Карактеризација кафеоилхинских киселина из Леписорус Тхунбергианус и њихова активност инхибиције меланогенезе

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Хак Хиун Ким, Јае Квон Ким, Јаехиун Ким, Се-Хуи Јунг,* и Кооиеон Лее*

АПСТРАКТАН:Хиперпигментација која је резултат прекомерне активације тирозиназе доводи до тамнијих мрља или мрља на људској кожи. Иако су ови феномени безопасни, и даље постоји велика потражња за инхибиторима меланогенезе како би се спречила хиперпигментација инхибицијом тирозиназе, ензима који ограничава брзину у меланогенези. Иако је Леписорус тхунбергианус коришћен у народној медицини као диуретик и хемостатски агенс, његов ефекат на меланогенезу још није пријављен. У овој студији смо припремили екстракт Л.тхунбергианус и његове фракције растварача и проценили њихову биолошку активност против синтезе слободних радикала и меланина. Екстракт Л. тхунбергианус инхибира активност тирозиназе печурака ефикасније него, и са сличним антиоксидативним деловањем као арбутин ин витро. Компаративна процена анти-меланогенезе и анти-тирозиназне активности фракција растварача Л. тхунбергианус показала је да, инхибицијом активности тирозиназе, фракција бутанола има највећи потенцијал за инхибицију меланогенезе у ћелијама меланома. Структурном анализом применом течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ) и НМР спектроскопије утврдили смо да су главна једињења у фракцији бутанола три деривата кафеоилхинске киселине. Три деривата су имала сличне активности уклањања радикала и анти-тирозиназе ин витро, док је само 5-кафеоилхинска киселина имала инхибиторни ефекат на -МСХ-индуковану меланогенезу. Инхибицијски ефекат 5- кофеоилхинске киселине је верификован одређивањем садржаја меланина и тирозинасеактивности у меланому након третирања ћелија комерцијалним једињењем. Даље, открили смо да 5- кофеоилхинска киселина инхибира меланогенезу хелирајући катјон бакра из комплекса бакар-тирозиназа. Према томе, 5-кафеоилхинска киселина или бутанол фракционисани изоловани из Л. тхунбергианус могу бити корисни у козметици као агенс за избељивање коже.

Цистанцхе тубулоса: средство за избељивање коже.

УВОД

Меланин, група природних пигмената који се налазе у већини организама, игра важну улогу у посмеђивању воћа, гљивица и поврћа и пигментацији на људској кожи.1 Меланин се производи од аминокиселине тирозина кроз процес у више корака који укључује ензимску оксидацију и полимеризацију. 2 Код људи, пигмент меланина се синтетише помоћу меланоцита специјализованих дендритичних ћелија који се налазе на споју епидермиса и дермиса у којима се синтеза покреће излагањем ултраљубичастим (УВ) зрацима.3 Пигмент меланина се транспортује до кератиноцита да би заштитио кожу од УВ зрака и слободних радикала; тако, боја коже је одређена шаблоном дистрибуције пигмента меланина.2 Дисрегулација синтезе меланина доводи до многих облика хиперпигментације, као што су мелазма, пеге, старачке пеге, соларни лентиго, постинфламаторна хиперпигментација и други хиперпигментациони синдроми.4 Више од стотине протеина су повезани са синтезом томеланина, а међу њима је тирозиназа ензим који ограничава брзину за који се сматра да је одговоран за синтезу формеланина.5 Стога је већина истраживачких радова на превенцији хиперпигментације фокусирана на идентификацију, изолацију, синтезу и карактеризацију нових моћних инхибитори тирозиназе за превенцију меланогенезе.1,6 Бројни инхибитори тирозиназе, као што су којична киселина, арбутин, хидрохинон, азелаинска киселина, елагинска киселина и транексамска киселина, су популарно коришћени у козметичкој индустрији као агенси против меланогенезе; међутим, због ограничења хемијских лекова, која укључују цитотоксичност и нежељене ефекте, још увек постоји потражња за новим материјалима са побољшаном безбедношћу, стабилношћу и ефикасношћу.7

Природни производи, укључујући биљке, бактерије и гљиве, постали су алтернативни извори за откривање ефикасних састојака за избељивање коже због њихове мање токсичности и боље биолошке компатибилности и биодоступности.1,8 Леписорус тхунбергианусис је папрат из породице Полиподиацеае, која расте везана за старе стене. или кора дрвећа и распрострањена је у умереним регионима источне Азије, као што су Кореја, Јапан, Кина, Филипини и Индокина. Л. тхунбергианус је коришћен као адиуретик, хемостатски агенс и антитусик у корејским народним лековима. Претходне студије су објавиле да Л. тхунбергианусектрацт има локалну антилипидну пероксидациону активност у локалној и антиоксидативној активности.9 Штавише, екстракт Л. тхунбергианус показао је значајну инхибицију раста зависну од концентрације у ћелијама рака усне шупљине и рака дебелог црева.10 Л. тхунбергианусектрацт може имати потенцијалну примену у козметичкој индустрији јер ова биљка садржи разна једињења флавоноида и бројне биоактивне молекуле, који укључују кверцетин 3-метил етар-глукозид, витексин, оријентални, периодични-глукозид, изовитексин, оријентин, корентин и кафеоилкиничну киселину, међутим, ефекти 9а. Синтеза екстракта Л. тхунбергианус онмеланина у меланоцитима тек треба да буде разјашњена.

Слика 1. Анализа екстракта Л. тхунбергианус за (А) уклањање радикала АБТС, (Б) анти-тирозиназу и (Ц) интрацелуларне активности чишћења РОС

У овој студији смо припремили екстракт Л. тхунбергианус и његове фракције растварача путем серијског фракционисања и истражили инхибиторне ефекте фракција растварача на биосинтезу меланина у ћелијама меланома Б16Ф10. Идентификовали смо фракцију бутанола (н-БуОХ) као главни део који садржи природни инхибитор и даље карактерисали ефекте деривата кафеоилхинске киселине изолованих из екстраката Л. тхунбергианус на инхибицију биосинтезе меланина.

цистанцхе рецензија: антиоксидација

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА

Етанол екстракт Л. тхунбергианус чисти радикал 2,2′-азинобис(3-етил-бензотиазолин-6-сулфонске киселине (АБТС) и инхибира активност тирозиназе).

Екстракција Л. тхунбергианус са 70 процената етанола (ЕтОХ) је обављен да би се проценила потенцијална инхибиторна активност природних једињења у биљци. Активност уклањања радикала екстракта Л.тхунбергианус је одређена у опсегу концентрација од 2-200 уг/мЛ. Екстракт етанола је показао активност уклањања радикала зависну од концентрације са максималним ефектом при 50 уг/мЛ, при чему је резултат био у складу са резултатом арбутина који се користи као позитивна контрола (Слика 1А).

Такође смо проценили инхибиторни ефекат екстракта на активност тирозиназе печурака мерењем брзине синтезе допахрома катализоване тирозиназом. Етаноекстракт је инхибирао 87 процената активности тирозиназе при 500 уг/мЛ, док је арбутин инхибирао само 38 процената активности тирозиназе при истој концентрацији (слика 1Б). Затим смо проценили активност уклањања екстракта на интрацелуларном РОС повећаном за 100 μМ водоник пероксида. Третман водоник-пероксидом индуковао је приближно 2.1-пута повећање интрацелуларног нивоа РОС ћелија Б16Ф10 (Слика 1Ц). Открили смо да је повећање интрацелуларног РОС посредовано водоник-пероксидом уклоњено екстрактом на начин који зависи од дозе: максимална активност уклањања при 100 уг/мЛ била је 78 процената (Слика 1Ц). Ови резултати сугеришу да етанолни екстракт Л. тхунбергианус садржи биоактивне састојке који инхибирају активност тирозиназе, као и уклањање АБТС радикала и интрацелуларних РОС.

екстракт цистанцхе десертицола: инхибира активност тирозиназе.

Инхибицијски потенцијал фракција Л. тхунбергианус против меланогенезе.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >ЦХ2Цл2 > Хек, што је у складу са претходним извештајем.10б Даље, инхибиторни ефекти различитих фракција растварача на активност тирозиназе су порасли на начин који зависи од концентрације: максималне инхибиторне активности н-Хек и ЦХ2Цл2 фракција биле су испод 65 процената, али оне ЕтОАц и н-БуОХ фракције су биле изнад 70 процената (слика 2Б). Инхибициона активност је била реда н-БуОХ > ЕтОАц > ЦХ2Цл2 > н-Хек. Ови резултати сугеришу да је више хидрофилних фракција, укључујући фракције н-БуОХ и ЕтОАц, показало већу активност уклањања радикала и бољу инхибиторну активност од липофилних н-Хек и ЦХ2Цл2 фракција .

Затим су испитивани ефекти фракција растварача Л. тхунбергианус на пролиферацију ћелија меланома третирањем Б16Ф10 ћелија са 200 уг/мЛ сваке од различитих фракција или 2мг/мЛ арбутина у присуство -меланоцит-стимулирајућег хормона (-МСХ), за који је добро познато да промовише меланогенезу путем индукције транскрипционог фактора повезаног са микрофталмијом (МИТФ).11 Резултати су показали да ниједна од фракција није имала значајан утицај на пролиферацију ћелија меланома (Слика 2Ц). Затим смо истражили инхибиторни ефекат фракција растварача на меланогенезу стимулисану -МСХ у ћелијама меланома. Третман са -МСХ индуковао је приближно 2.{13}}пута повећања интрацелуларног садржаја меланина у Б16Ф10 ћелијама (слика 2Д). Открили смо да је меланогенеза посредована -МСХ била потпуно инхибирана фракцијом н-БуОХ (п < 0,01)="" и="" делимично="" инхибирана="" етоацфракцијом="" (40="" процената,="" п="">< 0,01),="" док="" меланогенеза="" посредована="" -мсх="" није="" значајно="" промењена="" н-хек="" и="" цх2цл2="" фракције="" (слика="" 2д).="" даље,="" утврђени="" су="" инхибиторни="" ефекти="" фракција="" растварача="" на="" активацију="" тирозиназе="" посредоване="" -мсх="" јер="" тирозиназа="" игра="" кључну="" улогу="" у="" меланогенези.="" н-буох="" (95="" процената,="" п="">< 0,001)="" и="" етоац="" (66="" процената,="" п="">< 0,001)="" фракције="" реверзне="" активације="" тирозине="" помоћу="" -мсх,="" док="" фракције="" н-хек="" и="" цх2цл2="" нису,="" као="" што="" је="" приказано="" на="" слици="" 2е.="" штавише,="" ефекат="" чишћења="" различитих="" фракција="" растварача="" на="" повећање="" интрацелуларног="" рос-а="" је="" стимулисан="" водоник-пероксидом.="" све="" фракције="" растварача="" су="" преокренуле="" интрацелуларно="" повећање="" рос="" посредовано="" водоник-пероксидом,="" као="" што="" је="" приказано="" на="" слици="" 2ф.="" ови="" резултати="" указују="" на="" то="" да="" је="" буох="" фракција="" л.="" тхунбергианус="" инхибирала="" -мсх-индуковану="" синтезу="" меланина="" инхибирањем="" активности="" интрацелуларне="" тирозиназе="" у="" б16ф10="" ћелијама.="" штавише,="" ови="" резултати="" сугеришу="" да="" су="" биоактивни="" састојци="" који="" инхибирају="" синтезу="" меланина="" били="" хидрофилни="" и="" да="" су="" углавном="" пронађени="" у="" фракцији="">

Слика 2. Ефекти фракција растварача на активности уклањања радикала АБТС, анти-тирозиназе и анти-меланогенезе.

Идентификација и карактеризација биоактивних једињења екстракта Л. тхунбергианус.

Да би се идентификовали и карактерисали састојци који инхибирају меланогенезу, извршена је анализа течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ) за све фракције растварача. ХПЛЦ анализа фракција растварача је открила да све фракције садрже три главна једињења у временима задржавања од 21, 28 и 29 мин за једињења 1, 2 и 3, респективно (Слика 3А-Д). Ова три главна једињења су даље изолована препаративном ХПЛЦ пречишћавањем. Количине три главна једињења у фракцији н-БуОХ су одређене коришћењем комерцијалних деривата кафеоилхинске киселине као интерних стандардних молекула, према претходном извештају.12

Изолована једињења су затим идентификована поређењем њихових 1Х и 13Ц НМР података са литературом и утврђено је да се слажу са предложеним структурама (Слика 4).13 Слика 3Е приказује молекуларну структуру три једињења. Једињење 1 (принос, 3,2 ± 0.1 мг/100 мг н БуОХ фракције) је добијено као бледо жути прах. 1ХНМР (400 МХз, ДМСО-д6) δ 9,66 (1Х, брс), 9,20 (1Х, брс), 7,49 (1Х, д, Ј=15}.9 Хз), 7,04 (1Х, с), 6,99 ( 1Х, д, Ј=8.2Хз), 6.78 (1Х, д, Ј=8.1 Хз), 6.23 (1Х, д, Ј=15.9 Хз), 5.20( 1Х, м), 5,08 (1Х, брс), 4,89 (1Х, брс) 4,13 (1Х, м), 3,84 (1Х, м), 3,56 (1Х, с), 3,35 (1Х, с), 1,99 (1Х, м), 1,92 (ИХ, м), 1,89 (ИХ, м), 1,79 (ИХ, м). 13Ц{1Х} НМР (100 МХз, ДМСО-д6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65, 121.07, 115.75, 114.75, 114.47, 72.52, 71.72, 52.72, 72.72, 72.72 . Једињење 1 је идентификовано као 3-кафеоилквинска киселина НМР анализом и поређењем са претходном литературом.13б

Једињење 2 (принос, 14,1 ± 0.1 мг/100 мг фракције н-БуОХ) је добијено као бледо жути прах. 1Х НМР (400МХз, ДМСО-д6) δ 9,64 (1Х, брс), 9,20 (1Х, брс), 7,52 (1Х,д, Ј=15}.9 Хз), 7,06 (1Х, с), 7,02 ( 1Х, д, Ј=8.1 Хз) 6.79 (1Х, д, Ј=7.9 Хз), 6.30 (1Х, д, Ј=15.9 Хз), 4.85 ( 1Х, брс), 4,70 (1Х, д, Ј=4}.9 Хз), 4,12 (1Х, брс), 3,95 (1Х, м), 1,97 (2Х, м), 1,88 (1Х, м), 1,83 (ИХ, м). 13Ц{1Х} НМР (100МХз, ДМСО-д6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 114.76, 114.46, 74.46, 74.46, 74.46, 74.46. Једињење 2 је идентификовано као 5-кафеоилкинска киселина НМР анализом и поређењем са претходном литературом.13ц

Једињење 3 (принос, 3,9 ± 0.2 мг/100 мг фракције н-БуОХ) је добијено као бледо жути прах. 1Х НМР (400МХз, ДМСО-д6) δ 9,64 (1Х, брс), 9,20 (1Х, брс), 7,52 (1Х,д, Ј=15}.9 Хз), 7,06 (1Х, с), 7,02 ( 1Х, д, Ј=8.1 Хз) 6.79 (1Х, д, Ј=7.9 Хз), 6.30 (1Х, д, Ј=15.9 Хз), 4.85 ( 1Х, брс), 4,70 (1Х, д, Ј=4}.9 Хз), 4,12 (1Х, брс), 3,95 (1Х, м), 1,97 (2Х, м), 1,88 (1Х, м), 1,83 (ИХ, м). 13Ц{1Х} НМР (100МХз, ДМСО-д6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 114.76, 114.46, 74.46, 74.46, 74.46, 74.46. Једињење 3 је идентификовано као 4-кафеоилкинска киселина НМР анализом и поређењем са претходном литературом.13а

Слика 3. ХПЛЦ хроматограми (А) н-Хек, (Б) ЦХ2Цл2, (Ц) ЕтОАц и (Д) н-БуОХ фракција Л. тхунбергианус и (Е) структуре три главна једињења.

Инхибиторни потенцијал деривата кафеоилкинске киселине изолованих из Л. тхунбергианус против меланогенезе.

Затим, да бисмо идентификовали биолошки активни састојак који лежи у основи моћне антимеланогенезе, одредили смо инхибиторну активност три деривата кафеоилхинске киселине изолованих из Л. тхунбергианус против синтезе меланина у ћелијама меланома. Прво су истражени ефекти три деривата на уклањање радикала АБТС. Резултати су показали да су три деривата имала сличне активности уклањања радикала АБТС (Слика 5А). Затим смо истражили инхибиторни ефекат три деривата изолована из активности онтирозиназе Л. тхунбергианус. Три деривата су показала концентрацијско зависну инхибицију активности тирозиназе, са максималном инхибицијом при концентрацији од 200 μМ (Слика 5Б). Даље, истражили смо инхибиторни ефекат три деривата на синтезу меланина индуковану -МСХ у Б16Ф10 ћелијама. Третман са -МСХ индуковао је приближно 2.{11}}пута повећања интрацелуларног садржаја меланина у Б16Ф10 ћелијама (слика 5Ц). Занимљиво је да једињења 1 (3-кафеоилкининска киселина) и 3 (4-кафеоилкинска киселина) значајно повећавају синтезу меланина за 25 и 23 процента, респективно (слика 5Ц, стр.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Слика 4. 1Х НМР спектри (А) 3- кофеоилхинске киселине, (Б) 4- кофеоилхинске киселине и (Ц) 5- кофеоилхинске киселине и 13Ц НМР спектри (Д) {{ 6}}кафеоилхинска киселина, (Е) 4-кафеоилкинска киселина и (Ф) 5-кофеоилкинска киселина

Провера ефикасности 5- кафеоилхинске киселине против меланогенезе.

Да бисмо потврдили инхибиторни ефекат {{0}}кафеоилхинске киселине на меланогенезу, утврдили смо инхибицијски ефекат комерцијалне 5-кофеоилхинске киселине на синтезу меланина посредовану -МСХ. Третман са нижим концентрацијама 0.1 и 0.2 мМ 5-кафеоилхиничне киселине благо је повећао синтезу меланина и активност интрацелуларне тирозиназе, док су веће концентрације од 0,5 и 1 мм једињења преокренуле меланогенезу посредовану МСХ и активност интрацелуларне тирозиназе (Слика 6А, Б) у којој су резултати у складу са претходним извештајем.14

Кафеоилквинска киселина је фенолно једињење формирано естарском везом између кофеинске киселине и Л-хинске киселине. Познато је да деривати кафеоилхинске киселине имају анти-меланогенезу и анти-тирозиназну активност, као и активност уклањања РОС. Тирозиназа је мултифункционални металоензим који садржи бакар са двовалентним катјонима бакра.1 Деривати кафеоилхинске киселине могу инхибирати активност тирозиназе тако што хелирају катјон бакра који је одговоран за одржавање активног стања тирозиназе. Да би се предвидела интеракција између 5-кафеоилхинске киселине и тирозиназе, спроведена је рачунарска молекуларна студија пристајања помоћу Маестропрограма. Најбоља поза за једињење, спојена тотирозиназа, приказана је на слици 6Ц, Д. Студија молекуларног спајања открила је да 5-кофеоилкинска киселина реагује са бакром на удаљености од 2,43 А и успоставља серију π−π слагања са Хис 259, Асн 260, Хис 85 и Хис 263 остаци и Х-веза са Арг 268. Штавише, енергија везивања између тирозиназе и 5-кафеоилхинске киселине била је −4,425 кЈ/мол. Ови резултати показују да 5-кофеоилхинска киселина може да инхибира активност тирозиназе хелацијом бакра. Да бисмо верификовали механизам инхибиције меланогенезе 5-кафеоилхиничне киселине, одредили смо способност хелатирања бакра 5-кафеоилхинске киселине. Способност хелатирања бакра 5-кафеоилхинске киселине је повећана на начин који зависи од концентрације (Слика 6Е). Овај резултат сугерише да 5-кафеоилхиничка киселина инхибира синтезу меланина путем хелирања катјона бакра који реагује са тирозиназом.

Слика 5. Ефекти три деривата кафеоилхинске киселине на уклањање радикала, ин витро активност анти-тирозиназе и анти-меланогенезе у ћелијама Б16Ф10.

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Материјали

Л. тхунбергианус је купљен на интернет тржишту ввв.јирисангол.цом (Кореја) и осушен у амбијенталним условима пре употребе у овој студији. Реагенси, као што су 2,2′- цинк бис(3-етил-бензотиазолин-6-сулфонска киселина (АБТС) и 3-(4,5-диметилтиазол-2- ил)-2,5-дифенилтетразолијум бромид (МТТ), хормон који стимулише меланоците (-МСХ), и ензими, као што је тирозиназа печурака, добијени су од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). Калијумперсулфат (К2С2О8), пирокатехол љубичаста и 3,4-дихидрокси-Л фенилаланин (Л-ДОПА) су набављени од Алфа Аесар-а (Хаверхилл, МА, САД).

Екстракција и фракционисање Л. тхунбергианус.

Осушени Л. тхунбергианус (80 г) је уситњен у прах помоћу машине за млевење (ХБЛ-3500С, Самианг Елецтроницс, Кореа) и екстрахован са 70 процената ЕтОХ три пута (800 мЛ, сваки пут ) на 70 степени током 3 дана. Добијени екстракт је вакуумски филтриран коришћењем Адвантецфилтер папира бр. 1 и 2 (Тоио Росхи Каисха, Лтд., Токио, Јапан) и концентровано коришћењем Хеи-Вап Адвантаге ротационог испаривача (Хеидолпх, Немачка) да би се добило 17,2 г ЕтОХ сировог екстракта. Овај сирови екстракт је суспендован у дХ2О (180 мЛ) и сукцесивно фракционисан са Хек, ЦХ2Цл2, ЕтОАц и н-БуОХ да би се добио Хек (1,51 г, 8,8 процената), ЦХ2Цл2 (0,88 г, 5,1 проценат), ЕтОАц, (3,90 г). проценат ), и н-БуОХ (3,02 г, 17,6 процената), као што је претходно описано.15 Добијени екстракти и фракције су осушени замрзавањем и чувани на -80 степени пре употребе.

Одређивање активности уклањања слободних радикала АБТС.

Да би се проценила антиоксидативна активност екстракта Л.тхунбергианус и његових фракција растварача, одређена је активност уклањања АБТСрадикала, као што је претходно описано.16 Да би се створио АБТС радикал, 10 мЛ од 7 мМАБТС је помешан са 176 μЛ 140 мМ калијумперокси дисулфата у дХ2О и инкубирано у мраку на собној температури (РТ) 16 х пре употребе. Раствор радикала АБТС је разблажен апсолутним метанолом да би се добила анабсорбанца од близу 0,7 на 734 нм. Аликвоти од 100 μЛ сваког екстракта или фракција у назначеном опсегу концентрација од 2-200 уг/мЛ су додати у 100 μЛ разблаженог раствора АБТС радикала и инкубирани 10 минута у мраку на собној температури. Апсорпција је затим мерена на 732 нм коришћењем СпецтраМакМ5 мултимодног читача микроплоча (Молецулар Девицес, Суннивале, Калифорнија, САД). Активност уклањања радикала АБТС израчуната је на следећи начин

Активност уклањања радикала АБТС (проценти) =1−(Асампле/Ацонтрол)×100 (1)

Ин витро инхибиција тирозиназе.

Инхибиторни ефекат екстраката Л.тхунбергианус и његових фракција растварача на тирозинасеактивност је процењен количином допахрома синтетизоване каталитичком реакцијом тирозиназе.2а,17 Укратко, 50 μЛ сваког екстракта или фракције у назначеном опсегу концентрације помешано је са 50 μЛ од 50 μЛ. У/мЛ тирозиназа печурки у 50 мМ фосфатним пуфером сланог раствора (ПБС; 8,1 мМ На2ХПО4, 1,2 мМ КХ2ПО4, пХ 6,8, 2,7 мМКЦл и 138 мМ НаЦл) у плочи са {{20} бунарчићем на температури од 3 мин. Затим је у сваки бунар додато 100 μЛ 1 мМ Л-ДОПА, након чега је уследила инкубација додатних 10 минута на 37 степени. Апсорбанција добијеног раствора је мерена на 475 нм коришћењем СпецтраМак М5 мултимодног читача микроплоча.

Ћелијска култура.

Б16Ф10 ћелије мишјег меланома су култивисане у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) (Гибцо, Геитхерсбург, САД) са додатком 10 процената топлотно инактивираног феталног говеђег серума (Гибцо), 100 јединица/мЛ пеницилина и 100 уг/мл стрептомицинина на степену под влажним 5% ЦО2.

Виталност ћелија.

Вијабилност ћелија Б16Ф10 је одређена коришћењем МТТ теста, као што је претходно описано.18 Укратко, ћелије Б16Ф10 су засејане у 24- плоче са бунарима при густини од 1 × 104 ћелије по бунарчићу. После 24 х, ћелије су третиране назначеним концентрацијама екстракта или фракција Л. тхунбергианус током 48 х. Ћелије су затим инкубиране са МТТ раствором 4 х, а редуковани кристали формазана су растворени у ДМСО. Добијени раствор је пренет на 96-плоче са бунарима, а апсорпција је измерена на 540 нм коришћењем СпецтраМак М5 мултимодног читача микроплоча.

Одређивање интрацелуларних реактивних врста кисеоника (РОС).

Интрацелуларни ниво РОС-а је мерен коришћењем ДЦФ/Х2ДЦФДА ћелијског РОС тестног комплета (аб113851,Абцам), према упутствима произвођача. Укратко, ћелије Б16Ф10 су засејане у 48-плоче са бунарима при густини од 2 × 104 ћелије по бунарчићу. После 24 х културе, ћелије су третиране 1 х са назначеним концентрацијама екстракта Л. тхунбергианус или фракција растварача у медијуму културе који садржи 0,1 проценат говеђег серумског албумина (БСА) без фенол црвеног. Ћелије су затим инкубиране са 100 μМ водоник пероксида 30 мин. После испирања са ПБС, ћелије су третиране са 25 μМХ2ДЦФДА у ПБС током 45 мин. Ниво РОС је анализиран читачем микроплоче (Синерги Х1, Биотек, Вермонт, УСА) опремљеним флуоресцентним филтером на 485/545 нм (таласна дужина ексцитације/емисије). Просечан релативни интензитет флуоресценције контроле је изједначен са 100 процената, при чему су услови третмана израчунати пропорционално.

Одређивање садржаја меланина.

Садржај меланина је одређен, као што је претходно описано, уз неке модификације.19 Ћелије меланома су култивисане у плочи са шест јажица током 24 х. Третирани су назначеним концентрацијама екстракта Л. тхунбергианус или његовим фракцијама растварача током наредних 48 х у присуству 100 нМ -МСХ. Након два пута испирања са охлађеним Дулбеццо-овим фосфатним пуфером физиолошким раствором допуњеним калцијум хлоридом, магнезијум-хлоридом и магнезијум-хлоридом Гибцо), резултујуће ћелије су одвојене инкубацијом са раствором трипсина-ЕДТА. Након центрифугирања на 1000 рпм током 3 мин, ћелијска пелета је растворена у 150 μЛ 1 М НаОХ који садржи 10 процената ДМСО током 1 х на 60 степени током 1 х. Садржај меланина је одређен апсорбанцијом на 405 нм помоћу читача микроплоче.

Екстракт Цистанцхе инхибира меланин.

Одређивање активности ћелијске тирозиназе у ћелијама меланома.

Активност тирозиназе у ћелијама Б16Ф10 испитивана је на основу количине допахрома произведеног каталитичком реакцијом интрацелуларне тирозиназе.20 Укратко, ћелије меланома су култивисане у плочи са шест бунарчића 24 х, након чега је уследио третман са различитим концентрацијама екстракта Л.тхунбергианус или његовог растварача. фракције за још 48 у присуству 100 нМ -МСХ. После два пута испирања ледено хладним Д-ПБС, ћелије су лизиране у 200 μЛ пуфера за радиоимунопреципитацију (РИПА) (Сигма-Алдрицх) који садржи инхибиторе протеазе и фосфатазе. Након центрифугирања ћелијског лизата сакупљеног из сваке јажице на 15,000г током 15 минута, 100 μЛ супернатанта је помешано са 100 μЛ 1 мМ Л-ДОПА у ПБС (пХ 6,8), након чега је уследила инкубација 30 минута на 37 степени. . Апсорбанца допахрома је мерена на 475 нм помоћу читача за микроплоче. Подаци су нормализовани са концентрацијом протеина која је одређена тестом бицинхонинске киселине.

Изолација и карактеризација биоактивних једињења коришћењем ХПЛЦ.

ХПЛЦ је изведен на ИЛ{{0}} (Иоунг Лин Инструмент, Кореја), опремљеном ТЦ-Ц18 колоном (4,6 мм, 250 мм и 5 μм, Агилент, САД), инкоњукција са системом градијента који се састоји од растварача А (0.2 процента мравље киселине) и растварача Б (МеОХ). Однос растварача нагиба је постављен на 0−5 мин, 15 процената Б; 5−10 мин, 15−20 процената Б; 10−15 мин, 20−30 процената Б; 15−30 мин, 30−40 процената Б; 30−37 мин, 40−60 процената Б; 37−40 мин, 60−100 процената Б; 40−45 мин, 100 посто Б; 45−50 мин, 100−15 процената Б; и 50-55 мин, 15 процената Б. Да би се идентификовали састојци у фракцијама растварача, мобилна фаза је испоручена при брзини протока од 1 мЛ/мин, а детекција елуирања је спроведена на 330 нм. Да би се прикупиле инсолвентне фракције биоактивних састојака, мобилна фаза је испоручена брзином протока од 15,0 мЛ/мин, а детекција елуирања је спроведена на 330 нм коришћењем преп-ХПЛЦ (ИЛ-9100 с, Иоунг Лин Инструмент, Кореја ), опремљен преп-Ц18 колоном (4,6 мм, 212 мм, 10 μм, Агилент, САД), у комбинацији са градијентним системом који се састоји од растварача А (0,2 процента мравље киселине) и растварача Б (МеОХ). Однос растварача нагиба је постављен на 0-10 мин, 10 процената Б; 10-20 мин, 10-15 процената Б; 20−40 мин, 15 процената Б; 40−60 мин, 15−20 процената Б; и 60−70 мин, 30 процената Б.

Молецулар Моделинг.

Кристална структура печурке тирозиназе за молекуларно моделирање била је Агарицустиросинасе (ПДБ ради: 2И9Кс) добијена из Протеин ДатаБанк (ПДБ). Ензим је припремљен коришћењем процеса припреме протеина који је уграђен у Маестропрограм (Маестро, верзија 11.9.011, Сцхродингер, ЛЛЦ, НевИорк, НИ, УСА, 2019). Вода и сви остали молекули присутни у ПДБ датотекама су уклоњени. Молекуларно спајање је обављено коришћењем протокола за индуковано пристајање (ИФД) (Сцхродингер Суите 2019 Индуцед Фит Доцкинг протокол), као што је раније објављено.21

Способност хелатирања бакра.

Хелациона способност бакра једињења изолованих из Л. тхунбергианус одређена је према претходном извештају.22 Сваки дериват кафеоилхинске киселине (10 μЛ) у назначеној концентрацији помешан је са 280 μЛ 50 мМ натријум ацетатног пуфера (пХ 60). 6 μЛ раствора пирокатехол љубичице од 4 мМ припремљеног у истом пуферу и 10 μЛ 1 уг/μЛ ЦуСО4·5Х2О. Нестанак плаве боје је примећен мерењем апсорбанције на 632нм коришћењем СпецтраМак М5 мултимодног читача микроплоча. Као контрола уместо узорка коришћена је вода. Проценат активности хелирања бакра израчунат је из апсорбанције на 632 нм, што је како следи

Способност хелирања бакра ( проценат )=1− (Узорак/Контрола)×100 (2)

Статистичка анализа.

Сви подаци у овој студији изражени су као средња вредност ± стандардна девијација (СД) из три независна експеримента. Статистичке анализе су обављене коришћењем ГрапхПад Присм 8.0 (ГрапхПад Софтваре Инц., Ла Јолла, Калифорнија, САД). Разлике између средњих вредности контролне и изложене групе анализиране су једносмерном анализом варијансе (АНОВА) праћено Дунеттовим пост хоктестом. Праг статистичке значајности за све анализе био је п < 0.05="">

ЗАКЉУЧЦИ

У овој студији смо показали да екстракти Л. тхунбергианус уклањају АБТС радикале и испољавају снажан инхибиторни ефекат на биосинтезу меланина без значајне цитотоксичности. Абиоактивни састојак који постоји у Л. тхунбергианус и инхибира меланогенезу изолован је у фракцији н-БуОХ. Штавише, открили смо да су три деривата кафеоилхинске киселине главна једињења која постоје у фракцији н-БуОХ и да је 5-кафеоилкинска киселина важан састојак сузбијање меланогенезе у ћелијама меланома инхибирањем активности ћелијске тирозиназе. Овде смо изоловали инхибитор природног једињења 5-кафеоилхинску киселину из екстракта Л.тхунбергианус да бисмо спречили хиперпигментацију и открили његов механизам инхибиције који лежи у основи меланогенезе. Дакле, наши налази сугеришу да 5-кафеоилхинска киселина и фракција н-БуОХ изоловане из Л. тхунбергианус могу бити корисне у козметици као агенси за избељивање коже.

цистанцхе кришке