Фенилетаноидни гликозиди Цистанцхе Тубулоса индукују апоптозу у Еца-109 ћелијама путем пута који зависи од митохондрија
Mar 06, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
ЦХАНГСХУАНГ ФУ, ЈИНИУ ЛИ, АДИЛА АИПИРЕ, ЛИЈИЕ КСИА, ИИ ИАНГ, КИУИАН ЦХЕН, ЈИЕ ЛВ, КСИНХУИ ВАНГ и ЈИНИАО ЛИ
Апстрактан
Цистанцхе тубулосаима различите биолошке функције. У овој студији истражен је антитуморски ефекат фенилетаноидних гликозида Ц. тубулоса (ЦТПГ-В) растворљивих у води на рак једњака. Еца-109 ћелије су третиране ЦТПГ-В, а виталност ћелија је мерена МТТ тестом. Апоптоза, ћелијски циклус, потенцијал митохондријалне мембране (Δψм) и реактивне врсте кисеоника анализирани су проточном цитометријом. Нивои протеина у апоптотичким путевима откривени су Вестерн блот анализом. Утврђено је да ЦТПГ-В значајно смањује одрживост Еца-109 ћелија кроз индукцију апоптозе и заустављање ћелијског циклуса. Након третмана ЦТПГ-В, Δψм Еца-109 је значајно смањен, што је повезано са повишеним нивоима Б-ћелијског лимфома-2 (Бцл-2) повезаног са Кс и смањеним нивоима од Бцл-2. Сходно томе, повећани су нивои цитокрома ц и ц-Јун НХ2-терминалне киназе, што је повећало нивое цепане-поли (АДП-рибозе) полимеразе и цепане-капазе-3, {{18} } и -9, али не и каспаза-8. Сходно томе, нивои реактивних врста кисеоника у Еца{21}} ћелијама су показали значајне промене. Ови резултати су показали да ЦТПГ-В индукује апоптозу Еца-109 ћелија путем митохондријално зависног пута.
Увод
Рак једњака је један од најчешћих типова карцинома са 11. највећом стопом морбидитета и 6. највећом стопом морталитета у свету и проузроковао је смртност од ~439,000 у 2015. (1). Инциденција карцинома једњака значајно варира међу различитим регионима, при чему су источна Азија и источна и јужна Африка испољиле највише стопе инциденције, а западна Африка је имала најниже стопе у 2012. (1,2). У Кини, процењени случајеви рака једњака и смртност били су 477,000 и 375,000, респективно, 2015. године (3). Иако се стопа морбидитета од рака једњака смањила у земљама средњег и високог средњег социодемографског индекса између 2005. и 2015. године, стопа морталитета остаје висока због лоше прогнозе (1,4). Комбинација хируршке ресекције са хемотерапијом или радиотерапијом се користила за лечење карцинома једњака, међутим, пријављено је да је између 2003. и 2014. године 5-стопа преживљавања остала<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Традиционална кинеска биљна медицина (ЦХМ) се користила за лечење различитих типова рака, укључујући карцином плућа не-малих ћелија (6), колоректални канцер (7), хепатоцелуларни карцином (8). Недавно су клиничка испитивања објавила да комбинација ЦХМ са хемотерапијом или радиотерапијом не само да је показала бројне предности у погледу квалитета живота и ублажавања нежељених ефеката изазваних хемотерапијом или радиотерапијом (9,10), већ је такође побољшала стопу преживљавања пацијената. са карциномом плућа, јетре, желуца, дебелог црева, назофаринкса или грлића материце (9). Међутим, постоје опречни докази о ефикасности ЦХМ третмана на рак једњака (10,11). Бројне студије су утврдиле да бројни биљни лекови или компоненте могу инхибирати раст ћелија рака једњака ин витро и ин виво, укључујући Андрограпхис паницулата (12,13), Даикенцхуто (14), ицариин (15), Роса Рокбургхии Тратт и Фагопирум Цимосум (16), Јаридонин (17), Марсдениа тенациссима (18), ОП16 (нови ент-каурене дитерпеноид) (19), Кигесан (20) и Тонглиан децоцтион (21). Цистанцхе је врста ЦХМ и има различите биолошке функције, укључујући антиоксидацију, антиинфламацију и неуропротекцију (22,23). Наша претходна студија је то показалаЦистанцхе тубулоса фенилетаноидни гликозиди(ЦТПГ) би могао да потисне раст ћелија меланома Б16-Ф10 ин витро и ин виво (24). Међутим, лоша растворљивост ЦТПГ-а у води који је претходно коришћен ограничава развој лека (24). Због тога је коришћен ЦТПГ растворљив у води (ЦТПГ-В) и истражен је антитуморски ефекат на ћелије рака једњака (Еца-109). Утврђено је да ЦТПГ-В може дозно-зависно да инхибира виталност Еца-109 ћелија кроз индукцију апоптозе путем митохондријалног пута.
Материјали и методе Животиње.
Женке Ц57БЛ/6 мишева (6-8 недеља, ~25 г) купљене су од Пекиншког лабораторијског центра за истраживање животиња (Пекинг, Кина) и смештене у контролисаној температури (25˚Ц), са светлосним циклусом (12/ 12) Установа за животиње Универзитета Ксињианг (Урумћи, Кина). Све животиње су добиле воду и храну без патогена.
Ћелијска линија и култура. Ћелијска линија хуманог карцинома једњака (Еца-109) сачувана је у Кључној лабораторији за биолошке ресурсе и генетски инжењеринг у Синђијангу (Колеџ науке о животу и технологији, Универзитет Синђанг, Урумћи, Кина) и култивисана у РПМИ{{1} } медијум (Гибцо; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц., Валтхам, МА, САД) са додатком 10 процената топлотно инактивираног феталног говеђег серума (ФБС; МРЦ, ЕН МОАСАИ Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд, Јиангсу, Кина), 1 проценат Л -глутамин (100 мМ), 100 У/мл пеницилина и 100 µг/мл стрептомицина на 37˚Ц у влажној атмосфери која садржи 5 процената ЦО2.
Течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ). ЦТПГ-В (кат. бр. СГЈГ20170410) је купљен од Схангхаи Упбио Тецх Цо., Лтд. (Шангај, Кина). Главна једињења ЦТПГ-а су квалификована и квантификована помоћу ХПЛЦ према нашој претходној студији (24). Укратко, ХПЛЦ је спроведена на ЗОРБАКС СБ‑Ц18 колони (250к4,6 мм; 5 µм) на 30˚Ц и елуирана са 0,2 процентним раствором мравље киселине и градијентом метанола почевши од 23 процента, пошто је додаван 1 мл сваке минуте. током 45 минута док не достигне 31 проценат. Укупно 10 µл узорка је убризгано и детектовано на 330 нм. Стандард ехинакозида је купљен од Схангхаи Баобан Биотецх Цо., Лтд. (Шангај, Кина), а стандард актеозида је купљен од Сигма-Алдрицх (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка). Стандарди су коришћени за анализу компоненти ЦТПГ-В.
МТТ тест. Пролиферација ћелија је мерена МТТ тестом. Еца{{0}} ћелије су инокулисане у 96-плоче са бунарима у густини од 5к103 ћелије у 100 µл РПМИ{{5 }} медијум/бунарић и култивисан на 37˚Ц током 24 х, затим третиран различитим концентрацијама (0, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В или 0,4 процента диметил сулфоксида (ДМСО) током 24, 48 и 72 ч. ДМСО је коришћен као контрола растварача (800 µг/мл ЦТПГ-В који садржи 0,4 процента ДМСО). Цисплатин (20 µг/мл) је коришћен као позитивна контрола. Након тога, супернатант је одбачен након центрифугирања на 225 кг током 5 минута на собној температури, а 100 µл МТТ раствора (0,5 мг/мл у РПМИ-1640 медијуму без ФБС) је додат у сваки бунар и инкубиран на 37˚Ц за 3 х. Формирани кристали формазана су растворени у 200 ул ДМСО. Вредности оптичке густине (ОД) мерене су на таласној дужини од 490 нм помоћу 96-читача микроплоча (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, Калифорнија, САД). Релативна виталност ћелија је израчуната према формули: Вијабилност ћелије ( проценат )=(ОДтретирано/ОДнетретирано)к100 процената. Морфологија Еца‑109 ћелија је посматрана инвертованим флуоресцентним микроскопом (увећање, к200) (Никон Ецлипсе Ти‑Е; Никон Цорпоратион, Токио, Јапан).
За пролиферацију спленоцита, мишеви Ц57БЛ/6 су еутаназирани дислокацијом грлића материце, а слезине су изоловане. Једноћелијска суспензија је направљена и спленоцити су засејани у 96-плоче са бунарима у густини од 1к105 ћелија/бунарићу у 100 µл РПМИ-1640 медијума, а затим третирани различитим концентрацијама (0, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В током 24, 48 и 72 х на 37˚Ц са 5 процената ЦО2. Пролиферација спленоцита је мерена МТТ тестом, према горе поменутом протоколу. Стимулаторни индекс=ОДтреатед/ОДунтреатед.
Мерење апоптозе и ћелијског циклуса. Еца{{0}} ћелије су култивисане у посудама од 60 мм при густини од 2,5к105 ћелија по посуди током 24 сата и третиране различитим концентрацијама ({{31} }, 200, 400, 600 и 800 µг/мл) ЦТПГ-В или 0,4 процента ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5 процената ЦО2. Ћелије су сакупљене и обојене комплетом за откривање апоптозе Анексин В-флуоресцеин изотиоцијаната (ФИТЦ)/пропидијум јодида (ПИ) (Схангхаи Схенгсхенг Биотецхнологи Цо., Лтд., Шангај, Кина), према протоколима произвођача. Узорци су сакупљени проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур; БД Биосциенцес, Франклин Лакес, Њ, САД) и анализирани помоћу ФловЈо 7.6 (Трее Стар, Инц., Асхланд, ОР, САД). Да би се анализирао ефекат ЦТПГ-В на ћелијски циклус, 2,5к105 Еца-109 ћелије су засејане у посуде за културу од 60 мм и третиране са ЦТПГ-В (0, 100, 200 и 400 µг/мл) или 0,4 проценат ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5 процената ЦО2. Све ћелије су сакупљене и испране два пута ледено хладним ПБС (Гибцо; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.), затим фиксиране у 70% ледено хладном етанолу на 4˚Ц током 30 мин. После два пута испирања са ледено хладним ПБС, ћелије су ресуспендоване у 300 µл ПИ/РНасе пуфера за бојење (БД Биосциенцес, Сан Јосе, ЦА, УСА) током 10 минута на собној температури. Дистрибуција ћелијског циклуса је анализирана помоћу софтвера МодФит ЛТ 3.0 помоћу проточне цитометрије (БД ФАЦСЦалибур).
Анализа потенцијала митохондријалне мембране (Δψм) и реактивних врста кисеоника (РОС). За анализу Δψм, Еца{{0}} ћелије су третиране са ЦТПГ-В (0, 400, 600 и 800 µг/мл) или 0,4 процента ДМСО током 24 х на 37˚Ц са 5 процената ЦО2, и обојен комплетом за анализу потенцијала митохондријалне мембране са ЈЦ-1 (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи, Шангај, Кина), према протоколу произвођача, 20 минута на 37˚Ц . Након два пута испирања са ЈЦ-1 пуфером за испирање (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), узорци су ресуспендовани са 300 µл ЈЦ‑1 пуфера за испирање и анализирани проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур). Флуоресценција ЈЦ-1 боје у Еца-109 ћелијама је такође примећена помоћу инвертованог флуоресцентног микроскопа (увећање, к200; Никон Ецлипсе Ти-Е). За анализу РОС-а, Еца{21}} ћелије су третиране ЦТПГ-В (0, 400, 600 и 800 µг/мл) током 2, 4, 6, 12 и 24 х и обојене реактивним врстама кисеоника Комплет за тестирање (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), према протоколу произвођача, 20 минута на 37˚Ц. Након три пута испирања ледено хладним ПБС-ом, узорци су сакупљени проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур) и анализирани софтвером ФловЈо 7.6.
Активност уклањања радикала 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (ДППХ). Активност уклањања слободних радикала ЦТПГ-В одређена је ДППХ тестом слободних радикала према објављеном протоколу уз мању модификацију, пошто је метанол замењен етанолом да би се растворио ДППХ (25,26). За мерења у стабилном стању, 150 µл ДППХ (100 ммол/л) у етанолу је помешано са различитим концентрацијама ЦТПГ-В (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 и 600 µг/мл) у 50 µл ПБС, и инкубирано у мраку 30 минута на собној температури. Апсорбанца на 517 нм је детектована у присуству и одсуству ЦТПГ-В. Као позитивна контрола коришћено је укупно 50 µл витамина Ц. Активност уклањања радикала ДППХ израчуната је помоћу формуле: Чишћење ( проценат )=[1-(Узорак-Абланк)/А0] к100, где је Абланк апсорбанца контроле (без ДППХ), Узорак је апсорбанца узорка, а А0 је апсорбанца ПБС са ДППХ.
Вестерн блот анализа. Еца{{0}} ћелије су третиране са ЦТПГ-В (0, 200, 600 µг/мл) или 0,4 процента ДМСО током 24 сата на 37˚Ц са 5 процената ЦО2. Следеће прање два пута са ПБС, ћелије су лизиране у пуферу за лизу радиоимунопреципитације (Беијинг ЦомВин Биотецх Цо., Лтд., Пекинг, Кина) током 20 минута на леду. Након центрифугирања на 10,000 кг током 10 минута на 4˚Ц, супернатанти су сакупљени, а концентрације протеина су детектоване помоћу комплета за бицинхонинску киселину (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц.) у складу са протоколима произвођача. Вестерн блот анализа је спроведена према нашем претходном опису (24). Антитела против каспазе-7 (каталошки број Д120077), каспазе{19}} (каталошки број Д155240), каспазе{21}} (каталошки број Д220078), Б-ћелијског лимфома{ {24}} (Бцл-2)-повезани Кс (Бак) (кат. бр. Д220073) и Бцл-2 (кат. бр. Д260117), и анти-мишји ИгГ-пероксидаза рена (ХРП) ) (кат. бр. Д111050) и анти-зечји ИгГ-ХРП (кат. бр. Д110058) набављени су од ББИ Лифе Сциенцес (Шангај, Кина). Антитела против каспазе-3 (кат. бр. Е-АБ-10050) и активне каспазе-3 (кат. бр. Е-АБ-22115) су купљена од Елабсциенце ( Вухан, Кина). Друга антитела против каспазе-7 (кат. бр. 9492), поли (АДП-рибоза) полимеразе (ПАРП) (кат. бр. 9542), цитохрома ц (кат. бр. АЦ909), ц-Јун НХ{ {48}}терминална киназа (ЈНК) (кат. бр. 9252С) и -актин (кат. бр. 58169) добијени су од Целл Сигналинг Тецхнологи, Инц. (Данверс, МА, САД). Сва примарна и секундарна антитела су разблажена у односу 1:1,000. Примарна антитела су инкубирана на 4˚Ц преко ноћи, а секундарна антитела су инкубирана на 37˚Ц током 1 х.
Циљни протеини су детектовани коришћењем комплета за испитивање побољшане хемилуминисценције (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи), према протоколу произвођача.
Статистичка анализа. Статистички значај је израчунат једносмерном анализом варијансе са Тукеијевим пост хоц тестом, а резултати су анализирани коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 5.0 (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, Калифорнија, САД) између третиране и контролне групе. Сви подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Цистанцхе тубулоса фенилетаноидни гликозиди(ЦТПГ)
Резултати
ЦТПГ‑В потискује раст Еца‑109 ћелија. Компоненте ЦТПГ-В су квалификоване и квантификоване помоћу ХПЛЦ (слика 1), које су упоређене са стандардима ехинакозида и актеозида. Према временима вршног задржавања и површинама пикова, ЦТПГ-В је садржао 39,16 процената ехинакозида и 2,44 процената актеозида. Прво, ефекат ЦТПГ-В на виталност Еца-109 ћелија је одређен МТТ тестом. ЦТПГ-В је растворен у ДМСО на 200 мг/мл и разблажен РПМИ-1640 медијумом који садржи 10 процената топлотно инактивираног ФБС до назначених концентрација. Еца-109 ћелије су третиране ЦТПГ-В и виталност ћелија је анализирана МТТ тестом у назначеним временским тачкама. Третман ЦТПГ-В значајно је смањио виталност Еца{17}} ћелија на начин који зависи од дозе и времена (П<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
ЦТПГ-В индукује апоптозу у Еца-109 ћелијама. Да би се истражило да ли је ЦТПГ-В потиснуо раст Еца-109 ћелија путем индукције апоптозе или некрозе, ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В. После 24 х, апоптоза и некроза Еца-109 ћелија су откривене бојењем Анексином В/ПИ. Као што је приказано на слици 3А, ћелије Анексина В-/ПИ плус су затворене као некротичне ћелије, а Анексин В плус /ПИ плус и Анексин В плус /ПИ- ћелије су затворене као апоптотичке ћелије. ЦТПГ-В је првенствено индуковао апоптозу Еца-109 ћелија на начин зависан од дозе, иако су се некротичне Еца{12}} ћелије такође значајно повећале под третманом 600 и 800 µг/мл ЦТПГ-В (П<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
ЦТПГ-В индукује заустављање ћелијског циклуса у С фази у Еца-109 ћелијама. Поремећај циклуса ћелија рака ће потиснути раст ћелија и промовисати апоптозу (27). Дистрибуција ћелијског циклуса у Еца-109 ћелијама је откривена ПИ бојењем након ЦТПГ-В третмана током 24 х. Уочено је да су се ћелије у С фази повећале и да су ћелије у Г0/Г1 фазама показале укупан значајан пад након третмана ЦТПГ-В (П<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
ЦТПГ‑В смањује Δψм и индукује ослобађање цитокрома ц. Апоптоза се може индуковати митохондријално зависним путем (28,29). Про- и анти-апоптотички чланови породице БЦЛ-2 протеина играју важну улогу у регулацији интегритета митохондријалне мембране (30,31). Након третмана ЦТПГ-В током 24 сата, Δψм је процењен коришћењем бојења ЈЦ-1. ЈЦ‑1 агрегат (црвена флуоресценција откривена у ФЛ‑2) ће се распасти у мономер (зелена флуоресценција откривена у ФЛ-1) када се Δψм смањује (32). Као што је приказано на слици 5А, фреквенције ФЛ-1 плус ФЛ-2-/ плус ћелија су се значајно повећале на начин који зависи од дозе, што указује да се Δψм ћелија Еца-109 смањио. Промене флуоресценције у ћелијама Еца-109 су такође примећене помоћу инвертованог флуоресцентног микроскопа (слика 5Б). Са повећањем концентрације ЦТПГ-В, црвена флуоресценција се смањила, а зелена повећала, што је у складу са подацима из проточне цитометрије. Такође је примећено да је ниво цитокрома ц у цитосолу значајно повећан (слика 5Ц), што је резултат смањења Δψм. Ово потврђује закључак извучен из повећаног броја ФЛ-1 плус ФЛ-2-/ плус ћелија да се Δψм смањио као резултат третмана ЦТПГ-В. Пријављено је да ЈНК може да регулише активацију породице протеина БЦЛ-2 изазивајући ослобађање цитохрома ц (33-35). Такође је утврђено да је ниво ЈНК значајно повећан након третмана ЦТПГ-В (Слика 5Ц). Резултати су показали да ЦТПГ-В може индуковати апоптозу Еца-109 ћелија путем пута који зависи од митохондрија.
Ефекат ЦТПГ-В на интрацелуларно генерисање РОС. РОС би могао да смањи Δψм да изазове апоптозу (36). Да би се истражило да ли ЦТПГ-В може да повећа производњу РОС, Еца-109 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-В. Ћелије су сакупљене у назначеним временским тачкама и обојене са ДЦФХ-ДА. Производња интрацелуларних РОС у Еца-109 ћелијама одређена је проточном цитометријом. Као што је приказано на слици 6А, 800 µг/мл ЦТПГ-В значајно је повећало производњу РОС од 2-6 х и смањило се са 12-24 х. Поред тога, 400 µг/мл ЦТПГ-В значајно повећава производњу РОС-а од 12-24 х. Штавише, 200 µг/мл ЦТПГ-В није значајно променио производњу РОС. Динамичке промене производње РОС могу бити повезане са апоптозом Еца{15}} ћелија. Такође је утврђено да ЦТПГ-В има активност уклањања слободних радикала (слика 6Б), што може бити повезано са смањеном производњом РОС у Еца-109 ћелијама третираним са 800 µг/мл ЦТПГ-В после 12 х.
ЦТПГ-В појачава активност каспазе-3, каспазе-7, каспазе-9 и ПАРП. Ослобађање цитохрома ц услед редукције Δψм могло би да активира протеазе каспазе да изазову апоптозу (29,30,37). Након третмана ЦТПГ-В током 24 х, активација каспазе-3, 7, 8, 9 и ПАРП је откривена Вестерн блот анализом. У поређењу са контролном, нивои цепљене каспазе-9, цепане каспазе-7, цепане каспазе-3 и цепане-ПАРП, али не и нивоа цепане каспазе{{ 20}}, су регулисани ЦТПГ третманом на начин који зависи од дозе (слика 7). Ови резултати су показали да ЦТПГ-В смањује Δψм и подстиче ослобађање цитокрома ц да активира каспазе које индукују апоптозу Еца-109 ћелија.
Екстракт Цистанцхе тубулоса
Дискусија
Традиционални ЦХМ би могао индуковати апоптозу ћелија рака једњака кроз различите путеве, укључујући рецепторе екстринзичне смрти, интринзичне путеве стреса митохондрија и ендоплазматског ретикулума (29). Наша претходна студија је показала да ЦТПГ, као главна компонента Ц. тубулоса, инхибира раст ћелија меланома Б16-Ф10 путем индукције апоптозе путем митохондријалног пута (24). У овој студији, истражен је антитуморски ефекат ЦТПГ-В на Еца-109 ћелије и утврђено је да ЦТПГ-В потискује раст Еца-109 ћелија, изазива апоптозу и заустављање ћелијског циклуса, смањен Δψм, повећано ослобађање цитокрома ц и активиране каспазе. ЦТПГ и ЦТПГ-В могу изазвати апоптозу и заустављање ћелијског циклуса у ћелијама рака. Међутим, тачни механизми су различити због различитих компоненти ЦТПГ-а (26,64 процената ехинакозида, 10,19 процената актеозида и 1,71 процената изоактеозида) и ЦТПГ-В (39,16 процената ехинакозида и 2,44 процената актеозида). ЦТПГ је зауставио Б16-Ф10 ћелије у Г0/Г1 фазама, али ЦТПГ-В је зауставио Еца-109 ћелије у С фази (24). Производња РОС-а је дозно-зависно повећана ЦТПГ-ом, али је указивала на промену на временски зависан начин високом дозом ЦТПГ-В, која се значајно повећала на почетку третмана ЦТПГ-В (2-6 х) и значајно се смањио након 12 х, у поређењу са контролом. Могући разлог је тај што је главна компонента ЦТПГ-В ехинакозид. Бројне студије су известиле да ехинакозид може да инхибира производњу РОС и апоптозу изазвану РОС да би показао своје неуропротективне ефекте и ефекте против старења (38-40). Слично, у овој студији примећена је активност уклањања слободних радикала. Стога се спекулисало да би неке компоненте, укључујући вербаскозид, изо-вербаскозид и салидрозид у високој дози ЦТПГ-В, могле одмах да изазову стварање РОС-а да изазову апоптозу Еца-109 ћелија (41,42), а затим РОС је уклоњен ехинакозидом. Други могући разлог за разлике у производњи РОС од стране ЦТПГ и ЦТПГ-В је тај што су различите ћелијске линије коришћене у овој и претходној студији (24). Донг и сарадници (43) су известили да ехинакозид може да индукује апоптозу хуманих ћелија колоректалног карцинома СВ480 кроз стварање оксидативних оштећења ДНК без повећања нивоа РОС.
Третман ЦТПГ-В смањио је Δψм и изазвао ослобађање цитокрома ц, који промовише цепање каспазе-9 (28). Конзистентно, нивои цепане каспазе-9 су били повећани ЦТПГ-В третманом. Након тога, активна каспаза-9 може да активира каспазу-3 да изазове апоптозу (44). Нивои цепане каспазе-3 су такође повећани ЦТПГ-В третманом. Међутим, каспаза-8 није активирана од стране ЦТПГ-В, што указује да пут екстринзичног рецептора смрти није био укључен у апоптозу изазвану ЦТПГ-В. Ова запажања указују на то да ЦТПГ-В индукује апоптозу Еца-109 ћелија кроз активацију митохондријалног пута.
ПАРП има важну улогу у геномској стабилности и може се цепати активним каспазама, посебно каспазом-3 и -7 (45). Утврђено је да третман ЦТПГ-В активира каспазу-3 и -7, који могу да цепају ПАРП да инхибирају поправку ДНК и изазову апоптозу.
ЦТПГ-В такође, зависно од дозе и времена, потискује раст ћелија хуманог хепатоцелуларног карцинома БЕЛ-7404 (необјављени подаци). Иако ЦТПГ-В инхибира раст Еца-109 и БЕЛ-7404 ћелија, он промовише пролиферацију спленоцита, што може бити последица садржаја полисахарида (~50 процената) у ЦТПГ-В (46 ). Слично томе, бројне студије су известиле да полисахариди могу да подстичу пролиферацију спленоцита (46-49). У моделу миша, утврђено је да ЦТПГ-В значајно повећава индекс слезине, у поређењу са контролном групом, али није утицао на телесну тежину и индексе других органа укључујући срце, јетру, бубреге и плућа (необјављени подаци), што указује да ЦТПГ-В нема цитотоксични ефекат на нормалне ћелије.
Подаци су заједно показали да ЦТПГ-В инхибира раст Еца-109 ћелија индукцијом апоптозе путем митохондријално зависног пута.
цистанцхе предности: анти-апоптоза
Признања
Аутори желе да се захвале др Јианхуа Ианг (Баилор Цоллеге оф Медицине) за полирање рукописа.
Финансирање
Ова студија је подржана од стране 13. Петогодишњег плана за подношење понуда за кључне дисциплине у области биологије (грант бр. 17СДКД0202), Синђанг Нормални универзитет и Кључна лабораторија за примену и регулацију биодиверзитета посебне животне средине у Синђангу (грант бр. КСЈТСВЗ-2017-04) ЈЛ и Грант Кинеске националне фондације за природне науке (грант бр. 31760260) за КСВ.
Доступност података и материјала
Подаци и материјали коришћени и анализирани током ове студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.
Прилози аутора
ЦФ, АА, ИИ и КЦ су извели експерименте. ЛКС, ЈЛв и КСВ анализирали су податке и припремљене бројке. ЈиниуЛ и ЈиниаоЛ су дизајнирали пројекат и написали рукопис.
Етичко одобрење и сагласност за учешће
Све експерименте на животињама одобрио је Комитет за етику експеримената на животињама Кључне лабораторије за биолошке ресурсе и генетски инжењеринг у Синђангу (одобрење, бр. БРГЕ-АЕ001; Универзитет Синђијанг).
Сагласност пацијената за објављивање
Није применљиво.
Такмичарски интереси
Аутори изјављују да немају супротстављене интересе.
Референце
Ву ЦР, Лин ХЦ и Су МХ: Преокрет воденимекстракти Цистанцхе тубулосаод дефицита понашања у моделу пацова налик Алцхајмеровој болести: Релевантност за таложење амилоида и функцију централног неуротрансмитера. БМЦ Цомплемент Алтерн Мед 14: 202, 2014.
Ли Ј, Аспире А, Гао Л, Хуо С, Луо Ј и Зханг Ф:Фенилетаноид гликозиди из Цистанцхе тубулосаинхибира раст Б16-Ф10 ћелија и ин витро и ин виво индукцијом апоптозе путем пута који зависи од митохондрија. Ј Рак 7: 1877-1887, 2016.
Бранд-Виллиамс В, Цулвер МЕ и Берсет Ц: Употреба методе слободних радикала за процену антиоксидативне активности. ЛВТ-Фоод Сци Тецхнол 28: 25-30, 1995.
