" открића="" и="" репликације="" за="" егфр="" и="" уацр,="" респективно,="" само="" 10="" места="" се="" преклапало="" између="" обе="" особине.="" детаљни="" резултати="" ових="" мета-анализа="" за="" све="" сугестивне="" асоцијације="" дати="" су="" у="" додатним="" подацима="" 6="" (егфр)="" и="" 7="">Хетерогеност предака и робусност налаза. Да бисмо проценили да ли резултати асоцијације на еГФР и УАЦР могу бити вођени специфичним пореклом, извршили смо ЕВАС мета-анализу узорака европског порекла (ЕА) и афроамеричког порекла (АА) са резултатима из више студија које су допринеле ова два етничке припадности. Поређење резултата асоцијације реплицираних ЦпГ у узорцима ЕА (Негар=23,671; нУАЦР=9806) са АА узорцима (неГФР =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) у или унутар 50 бп од 69 реплицираних ЦпГ-ова је процењено да би се проценило да ли присуство СНП-а може утицати на везивање сонде. Четири сонде су се налазиле у близини заједничког СНП-а (Допунски подаци 4; цг10960375-рс113564504; цг11544657-рс2083577; цг01817897-рс142643977; цг06930757-рс112223111), који, међутим, нису били повезани ни са једном ГВАС особином према ПхеноСцаннер В2 ресурсу (приступљено 02/12/2021, пГВАС < 5е−8,="" укључујући="" проки="" снп="" са="" еур="" р²=""> 0,8)23. Ово указује да је мало вероватно да ће резултати ЕВАС бити помешани са заједничком особином за коју се зна да се односи нафункцију бубрегаваријацијом оближње ДНК секвенце. Утврђено је да интерни СНП-ови сонде који су били више од пет база од 3′-краја сонде имају занемарљиве последице24.

Веза са ЦКД и микроалбуминуријом.Од 69 ЦпГ повезаних са еГФР, 53 су такође била повезана са преовлађујућом ЦКД у мета-анализи од 25,609 појединаца укључујући 2376 случајева са доследним смером ефекта (П-вредност < 0.="" 05/69;="" додатни="" подаци="" 4,="" додатна="" слика="" 3а).="" корелација="" између="" ефеката="" егфр="" и="" цкд="" била="" је="" висока="" (р="-0,93;" слика="" 3а).="" у="" независној="" кохорти="" од="" 551="" пацијената="" са="" цкд,="" 65="" цпгс="" је="" било="" усмерено="" у="" складу="" са="" мета-анализом="" егфр="" и="" пет="" је="" реплицирано="" (п-вредност="">< 0,05/69,="" р="0.77;" додатна="" слика="" 4,="" додатни="" подаци="" 4,="" види="" методе).="" у="" истој="" кохорти,="" егфр="" повезани="" цпгс="" цг18194850="" (п-вредност="1.6Е−5)" и="" цг07242931="" (п-вредност="2.3Е−5)" су="" такође="" били="" повезани="" са="" временом="">инсуфицијенција бубрегаили акутнаповреда бубрега(Допунски подаци 8, ​​видети Методе). Свих седам ЦпГ повезаних са УАЦР је такође значајно повезано са микроалбуминуријом на узорку од 7279 особа укључујући 1186 случајева са истим смером дејства као и за УАЦР (П-вредност < 0.05/7,="" р="" {{7}="" }.98;="" слика="" 3б,="" додатни="" подаци="" 5,="" додатна="" слика="">

Корелација са експресијом гена. Да бисмо стекли увид у могуће функционалне механизме ЦпГ-ова повезаних са еГФР и УАЦР, тестирали смо корелацију њихових нивоа метилације ДНК са нивоима мРНА гена кодираних у цис у пуној крви, као иу моноцитима у крви (погледајте Методе, Додатни подаци 9 ). Познати цг17944885 повезан са еГФР на хромозому 19 у близини ЗНФ788 био је повезан са транскриптом кодираним 240 кб удаљеним протеином цинк прста 439 (ЗНФ439, табела 2). Поред тога, метилација цг04864179 на регулаторном фактору 5 интерферона (ИРФ5) била је повезана са оба транскрипта мРНА кодиране ИРФ5 и оближњим транспортином 3 (ТНПО3) (додатна слика 5А). Од УАЦР асоцијација, два реплицирана ЦпГ цг02711608 и цг22304262 у породици носача растворених супстанци 1 члан 5 (СЛЦ1А5) открила су значајну повезаност са нивоима мРНА СЛЦ1А5, и цг23570810 на интерфероном индукованом протеином1 (трансифероном индукованим трансмембранским1 транскриптом1) 2). Сви резултати анализе генске експресије дати су у Додатним подацима 9.

Ефекти на бубрежно ткиво.Да би се проценило да ли се уочени ефекти метилације у крви преводе наткиво бубрега,применили смо регресиони модел да тестирамо повезаност реплицираних ЦпГ-ова на значајну (стопа лажног откривања (ФДР) < 0.05) и конзистентну повезаност са еГФР ибубрегафиброза, респективно, у 506 микродисекованаткиво бубрегаУзорци. У овим узорцима,бубрега- метилација ДНК заснована на ткиву реплицираних ЦпГ повезаних са еГФР цг23597162 на ЈАЗФ1, цг26099045 близу ПЕЛИ1 и цг12644285 на ЦХД2 су значајно повезане са еГФР са истим смером ефекта као у крви (додатни подаци, табела 2, 6А, додатна табела). . Штавише, исти ЦпГ на ПЕЛИ1 и шест додатних

локације (цг20146909 на ЛРРЦ8Д, цг25767870 близу ФАМ46Ц, цг16618493 на ЗБТБ7Б, цг10632966 близу РПЕЛ1, цг01068906 на НОД2 и цг03297ПД331 су биле повезане сабубрегаузорци ткива са доследним (тј. инверзним) правцима ефекта (додатна слика 6Б, табела 2). Од реплицираних УАЦР места, нивои метилације ДНК убубрегаткиво цг00008629 код ПТБП3 и цг24859433 у близини ИЕР3 је повезано са фиброзом и показало је исти правац дејства (додатна слика 6Д, табела 2). У складу са налазима ЕВАС-а, није пронађена значајна повезаност ЦпГ повезаних са УАЦР са еГФР код донатора узорака бубрега (додатна слика 6Ц, додатни подаци 10).

Узрочне последице између метилације ДНК ифункцију бубрегаособине. Да би се проценило да ли јефункцију бубрегаособине узрочно утичу на метилацију ДНК или обрнуто, спровели смо двосмерну анализу Менделове рандомизације (МР) у два узорка значајно повезаних ЦпГ. МР анализа у правцу напред сугерише да су ЦпГс цг02304370 (ПХРФ1), цг04460609 (ЛДБ2), цг00501876 (ЦСРНП1) и цг04864179 (ИРФ5) узрочно утичу на нивое еГФР (Табела 3). Процене наследности ова четири ЦпГ-а варирале су између три скупа података из популација европског порекла, али су биле доследно веће од средње херитабилности за све ЦпГ процењене у свакој од три студије: 0,34 (узрочни еГФР ЦпГ) наспрам 0,16 (низ ХМ450К) на основу Ханнон ет ал.25, 0,55 наспрам 0,19 за Донген ет ал.26, и 0,51 наспрам 0,19 за МцРае ет ал.27. Нису идентификоване значајне узрочне везе за било које ЦпГ повезане са УАЦР-ом. За реверзни МР, једини значајан ефекат био је ефекат еГФР на цг23597162 (ЈАЗФ1) када се користи метода примарне инверзне варијансе. Међутим, никакви значајни ефекти нису идентификовани/уочени у вишеструким реверзним МР анализама осетљивости. Изостављене анализе нису показале никакве индикације да би резултати МР могли бити вођени једним СНП-ом. Штавише, искључујући СНП-ове који су повезани са дијабетесом меллитусом типа 2 који је главни фактор ризика заобољење бубреганије резултирало другачијим налазима. Резултати за све примарне и МР анализе осетљивости приказани су у Додатним подацима 11 и 12 и Додатној слици 7. Анализе осетљивости подржавају примарне налазе значајних предњих МР резултата (ФДР < 0.05,="" видети="" методе)="" са="" процене="" конзистентног="" ефекта="" у="" правцу,="" што="" указује="" на="" потенцијалне="" узрочне="" везе="" од="" метилације="" днк="" до="" егфр,="" али="" не="" и="">

Везивање фактора транскрипције, анализе хистонских ознака и обогаћивања путева. Извршили смо анализу места везивања фактора транскрипције, марке хистона и обогаћивања пута на основу 967 ЦпГ који су показали сугестивну повезаност са еГФР (Пвалуе < 1е−05;="" додатни="" подаци="" 6)="" и="" 270="" цпг="" који="" су="" показали="" сугестивну="" повезаност="" са="" уацр="" (п-вредност="">< 1е-5;="" додатни="" подаци="" 7)="" у="" мета-анализи="" како="" би="" се="" максимизирала="" статистичка="" моћ="" анализа="" обогаћивања="" (видети="" методе)="" 14="" прво="" смо="" проценили="" да="" ли="" се="" цпг-ови="" повезани="" са="" егфр="" преференцијално="" мапирају="" на="" места="" везивања="" 169="" фактора="" транскрипције="" (тф)="" на="" основу="" хроматина="" имунопреципитатион="" днк-секуенцинг="" (цхип-сек)="" подаци="" из="" пројекта="" енцоде="" који="" су="" агрегирани="" консензусним="" позивима="" за="" 91="" тип="" људске="" ћелије="" (161="" тф="" траг)="" и="" допуњен="" са="">бубрегатрагови на бази ткива (видети Методе). После вишеструке корекције тестирања за 169 ТФ, осам ТФ је показало значајно обогаћивање за ЦпГ повезане са еГФР (ФДР < 0.05;="" слика="" 4а,="" додатни="" подаци="" 13),="" укључујући="" цебпб="" (п-вредност="1." 75е−06,="" унакрсна="" трака)="" и="" еп300="" (п-вредност="7.49Е−09," траг="" унакрсног="" ткива).="" ово="" је="" у="" складу="" са="" налазом="" цхуа="" ет="" ал.14="" у="" мањој="" подскупини="" од="" 4859="" учесника="" од="" 33,605="" учесника="" анализираних="" овде.="" цпг-ови="" повезани="" са="" уацр-ом="" обогаћени="" су="" местима="" везивања="" 56="" тф-ова="" (слика="" 4б,="" додатни="" подаци="" 14)="" са="" најјачом="" асоцијацијом="" за="" полр2а="" (п-вредност="6.93Е-19)," фос="" (п-вредност="" {{32="" }}.28е−12)="" и="" еп300="" (п-вредност="">

БубрегЦпГ-ови повезани са функцијом су широко обогаћени за неколико хистонских ознака, са 82 од 195 комбинација типова ћелија хистонских ознака значајних (ФДР к < 0.05)="" за="" егфр="" (слика="" 4ц,="" додатни="" подаци="" 15)="" и="" 79="" од="" 195="" за="" уацр="" (слика="" 4д,="" додатни="" подаци="" 16).="" хистонска="" модификација="" х3к4ме1,="" ознака="" концентрисана="" на="" активне="" и="" примесиране="" појачиваче,="" обогаћена="" је="" за="" све="" типове="" ћелија="" за="" цпг="" повезане="" са="" уацр,="" и="" скоро="" све="" типове="" ћелија="" за="" цпг="" повезане="" са="" егфр.="" док="" су="" цпг-ови="" повезани="" са="" уацр-ом="" показали="" обогаћивање="" за="" ознаку="" промотера="" х3к4ме3="" у="" 34="" типа="" ћелија,="" само="" четири="">

типови су показали обогаћивање за места повезана са еГФР. Супротно томе, ознака гена Х3К36ме3 повезана са телом показала је много шире обогаћивање за ЦпГ-ове повезане са еГФР (30 типова ћелија) од ЦпГ-ова повезаних са УАЦР-ом (пет типова ћелија). За разлику од Х3К3ме1/3 и Х3К36ме3, који су сви повезани са активним генима (појачивачи, активни промотори, активна транскрипција), Х3К9ме3 и Х3К27ме3, који су генерално повезани са конститутивним и факултативним хетерохроматином28–31, нису значајно обогаћени за УАЦР. повезани ЦпГ-ови у било ком испитиваном типу ћелије (слика 4Д, додатни подаци 16). Обогаћивање гена имплициранофункција бубрега-повезани ЦпГ-ови су процењени у Онтологији гена (ГО), Кјото енциклопедији гена и генома (КЕГГ) и базама података Реацтоме (види Методе)32–35. Уочено је значајно обогаћивање за 27 термина (25 ГО, један КЕГГ, један реактом; додатни подаци 17, слика 5А) за еГФР и 91 термин (87 ГО, четири реактома; додатни подаци 18, слика 5Б) за УАЦР (сл. 5Б). Путеви који се односе на миграцију специфичну за тип белих крвних зрнаца, транслацију мРНК, хемостазу и коагулацију, као и инсулински одговор, показали су значајно обогаћивање ЦпГ повезаних са еГФР (ФДР < 0.05;="" слика="" 5а).="" путевима="" са="" најнижим="" п-вредностима="" обогаћивања="" за="" места="" повезана="" са="" уацр-ом="" доминирала="" је="" активација="" и="" одговор="" имуних="" ћелија,="" као="" и="" путеви="" повезани="" са="" интерфероном="" (слика="" 5б).="" додатни="" путеви="" који="" су="" обогаћени="" укључивали="" су="" миграцију="" белих="" крвних="" зрнаца,="" што="" се="" тиче="" резултата="" егфр="" (додатни="" подаци="">

Однос према познатим ЕВАС асоцијацијама са другим особинама. Имајући у виду уочено обогаћивање путева повезаних са имунолошким одговором, резултате метилације ДНК укључујући ЦпГ у близини гена интерферонског пута, и чињеницу да је статус метилације ДНК претежно процењен у леукоцитима, проценили смо да ли наши налази могу бити вођени збуњујућим ефектима имунолошки одговор или статус упале. Стога смо извршили претрагу реплицираних ЦпГ-ова у великом ЕВАС-у на нивоима високо осетљивог серумског Ц-реактивног протеина (ЦРП)36. Само два ЦпГ, који су такође били повезани са метилацијом ДНК и еГФР уткиво бубрега,цг09610644 на БДХ1 и цг12644285 на ЦХД2, били су међу местима повезаним са ЦРП. Стога, генерално збуњивање наших резултата кроз инфламаторни статус према процени ЦРП-а изгледа мало вероватно.

Неки одфункција бубрега-повезани ЦпГ-ови идентификовани у овој студији повезани су са неколико других особина заснованих на објављеном ЕВАС-у. Двадесет и једна еГФР локација била је повезана са крвним притиском, конзумацијом алкохола, БМИ, полом, растворљивим рецептором фактора некрозе тумора 2 и/или статусом пушења, а пет УАЦР локација је раније било повезано са конзумацијом алкохола, статусом пушења, БМИ, образовним постигнућем, -глутамил трансфераза, растворљиви рецептор фактора некрозе тумора 2, дијабетес мелитус типа 2 и/или неколико серумских метаболита (Табела 2, Додатни подаци 19). Три од ових ЦпГ-а (све УАЦР локације) су биле повезане са више од две особине, наиме цг02711608 у СЛЦ1А5 (са -глутамил трансферазом, -глутамилтреонином, БМИ, конзумацијом алкохола), цг18181703 у СОЦС3 (са дијабетесом мелитусом типа 2, пушачким статусом Б , растворљиви рецептор фактора некрозе тумора 2), и цг24859433 близу ИЕР3 (са пушачким статусом, образовним постигнућем, 4-винилфенол_сулфат). Додатна слика 5Б илуструје ЦпГ, цг26099045, који је био у корелацији са еГФР и фиброзом уткиво бубрегау нашој анализи, и додатно повезан са сексом и пушењем у претходном ЕВАС-у. Коначно, цг17944885 код ЗНФ788 је такође био повезан са еГФР у узорку пацијената са ДКД22.

Дискусија

У овом ЕВАС-у одфункцију бубрега, идентификовали смо и реплицирали нивое метилације ДНК у крви од 69 ЦпГ повезаних са еГФР. Од тога, 60 локација раније није пријављено, као и свих седам ЦпГ-ова идентификованих у вези са УАЦР-ом. Већина ЦпГ-ова повезаних са еГФР и УАЦР је такође значајно повезана са њиховим клиничким исходима, тј. са ЦКД и микроалбуминуријом, и стога могу имати потенцијал за стратификацију појединаца под ризиком. Варијанца еГФР-а која се приписује овим 69 ЦпГ-а била је 2,4 процента - двоструко већа од ранијег ЕВАС14, и упоредива је са варијансом објашњеном са 29 СНП-ова које је открио ГВАС који су укључивали три пута већу величину узорка за откривање локуса37,38. Ово сугерише да диференцијална метилација ДНК на појединачним ЦпГ квантификованим из крви објашњава више варијансе еГФР него појединачни уобичајени СНП-ови при датој величини узорка. За УАЦР, чини се да су потребне веће величине узорка у поређењу са еГФР да би се открио сличан број ЦпГ-ова повезаних са особинама. С обзиром да се албумин и креатинин за израчунавање УАЦР мере у урину за разлику од квантификације креатинина из серума за процену ГФР, ова разлика није неочекивана и у складу је са запажањима из ГВАС ових особина10,13. Штавише, изгледа да генетске варијације утичу нафункцију бубрегаособине различитим путевима од промена у метилацији ДНК. Ово је подржано малим преклапањем између реплицираних ЕВАС и ГВАС локација за еГФР и УАЦР.

Ова ЕВАС мета-анализа укључила је узорке различитих популација и етничких група. Приметили смо високу корелацију процена ефеката добијених из великог подузорка ЕА појединаца са ефектима процењеним код АА појединаца (слика 2). Упркос укључивању података од значајног броја појединаца који нису пореклом из ЕА, укупни резултати транс-етничког ЕВАС-а могу бити вођени подацима појединаца пореклом из ЕА, који су представљали 70 процената (еГФР) / 65 процената (УАЦР) наше студије (додатни подаци 3 и 4). Да би се решило ово ограничење, потребне су будуће анализе са повећаним уделом узорака који нису ЕА за поуздану и детаљну процену хетерогености између предака. Потенцијал за превођење увида из ЕВАС-а о квантитативним особинама у студијама углавном заснованим на популацији на особе са болешћу илуструје се чињеницом да су процене ефекта на 65 од 69 ЦпГ повезаних са еГФР примећене у истом правцу у кохорти од 551 болесника са ЦКД, указујући на механизме применљиве у широком опсегу нивоа еГФР (слика 3). Штавише,

цг07242931 у МАН1Ц1 и цг18194850 у СУЦЛГ2 није био само повезан са еГФР, већ је и предвиђено време доинсуфицијенција бубрегаили акутнаповреда бубрега(Допунски подаци 8). ГВАС на дијабетичарима предложио је додатне доказе за учешће СУЦЛГ2, који кодира -подјединицу сукцинил-ЦоА синтетазе, у болести бубрега.обољење бубрегакод америчких Индијанаца (СНП=рс4453858, П-вредност=2Е−6)39. Генетска варијација овог гена је такође повезана са нивоима сукцинил-карнитина у урину (Ц4ДЦ, СНП=рс115560420, П-вредност=7Е−15)40. Ц4ДЦ је метаболички производ из циклуса трикарбоксилне киселине, који се катализује под утицајем сукцинил-ЦоА синтетазе, а виши нивои Ц4ДЦ у крви су повезани са нижим еГФР41. Међутим, претрага у резултатима локуса квантитативних особина метилације (меКТЛ) ГоДМЦ-а (хттп://ввв.годмц.орг.ук)42 није открила значајну повезаност ова два СНП-а са цг18194850, што сугерише да нема директне везе између ових СНП-а. и ЦпГ сајт.

Пошто је метилација ДНК главни регулатор експресије гена, проценили смо корелацију места метилације ДНК повезаних са особинама са нивоима мРНА гена у цис-у. Гени чији су нивои мРНА у значајној корелацији сафункцију бубрегаповезана места метилације ДНК била су повезана са путевима интерферона (и за еГФР и за УАЦР). Иако се ови налази слажу са резултатима обогаћивања пута за УАЦР (слика 5Б, додатни подаци 18), број значајних корелација између ЦпГ повезаних са УАЦР и нивоа транскрипта је прилично низак. Ово није изненађујуће с обзиром на релативно малу величину узорка од 1915 појединаца доступних за ову анализу и ограничену покривеност ресурса транскриптомије. Занимљиво је да су међу значајним налазима за УАЦР, два ЦпГ-а у породици носача растворене супстанце 1 члан 5 (СЛЦ1А5) била повезана са диференцијалном експресијом гена, а такође и са крвним притиском. Метилација ДНК на СЛЦ1А5, која кодира транспортер неутралних аминокиселина зависан од натријума, стога може бити додатни елемент који доприноси познатој корелацији између УАЦР и крвног притиска.

Значајни различито експримирани транскрипти нису увек били кодирани најближим геном (цг17944885 близу ЗНФ788), или је ЦпГ место било у корелацији са више гена у цис (цг04864179 на ИРФ5). Конкретно, приметна је корелација метилације ДНК на цг04864179 са нивоима ИРФ5 транскрипта. Узимајући у обзир значајан МР резултат овог ЦпГ-а са еГФР, метилација ДНК на ИРФ5 може узрочно утицати на еГФР посредован његовом експресијом гена. Узимајући у обзир трансформацију особина основних генетских асоцијација (погледајте Методе), приметили смо да је повећање метилације ДНК од десет стандардних девијација резултирало 3,2 процента већим еГФР. Иако је овај процењени ефекат веома мали, узрочни утицај образаца метилације у крвним ћелијама на ЦКД такође је подржан МР заснованим на сажетку са различитим меКТЛ скупом података у недавној студији, где је узрочни ефекат био усмерен у складу са нашим резултатима22. Применом колокализације са више особина, они су такође показали да су генетски ефекти овог локуса на еГФР посредовани ИРФ5 метилацијом и експресијом гена у крви. Штавише, приказана је колокализација експресије гена ИРФ5 са еГФР у тубуларном и гломеруларном одељкубубрегаткиво43. Приликом тумачења узрочног ефекта уоченог у нашој студији, међутим, треба имати на уму да су МР анализе за ЦпГ цг04864179 показале значајну хетерогеност (п < 0,05)="" међу="" инструментима="" (додатни="" подаци="" 11="" и="" допунска="" слика="" 7="">

ИРФ5 кодира члана породице регулаторних фактора интерферона (ИРФ). Група чланова породице ИРФ садржи факторе транскрипције са различитим улогама, као што су модулација активности имуног система, раст и диференцијација, као и контрола експресије гена за одговор интерферона на вирусне инфекције. ИРФ5 може утицати на одговор имуних ћелија. Више студија потврђује да промене у метилацији ИРФ5 могу утицатифункцију бубрегапреко имуних путева: СНП у ИРФ5 су повезани са СЛЕ преко промена у експресији ИРФ5 у моноцитима у крви44–46. СЛЕ је аутоимуна болест коју карактерише активација ИФН пута који може утицати набубрезикао лупус нефритис47. Инхибиција хиперактивације ИРФ5 у мишјем моделу СЛЕ заштићеног од почетка и тежине лупус нефритиса и побољшанафункцију бубрегаи патологија48,49. Иако се наш ЕВАС није фокусирао на проучавање пацијената са СЛЕ, мали ефекти метилације ИРФ5 на исходе повезане са бубрезима, посредовани барем делимично његовом експресијом и каснијим путевима ИФН, могу се открити као ефекти на еГФР у општој популацији.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА

Неколико ЦпГ-ова повезаних са еГФР за које је метилација ДНК квантификована из крвних ћелија такође је повезана са еГФР ибубрегафиброза када је квантификована метилација ДНКбубрегаткива, иако је величина узорка била знатно мања у поређењу са скупом података ЕВАС. Ово сугерише да се бар неки од налаза добијених из крви могу превести на додатно циљно ткиво специфично за особину. Ево, крв ибубрегасу два главна циљна ткива специфична за особине, поштофункцијаодбубрегаје филтрација крви за уклањање отпада. Анализе обогаћивања тхефункцију бубрегаповезани ЦпГ су указали на централну улогу у регулацији транскрипције. Открили смо широко распрострањено обогаћивање Х3К4ме1/3 и Х3К36ме3. Х3К4ме1/ 3 је повезан са примарним и активним појачивачима, као и активним промотерима, а Х3К36ме3 је уско повезан са транскрибованим регионима генома50. Улога регулације транскрипције је додатно подржана најјачим сигналом обогаћивања фактора транскрипције ЦпГ-ова повезаних са УАЦР, а то је ПОЛР2А, највећа подјединица главне мРНК која синтетише ензим у еукариотима.

Потенцијална ограничења у вези са МР анализама укључују то што валидни инструменти нису били доступни за све ЦпГ-ове за напредни МР. С обзиром да су сви инструменти ЦпГ изабрани из цис региона, односно истог генетског региона, вероватно је да су сви инструменти ЦпГ или валидни или неважећи, чиме се ограничава број различитих МР метода које се могу применити за тестирање робусност резултата51. Обрнути МР је био ограничен у снази због мале величине узорка која је доступна за процену асоцијација метилације СНП-ДНК. Веће меКТЛ студије, као што је ГоДМЦ, нису могле да сачувају резултате асоцијације за све СНП (тј. изнад одређене границе П-вредности асоцијације) из техничких разлога, па стога нису биле употребљиве за обрнути МР са два узорка. Стога се неважни налази морају пажљиво тумачити. Поред тога, тумачење величине узрочног ефекта је тешко, пошто су основне генетске асоцијације израчунате на скали стандардне девијације нивоа метилације ДНК. Још једно потенцијално ограничење студије је да су еГФР, ЦКД и УАЦР фенотипови процењени на основу различитих основних параметара и да имају мултифакторске утицаје. Стога смо извршили неколико анализа како бисмо осигурали да наши резултати ЕВАС нису вођени познатим збуњујућим факторима, укључујући дијабетес типа 2, потенцијални збуњујући однос између ДНК ифункцију бубрега. Прво, ЕВАС асоцијације у свакој кохорти су прилагођене за збуњујуће да уклоне њихове ефекте унутар кохорте. Друго, ЕВАС је изведен у свакој кохорти посебно, а затим мета-анализиран, што одговара прилагођавању, нпр. за преваленцију дијабетеса у свим кохортама. Коначно, проверили смо повезаност наших реплицираних ЦпГ-а у оквиру објављених ЕВАС студија о дијабетесу. Од свих наших реплицираних ЦпГ асоцијација, само је ЦпГ цг18181703 повезан са УАЦР-ом на СОЦС3 показао повезаност са дијабетесом типа 2. Овај ЦпГ је такође био повезан са пушачким статусом, БМИ и нивоима растворљивог рецептора фактора некрозе тумора 2 у крви. Узимајући у обзир да је наш ЕВАС такође прилагођен за статус пушења и БМИ, претпостављамо да су ефекти цг18181703 на УАЦР на најмање делимично независно од дијабетеса типа 2, БМИ и пушења. Док смо контролисали неколико ових познатих фактора, други фактори као што су неизмерене коваријате нису могли бити експлицитно прилагођени у анализама и могу утицати на налазе.

Потребне су даље студије ЕВАС са повећаном величином узорака и метилацијом ДНК из додатних ткива, као и функционалне анализе да бисмо проширили наше знање о регулаторним механизмимафункцију бубрега, и на крају побољшати предвиђање и лечењебубрегаболест. Ово важи посебно за УАЦР, с обзиром на мањи број уочених значајних ЦпГ асоцијација. Укратко, ова велика ЕВАС мета-анализа значајно је проширила број ЦпГ-а који су репродуктивно повезани са еГФР и ЦКД и открила седам асоцијација за УАЦР и микроалбуминурију. Метилација ДНК на овим местима објаснила је велики део варијансе еГФР, а диференцијална метилација на четири ЦпГ показала је доказе о потенцијалној узрочној вези са еГФР. Свеобухватна карактеризација реплицираних ЦпГ код пацијената са ЦКД, инткиво бубрега,за диференцијалну експресију гена, и за обогаћене путеве и епигенетске ознаке дају увид уфункцију бубрега-повезана регулација транскрипције.

Методе

Преглед.Поставили смо колаборативну мета-анализу засновану на дистрибутивном моделу података и процедурама контроле квалитета. Да би се максимизирала стандардизација фенотипа у свим студијама, направљени су план анализе и скрипта командне линије (хттпс://гитхуб.цом/генериц-Фреибург/Скаген-пхено/трее/цкдген-евас-пхено) и достављени свим студијама које учествују ( претежно студије засноване на популацији; Додатни подаци 1 и 2). Аутоматски генерисане датотеке са сажетком су проверене централно. Након одобрења фенотипа, студије су покренуле свој ЕВАС и учитале резултате и агрегиране информације о метилацији ДНК на централни сервер. ЕВАС контрола квалитета је извршена са прилагођеним скриптама за процену инфлације, позитивне контроле, дистрибуцију ЦпГ сонди и упоређивање укупних дистрибуција величина ефеката, стандардних грешака и П-вредности кроз студије. Сви протоколи студија су одобрени од стране одговарајућих локалних етичких комитета. Сви учесници у свим студијама дали су писмени информисани пристанак.

ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЖНУ/БУБРЕЗНУ ДИЈАЛИЗУ

Дефиниција фенотипа.Вредности креатинина добијене Јаффе тестом пре 2009 су калибрисане множењем са 0,9552. Студије су процениле ГФР са хроничнимОбољење бубрегаЕпидемиологи Цоллаборатион (ЦКД-ЕПИ) једначина53. еГФР је винзоризован на 15 и 200 мл мин-1 на 1,73 м2. ЦКД је дефинисан као еГФР испод 60 мл мин-1 на 1,73 м2. Вредности УАЦР измерене у мг/г су природно лог-трансформисане пре свих анализа. Микроалбуминурија је дефинисана као 1 за УАЦР > 30 мг/г и као 0 за вредности УАЦР < 10="">

Квантификација метилације ДНК и контрола квалитета.За квантификацију метилације ДНК, геномска ДНК је екстрахована из периферне крви. Нивои метилације ДНК су квантификовани коришћењем Инфиниум МетхилатионЕПИЦ БеадЦхип низа (ЕПИЦ), Иллумина Инфиниум ХуманМетхилатион450К БеадЦхип низа (ХМ450К) или Иллумина Инфиниум ХуманМетхилатион27 БеадЦхип низа (ХМ27К). Претходна обрада података о метилацији ДНК је обављена у складу са појединачним протоколима студије, укључујући корекцију позадине, квантилну нормализацију, филтрирање сонде, филтрирање узорака, усклађивање СНП са локацијама контролне сонде СНП, филтрирање ван граница и корекцију типа теста (додатни подаци 3). Ниво метилације на сваком месту је представљен и анализиран као -вредност. ЦпГ сонде које се преклапају са СНП су означене. Свака студија је израчунала средњу вредност и стандардну девијацију сваке ЦпГ локације, а ови збирни статистички подаци су упоређени између студија за систематске разлике међу ЦпГ-овима и праћени са појединачним аналитичарима студије

Коваријатна процена.Метилација ДНК и коваријати су мерени у истој тачки посете/време. Преовлађујући дијабетес је дефинисан као глукоза у плазми наташте већа или једнака 126 мг/дл, глукоза у плазми која није наташте већа или једнака 200 мг/дл, лечење дијабетеса или самопријављивање дијагнозе дијабетеса. Преовлађујућа хипертензија је дефинисана као систолни крвни притисак већи или једнак 140 мм Хг, дијастолни крвни притисак већи или једнак 90 мм Хг или третман за хипертензију. Ако измерени крвни притисак није био доступан, хипертензија је дефинисана самопријавом. Тренутни статус пушача је дефинисан коришћењем информација које су сами пријавили. БМИ (кг/м2) је израчунат коришћењем мерења тежине и висине како је процењено у свакој студији. Старост је укључена као континуирана вредност у моделе асоцијације. Структура популације у непородичним студијама је прилагођена генетским главним компонентама (ПЦ). Пропорције типа белих крвних зрнаца процењене су на основу метилације ДНК54. Додатне техничке коваријате укључивале су контролну сонду ПЦ55, центар за проучавање, пакет за обраду, ИД сензора низа и позицију стражара.

Статистичке методе и метаанализа. Да би се обезбедила упоредива снага међу анализираним местима, само су аутозомни ЦпГ мерени оба, ЕПИЦ и ХМ450К, укључени у анализе. Свака студија је извршила анализу линеарне регресије раздвојене по групама предака. За процену робусности резултата ЕВАС, анализе су биле ограничене на студије и подузорке појединаца европског порекла. Вредности метилације ДНК су моделоване као зависне варијабле са особинама које су или континуиране вредности еГФР или УАЦР или бинарне варијабле ЦКД или микроалбуминурије: ДНК метилација ~ особина плус пол плус старост плус генетски ПЦ плус пропорције белих крвних зрнаца плус техничке коваријате плус дијабетес плус хипертензија плус БМИ плус тренутно пушење Учесницима су биле потребне потпуне информације за све варијабле и збирне статистике студије и били су укључени само ако је било доступно најмање 50 учесника за еГФР/УАЦР и 50 случајева/контрола за ЦКД/микроалбуминурију. Сваки ЕВАС специфичан за студију је прилагођен инфлацији пре мета-анализе БАЦОН приступом ако је процена инфлације била већа или једнака један (додатна слика 8)56. Студије су подељене на откривање и репликацију хронолошким редоследом доприноса мета-анализи конзорцијума ЦКДГен (додатни подаци 1 и 2). Мета-анализа са фиксним ефектом пондерисана инверзном варијансом која је имплементирана у Р пакету 'метафор' (верзија 2.1-0) је изведена за студије открића, студије репликације и за процене резултујућих ефеката открића и репликације. ЦпГ су искључени ако је мање од половине одговарајуће величине узорка било доступно у оквиру открића или репликације или ако је процена хетерогености И2 била већа од 95 процената. Успешна репликација повезаног ЦпГ-а је дефинисана као доследан правац процене ефеката између открића (неГФР диск=22,347, нУАЦР диск=11,458) и репликације (неГФР репл=11,258 , нУАЦР репл=3610) мета-анализа, Бонферони прилагођен значај П-вредности открића (пдисц)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Анализе експресије гена.Ефектифункцију бубрегаЦпГ-ови повезани са особинама су тестирани на повезаност са експресијом гена у крви користећи два скупа података: (1) нивое мРНК моноцита од 1202 учесника МЕСА студије и (2) мРНК пуне крви 713 особа из КОРА Ф4 студија 57,58. Као почетни корак, извршено је тражење нивоа метилације ЦпГ са нивоима мРНК доступних у резултатима асоцијације из МЕСА студије. За ово тражење, били су доступни резултати повезивања са П-вредношћу < 1е{{10}}.="" анализа="" је="" детаљно="" описана="" у="" кеннеди="" ет="" ал.59.="" укратко,="" експресија="" гена="" је="" процењена="" коришћењем="" иллумина="" хуманхт-12="" в3.0="" и="" в4.{23}}="" екпрессион="" беадцхипс-а="" и="" метилације="" днк="" помоћу="" иллумина="" хм450к="" низа.="" вредности="" експресије="" су="" нормализоване="" коришћењем="" трансформације="" која="" стабилизује="" варијансу.="" 13.933="" транскрипта="" из="" в3.0="" и="" в4.0="" низова,="" који="" су="" били="" значајно="" изражени="" изнад="" нивоа="" позадине="" (п-вредност="" детекције="">< 0,01)="" код="" најмање="" 5="" процената="" испитаника.="" анализе="" асоцијације="" у="" меса="" су="" изведене="" као="" линеарни="" мешовити="" модел="" користећи="" лог-трансформисане="" вредности="" експресије="" гена="" као="" зависну="" варијаблу,="" вредности="" бета="" метилације="" днк="" као="" независну="" варијаблу="" уз="" старост,="" пол,="" етничку="" припадност="" и="" центар="" за="" проучавање="" додати="" као="" коваријате="" у="" модел.="" други="" тест="" асоцијације="" је="" изведен="" у="" скупу="" података="" кора="" ф4.="" повезаност="" нивоа="" метилације="" на="" реплицираним="" цпг-овима="" са="" нивоима="" генске="" експресије="" гена="" у="" близини="" ±500="" кб="" израчуната="" је="" коришћењем="" лог2-трансформисаних="" нивоа="" мрна="" добијених="" из="" иллумина="" хуман="" хт-12в3="" генске="" експресије="" низа.="" вредности="" експресије="" гена="" су="" регресиране="" на="" вредности="" бета="" метилације="" днк="" прилагођене="" за="" пол="" и="" старост.="" пре="" анализе="" технички="" фактори,="" као="" и="" пропорције="" типова="" крвних="" ћелија,="" регресирани="" су="" са="" нивоа="" метилације="" мрнк="" и="" днк,="" а="" њени="" остаци="" су="" укључени="" у="" коначни="" модел="" асоцијације.="" напомене="" и="" провере="" контроле="" квалитета="" сонди="" за="" експресију="" гена="" засноване="" су="" на="" табели="" датој="" у="" сцхурманн="" ет="" ал.60.="" асоцијације="" експресије="" цпг-гена="" у="" крви="" које="" су="" биле="" доступне="" у="" меса="" резултатима="" и="" имале="" су="" п-вредност=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Метилација ДНК у ткиву бубрега.Анализе које користе метилацију ДНК уткиво бубрегаса еГФР и фиброзом су изведени коришћењем података из 506 микродисекованихткиво бубрегаузорци користећи Иллумина ЕПИЦ БеадЦхип. Узорци ткива бубрега сакупљени су одвојено и разликују се од узорака крви који су анализирани у ЕВАС мета-анализи. Ови узорци су сакупљени из нетакнутих делова туморских нефректомија и припремљени као што је описано пре 61. Укратко, СеСАМе софтвер62 је коришћен за обављање претходне обраде и контроле квалитета укључујући детекцију засновану на ниском интензитету, корекцију проласка кроз одузимање позадине, нелинеарну корекцију пристрасности боје, контрола конверзије бисулфита, израчунавање бета вредности и процена фракције леукоцита. Бета вредности ЦпГ повезаних са еГФР и УАЦР и клиничке информације су екстраховане за анализу асоцијације. Регресиони модел је примењен да се тестирају асоцијације бета метилације ДНК коначних ЦпГ као зависних варијабли са нивоима еГФР и фиброзе, респективно, као независних варијабли прилагођених за пол, старост, генетски ПЦ (1-5), статус дијабетеса, статус хипертензије , БМИ, ИД низа сентрикса, положај сентрикса и контрола конверзије бисулфита и процењена фракција леукоцита.

Циљана испитивања еГФР сонди код пацијената са ЦКД. Повезаност 69 еГФР повезаних и валидираних ЦпГ из опште популације са еГФР у немачкој хроничнојОбољење бубрега (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 мг г-1). Праћење пацијената за клиничке крајње тачке је још увек у току. Крајње тачке студије се континуирано бележе на стандардизован начин на основу отпусних писама из болнице и потврда о смрти и укључују догађаје везане за бубреге, као и смрт. Дизајн студије и регрутована студијска популација су детаљније описани у претходним публикацијама63,64. ГЦКД студију су одобрили локални етички комитети и регистрована је у националном регистру за клиничке студије (ДРКС 00003971). Подгрупа од 559 пацијената са ЦКД који се приписују системском еритематозном лупусу, мембранској нефропатији, фокалној сегментној гломерулосклерози или аутозомно доминантној полицистичнојобољење бубрегаје одабран за квантификацију метилације ДНК и измерен коришћењем Инфиниум МетхилатионЕПИЦ БеадЦхип низа (ЕПИЦ). Повезаност са еГФР је процењена аналогно главној анализи (погледајте Статистичке методе и метаанализу), осим прилагођавања за пушење које је кодирано 0/1/2 за никад-/бивше-/тренутне пушаче. Да би се проценила повезаност метилације ДНК са временоминсуфицијенција бубрегаод уласка у студију, Цок регресиони модели су постављени за сваки ЦпГ, и аналогно за комбиновану крајњу тачкуинсуфицијенција бубрегаи акутнаповреда бубрега.Поред предиктора метилације ДНК, модели су прилагођени старости, полу и подтипу ЦКД. Коксов регресиони модел даје процене за однос ризика-специфичне опасности (ХР) у присуству конкурентних догађаја, тј. било које друге смрти осим смрти узроковане бубрезима. Додатно су спроведене анализе опасности поддистрибуције како би се проценили потенцијални индиректни ефекти преко такмичарског догађаја. Претпоставка пропорционалних опасности је процењена на основу скалираних Шенфелдових резидуала. Графичка процена за два повезана ЦпГ-а није открила никакве доказе о већим кршењима (додатна слика 9).

Регионалне асоцијације парцеле и напомене. Графике за додатну слику 5 креиране су коришћењем пакета 'Гвиз' 65 и 'ртрацклаиер' 66 Р. Максимално 40 локација унутар 50,000 бп узводно или низводно од ЦпГ сајта од интереса је укључено у графикон. Ако је интервал садржао више од 40 локација, уцртани регион је смањен на растојање најудаљеније локације плус 10,000 бп. Одељак РефСек Генес је заснован на УЦСЦ НЦБИ РефСек стази са симболима гена из пакета 'орг.Хс.ег.дб' ​​Р, одељак ЦпГ острва је заснован на УЦСЦ ЦпГ Исландс стази, одељак Мапе пута цхромХММ је заснован на Мапе пута 15- наводе цхромХММ модел фетусабубрегаепигеном (Мапа Епигенома ИД: Е086)67 и одељак Цоммон СНПс је заснован на УЦСЦ Цоммон СНПс(151) стази68. Коначно, дијаграм корелације ЦпГ на дну слике заснован је на подацима узорака метилације ДНК студије КОРА Ф4 коришћењем низа Иллумина ХуманМетхилатион450 БеадЦхип, при чему су места која недостају обојена светлосивом бојом.

Варијанца се објашњава метилацијом ДНК.Проценат фенотипске варијансе објашњен са 69 реплицираних ЦпГ повезаних са еГФР процењен је коришћењем података од 1.888 учесника из КОРА ФФ4 студије, седмогодишњег праћења КОРА Ф4 студије57,58. КОРА ФФ4 није био део ЕВАС мета-анализе. Међутим, 988 појединаца укључених у анализу објашњене варијансе преклапало се са КОРА Ф4 учесницима ЕВАС-а. У овом скупу података, варијанса објашњена свим ЦпГ-овима независно од коваријата процењена је као разлика у Р2 основног модела укључујући ЦпГ и онај без. Основни модел је дефинисан каобубрегаособина ~пол плус старост плус пропорције белих крвних зрнаца плус дијабетес плус хипертензија плус БМИ плус тренутно пушење сабубрегаособина која представља еГФР и УАЦР. За два ЦпГ-а повезана са еГФР (цг06008406, цг20004659), подаци нису били доступни у КОРА ФФ4 скупу података.

Двосмерна Менделова анализа рандомизације.У напредном МР-у, користећи Р пакет 'ТвоСамплеМР'69, истражили смо потенцијалне узрочне ефекте метилације ДНК на реплицираним ЦпГ-овима на еГФР и УАЦР. МР користи генетске инструменте да би минимизирао пристрасност због збуњујуће и обрнуте узрочности70. Генетски инструменти за метилацију ДНК (меКТЛ) били су доступни за 47 и пет ЦпГ за еГФР и УАЦР, респективно, како је претходно идентификовао ГоДМЦ код до 27,750 појединаца42. Резиме европског порекла ГВАС подаци о еГФР10 и УАЦР13 коришћени су као одговарајући подаци о исходу. Филтери су примењени за меКТЛ инклузију (пСНП < 1е-5="" са="" метилацијом="" днк="" у="" ±="" 500="" кб="" цис="" региону,="" неравнотежа="" веза="" р2="">< 0,2="" унутар="" 1мб="" региона,="" стеигерово="" филтрирање,="" маф=""> 0,05). Извршили смо МР пондерисану инверзном варијансом, као и анализе осетљивости МР (једноставни режим, пондерисани режим, пондерисана медијана и МР Еггер), или триангулацију проценом Валдовог односа у случају да је био доступан само један инструмент по ЦпГ месту71–73. Процене ефеката добијене из МР зависе од јединица основних скупова података, и у овом случају одговарају промени по јединици у једној стандардној девијацији нивоа метилације на природном лог трансформисаном еГФР, и стандардној девијацији природног лог трансформисаног УАЦР, редом. У обрнутом МР, испитали смо потенцијалне узрочне ефектефункцију бубрегаособине метилације ДНК, користећи значајне СНП-ове за читав геном из транс-етничког ГВАС-а на еГФР10 и УАЦР13 као генетске инструменте за еГФР и УАЦР, респективно. Да бисмо максимизирали снагу података о исходу, извршили смо мета-анализу з-скора СНП-ЦпГ асоцијација из КОРА Ф4 (н=1662) ​​и ФХС (н=3868) студија. Процене комбинованог ефекта и њихове стандардне грешке меКТЛ укључене у МР процењене су на основу величине узорка, учесталости алела и з-скора74. Филтери су примењени за укључивање СНП-а (П-вредност < 5е-8="">бубрегаособина, једнострана П-вредност < 0.05="" са="" азотом="" урее="" у="" крви="" за="" инструменте="" егфр,="" хетерогеност="" порекла="" п-вредност="" већа="" или="" једнака="" 0.0="" 1,="" стеигерово="" филтрирање,="" маф=""> 0.05). Извршили смо МР пондерисану инверзном варијансом са мултипликативним случајним ефектима (јер је по особини био доступан довољно велики број инструмената из различитих локуса)51 и анализе осетљивости МР (једноставни мод, пондерисани режим, пондерисана медијана и МР Еггер)71–73. Као додатна анализа осетљивости која се бави плеиотропним варијантама, искључили смо укупно 35 инструмената који су били повезани са дијабетесом меллитусом типа 2 у недавном ГВАС75 укључујући 898.130 појединаца: једанаест СНП-ова који су имали повезаност П-вредности < 5е-8="" са="" дијабетесом="" и="" 24="" додатна="" инструменти="" који="" су="" били="" у="" неравнотежи="" везе="" (р2=""> 0,2 унутар 1 Мб, 1000 Г ЕУР референтни панел) са таквим СНП-ом повезаним са дијабетесом. Неравнотежа везе је процењена преко ЛДлинк76. За обрнути МР, процене ефеката обезбеђују промену по јединици природног лог-трансформисаног еГФР-а и стандардну девијацију природног лог-трансформисаног УАЦР-а, респективно, на стандардној девијацији нивоа метилације ДНК. Прилагођавање вишеструког тестирања П-вредности према Бењамини-Хоцхберг ФДР < 0,05="" примењено="" је="" по="" особини="" бубрега,="" а="" за="" напредну="" и="" реверзну="" мр="" одвојено77.="" хетерогеност="" п-вредности="" су="" добијене="" из="">

Анализе обогаћивања.Да бисмо информисали о потенцијалним функционалним ефектима повезаних ЦпГ-ова, проценили смо обогаћивање ових ЦпГ-ова на местима ДНазе И или модификације хистона (Х3К4ме1, Х3К4ме3, Х3К9ме3, Х3К27ме3), генских скупова заснованих на ГО терминима и путевима у базама података КЕГГ и Реацтоме32 –35. Анализе обогаћивања ТФБС-ом су изведене као што је претходно детаљно описано14. Укратко, тестирање обогаћивања је процењено коришћењем еФорге78 коришћењем пермутације са подударањем за локализацију гена и ЦпГ региона острва приликом узорковања. Подаци су добијени из пројеката ЕНЦОДЕ (125 узорака) или Роадмап Епигеномицс (299 узорака) генерисаних методом Хотспот67,79,80. ЦпГ-ови који су били повезани са еГФР и УАЦР, при П-вредности < 1е−05="" у="" мета-анализи,="" коришћени="" су="" као="" улаз="" (додатни="" подаци="" 6="" и="" 7),="" а="" 10,000="" понављања="" узорковања,="" активни="" филтер="" близине="" и="" сматра="" се="" да="" је="" фдр="">< 0,05="" значајан="" (додатни="" подаци="" 13="" и="" 14).="" аналогно="" су="" изведене="" анализе="" обогаћивања="" хистонских="" ознака="" (додатни="" подаци="" 15="" и="" 16).="" обогаћивање="" генским="" скуповима="" или="" путевима="" је="" процењено="" коришћењем="" пакета="" метилгса="" и="" р="" верзије="" 3.6.181.="" метода="" теста="" обогаћивања="" била="" је="" метилглм="" применом="" логистичке="" регресије="" која="" прилагођава="" број="" сонди="" по="" гену="" и="" аутозомну="" позадину="" која="" се="" преклапа="" са="" 450к="" и="" епиц="" низовима.="" тестирани="" су="" скупови="" гена="" или="" путеви="" са="" 100–500="" гена="" (подразумевана="" поставка).="" сматрали="" смо="" да="" је="" скуп="" гена="" или="" пут="" значајно="" обогаћен="" при="" фдр="">< 0,05="" исправљајући="" за="" вишеструко="" тестирање="" унутар="" сваке="" базе="" података="" користећи="" бењамини="" и="" хоцхберг="" метод="" (додатни="" подаци="" 17="" и="">