Коњугат дендример-тесаглитазар индукује фенотипски помак микроглије и појачава -амилоидну фагоцитозу† Део 1

Пребацивање микроглије из стања које погоршава болест, 'про-инфламаторно' у неуропротективни, 'антиинфламаторни' фенотип је обећавајућа стратегија за решавање вишеструких неуродегенеративних болести.

Микроглија је врста ћелије у централном нервном систему која је првенствено одговорна за одржавање здравља и функције неурона. Они могу лучити различите факторе раста и неуротрофне факторе и могу одржавати нормалну метаболичку активност неурона чишћењем отпадних материјала око неурона. Истраживања последњих година су показала да је микроглија уско повезана са памћењем. Хајде да то заједно погледамо.

Прво, микроглија може стимулисати неуроне и промовисати активацију неурона, чиме се побољшава памћење. Ослобађањем низа неуротрансмитера, као што су глутамат и аланин, микроглија може да унапреди пренос сигнала између неурона и може да побољша резонанцију сигнала глија-неурона између пресинаптичких мембрана, даље промовишући неуронску ексцитабилност и формирање меморије.

Друго, микроглија такође може очистити отпад око неурона, одржати нормалну метаболичку активност неурона и смањити смртност неурона, чиме се промовише побољшање памћења. Када се превише смећа акумулира око неурона, то ће утицати на нормалну метаболичку активност неурона, што доводи до смрти неурона и ослабљене функције, чиме се смањује перформансе памћења. Мицроглиа може да одржи нормално метаболичко окружење неурона и смањи смртност неурона гутањем и разлагањем околног отпада, чиме се побољшава памћење.

Укратко, микроглија је блиско повезана са памћењем. Промовишући узбуђење неурона и чишћење околног отпада, микроглија може додатно побољшати памћење и одржати наш мозак здравим и активним. Треба обратити пажњу на заштиту здравља микроглије да бисмо постигли боље памћење. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе може значајно побољшати памћење јер је Цистанцхе традиционални кинески медицински материјал са много јединствених ефеката, од којих је једно побољшање памћења. Ефикасност Цистанцхеа потиче од различитих активних састојака које садржи, укључујући танинску киселину, полисахариде, флавоноидне гликозиде, итд. Ови састојци могу унапредити здравље мозга на различите начине.

Кликните на сазнајте 10 начина за побољшање меморије

Проинфламаторна микроглија доприноси прогресији болести ослобађањем неуротоксичних супстанци и убрзавањем акумулације патогених протеина. Показало се да оба агониста ППАР и ППАР мењају микроглију са проинфламаторног („М1-лике“) до алтернативно активираног („М2-лике“) фенотипа. Такве стратегије су истражене у клиничким испитивањима за неуролошке болести, као што су Алцхајмерова и Паркинсонова болест, али вероватно нису успеле због лошег продирања крвно-мождане баријере (БББ).

Показало се да полиамидоамински дендримери са хидроксил-терминисаним (без везивања циљаних лиганда) прелазе оштећени БББ на месту неуроинфламације и акумулирају се у активираној микроглији.

Стога, коњугација дендримера ППАР/дуалног агониста може омогућити циљано пребацивање фенотипа активиране микроглије. Овде представљамо синтезу и карактеризацију новог коњугата дендример-ППАР/дуалног агониста (Д-тесаглитазар).

Ин витро, Д-тесаглитазар индукује промену фенотипа 'М1 у М2', смањује секрецију реактивних врста кисеоника, повећава експресију гена за фагоцитозу и ензимску деградацију патогених протеина (нпр. -амилоида, -синуклеина) и повећава -амилоидну фагоцитозу.

Ови резултати подржавају даљи развој Д-тесаглитазара у правцу превођења за вишеструке неуродегенеративне болести, посебно Алцхајмерову и Паркинсонову болест.

Увод

Само у Сједињеним Државама тренутно има преко 5,3 милиона људи са Алцхајмеровом болешћу (АД) и 1 милион људи са Паркинсоновом болешћу (ПД).1 Како је повећана старост највећи фактор ризика за многе неуродегенеративне болести, преваленција и цена лечења ових болести наставиће да се повећава како становништво наставља да стари.

Штавише, недостатак недавног успеха у развоју нових лекова за лечење ових болести је истакао потребу за развојем иновативних терапија.2,3 Ови клинички неуспеси наглашавају потешкоће у развоју лека, укључујући испоруку довољне концентрације лека у мозак ради ефикасности без изазивајући нежељене нежељене ефекте.

Неуродегенеративне болести као што су АД и ПД деле три главне неуропатолошке компоненте: неуроинфламацију, акумулацију патогених протеина и неуронску смрт.4–7 Код нездравих људи, урођена имунолошка ћелија мозга (темикроглија) константно фагоцитира погрешно савијене протеине (нпр. -амилоид, -синуклеин). ) који узрокују смрт неурона док се производе, што спречава формирање карактеристичних агрегата.

Међутим, код људи који на крају развију неуродегенеративне болести, микроглија више не уклања ове протеине ефикасно и прелази у проинфламаторни фенотип који погоршава болест (обично означен као М1).

Док је претежно проинфламаторна/антиинфламаторна (М1/М2) класификација микроглијалне активације превелико поједностављење спектра поларизације макрофага, она се још увек користи као широка номенклатура за описивање доминантног фенотипа микроглије у неуроинфламацији и одговору на терапију.

Микроглија попут М1- ослобађа реактивне врсте кисеоника и друге инфламаторне медијаторе који истовремено индукују неуроналну смрт и погоршавају патологију болести повећањем производње патогених протеина (нпр. -амилоида, -синуклеина).

Штавише, главни генетски фактори ризика за развој АД (ТРЕМ2 и АПОЕ) су изражени на високим нивоима у микроглији, а показало се да пут ТРЕМ2/АПОЕ изазива промену амикроглијалног фенотипа у АД, амиотрофичну латералну склерозу (АЛС) и мултиплу склерозу. животињски модели.8

Ови налази даље показују улогу микроглије у патологији више људских неуродегенеративних болести. Приступ да се манипулише фенотипом микроглије омогућио би истраживачима да схвате њихову улогу у неуродегенеративним болестима, осим што би потенцијално могао бити ефикасан терапеут.

Пребацивање микроглије са М1 на антиинфламаторни и неуропротективни (М2) фенотип је предложено као терапијска стратегија за лечење вишеструких неуродегенеративних болести.5,6 Показало се да су два ППАР агониста тренутно одобрена од стране ФДА, лекови за дијабетес типа ИИ росиглитазон и пиоглитазон. Промена фенотипа М1 у М2 у макрофагима и микроглијама ин витро и ин виво.

Показало се да агонисти 9,10 ППАР смањују лучење реактивних врста кисеоника изазвано ЛПС-ом смањењем активности НФ-κБ изазивањем НФ-κБ деградације и извоза из језгра, као и трансрепресије зависне од лиганда.11

Штавише, епидемиолошке студије су показале да пацијенти са дијабетесом који узимају росиглитазон или пиоглитазон имају смањен ризик од развоја АД и ПД.12 Након тога, росиглитазон и пиоглитазон су истражени кроз клиничка испитивања фазе ИИИ за АД, али нису успели.13

Једно вероватно објашњење за неуспех горе поменутих клиничких испитивања је лош транспорт ових лекова кроз крвно-мождану баријеру (БББ), чиме се ограничава број лекова који су доспели до мозга пацијената укључених у ова клиничка испитивања.14

Заиста, процењује се да БББ спречава око 98% свих лекова малих молекула да дођу до мозга, а само део лека који уђе у мозак достигне микроглију.15

Поред тога, ППАР је још један нуклеарни рецептор у породици ППАР.16 Он показује улогу у хомеостази липида и регулисању упале, а такође је показано да ППАР агонисти испољавају антиинфламаторне ефекте у микроглијама.

Клиничке студије које су користиле неуроимагинг, пост-мортем анализу ткива и биомаркере ЦСФ пружиле су доказе да је БББ оштећен код АД и ПД, као и код других неуродегенеративних болести.

Показало се да дендримери 17 генерације-4 хидроксил-терминираних полиамидоамина (Г4-ПАМАМ-ОХ) суштински заобилазе оштећени БББ и акумулирају се у активираној микроглији без потребе за циљањем лиганда, након системске примене у више различитих модела неуроинфламаторне болести , укључујући глодаре, зечеве, псе и нељудске примате.18–28 Значајно је да се Г4-ПАМАМ-ОХ може системски применити и прећи преко БББ код модела болести са благим поремећајем БББ као што је Ретов синдром.29

Поред тога, степен узимања Г4-ПАМАМ-ОХ у мозак је директно пропорционалан озбиљности болести код модела церебралне парализе зеца.30 Дендримери са хидроксилним крајем имају предност што се испоручују неинвазивно у поређењу са високо инвазивним, локалним уношењем путем лобања потребна у претходним студијама са другим наночестицама као што су поли-εкапролактон и ПЕГ, негативно наелектрисани ПАМАМ дендримери, квантне тачке и наноформулације састављене од полиетиленимина (ПЕИ) и декстран сулфата.31–35

Поред тога, ови хидроксил ПАМАМ дендримери су идеално позиционирани за транслацију због своје скалабилности и добро подношљивог ин виво безбедносног профила.36–38 Због позитивних претклиничких података о ефикасности, а (Г4-ПАМАМ-ОХ)-Н- Коњугат ацетил-цистеин се тренутно процењује у раним клиничким испитивањима за церебралну адренолеукодистрофију у детињству (НЦТ03500627) и тешке упале повезане са корона вирусом 2019 (ЦОВИД-19) (НЦТ04458298).

Проучавали смо коњугат дендример-лек тесаглитазара (Теса) везан за генерацију-4 ПАМАМдендримера са хидроксил-терминацијом. Тесаглитазар је моћан ППАР/двоструки агонист који комбинује корисне ефекте ППАР и ППАР агониста. Садржи функционалну групу карбоксилне киселине за ковалентну коњугацију са дендримером и за накнадно ослобађање.

Додатне гитаре су развијене и клинички тестиране, али је Теса изабрана због њеног већег односа ППАР према ППАР активности, релативно једноставне хемијске структуре и безбедносног профила.39–43

Теса је раније достигла фазу ИИИ клиничких испитивања дијабетеса типа 2 у Сједињеним Америчким Државама, али није успела због токсичности зависне од дозе, која се може спречити смањењем неопходне дозе примене контролисаном испоруком дендримера.39,40,44 Пошто је Теса ППАР/двоструки агонист, његова циљана испорука активираној микроглији на месту неуроинфламације могла би бити од велике користи.

Овде демонстрирамо синтезу и карактеризацију коњугата дендример-тесаглитазар (Д-Теса) и демонстрирамо способност овог једињења да индукује промену фенотипа 'М1 до М2' у микроглији и појача фагоцитозу флуоресцентно обележеног -амилоида.

Материјали и методе

Материјали

1-[3-(Диметиламино)пропил]-3-етил карбодиимид метиодид (ЕДЦ), 4(диметиламино)пиридин (ДМАП), ЦуСО4·5Х2О, натријум аскорбат, хексинска киселина и албумин говеђег серума (БСА) су купљени од Сигма Алдрицх УС и коришћени као примљени (Ст Луис, МО).

Тесаглитазар је набављен од АстаТецх Инц. (Бристол, ПА). ПАМАМ дендример са етилендиаминским језгром (генерација 4 са 64 хидроксилне крајње групе) је примљен од Дендритецх Инц. (Мидланд, МИ) као раствор у метанолу.

Дендример је чуван у метанолу на 4 степена и метанол је упарен пре употребе. Дијализна мембрана са граничном молекулском тежином (МВЦО) од 1 кДа је купљена од Спецтрум Лабораториес Инц. (Њу Брунсвик, Њ).

Сви остали растварачи су коришћени како су примљени у њиховим анхидрованим облицима. Све реакције, осим бакар(И), катализоване алкин-азидне циклоадиције (ЦуААЦ) клик реакције, спроведене су у анхидрованим условима у органском медијуму са стакленим посуђем сушеним у пећници под инертним азотом атмосфера.

За ћелијску културу: Дулбеццо-ов модификовани орлов медијум (ДМЕМ), фетални бовинесерум (ФБС), пеницилин-стрептомицин (П/С), 0.05% трипсин-ЕДТА и МТТ реагенс добијени су од Инвитроген-а (Карлсбад, Калифорнија , САД).

Гриессов реагенс је добијен од Промега (Мадисон, ВИ), а ТНФ-ЕЛИСА је добијен од Р&Д Системс (Миннеаполис, МН). Метанол аналитичког квалитета је купљен од Сигма-Алдрицх. Трипанско плаво је добијено од компаније Цорнинг (Манассас, ВА, САД).

Поступци синтезе за Д-Теса коњугате
Тетраетилен гликол моноазид (2) је синтетизован коришћењем претходно објављеног протокола.45

Синтеза и пречишћавање Теса-ТЕГ-азида (3).
Теса (950 мг, 2.32 ммол) је растворена у 10 мл диметилформамида (ДМФ). Овом мешаном раствору, кап по кап је додат тетраметилен гликол моно-азид (2, 662,1 мг, 3,02 ммол) у ДМФ (1 мл). ДМАП (255.4 мг, 2.09 ммол) и ЕДЦ (577.5 мг, 3.02 ммол) су затим додати у реакциону смешу, и реакција је мешана под азотом на собној температури током 24 сата.

Реакција је праћена коришћењем танкослојне хроматографије и течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ). Реакциона смеша је разблажена са 100 мл дихлорометана (ДЦМ) и сирова реакциона смеша је премештена у левак за одвајање, а органски слој је затим испран три пута са засићеним раствором натријум бикарбоната, а затим са засићеним раствором амонијум хлорида и на крају са сланим раствором.

Органски слој је затим осушен са анхидрованим натријум сулфатом. Растварач у органском слоју је затим уклоњен помоћу ротационог испаривача, а раствор је поново растворен у 3 мл ДЦМ и апсорбован на силика гел да би се пречистио помоћу ЦомбиФласх® хроматографског система коришћењем методе градијента са етил ацетатом/хексаном као растварачима да би се добио бистар 3ас. -жуто уље.

Жељени, чисти производ се елуира на приближно 30-40% етил ацетата. (Принос: 70%) 1Х НМР (500 МХз, ЦДЦл3) 5 7,27 (д, Ј=8.6 Хз, 2Х), 7,15 (д, Ј=1,9 Хз, 2Х), 7,08 (д, Ј=8.6 Хз, 2Х), 6,73 (д, Ј=8,6 Хз, 2Х), 4,25–4,14 (м, 2Х), 4,07 (т, Ј {{ 33}}.8 Хз, 2Х), 3.94 (дд, Ј =7.8, 5.2 Хз, 1Х), 3.67–3.47 (м, 14Х), 3.30 (дд, Ј=8.7 , 3,8 Хз, 2Х), 3,06 (с, 3Х), 3,02 (т, Ј=6,7 Хз, 2Х), 2,91–2,84 (м, 2Х), 1,08 (т, Ј=7 .0 Хз, 3Х).ЕСИ-МС: теоријски Ц28Х39Н3О10С: 609,24, добијено (М + 1): 610,13.

Синтеза и пречишћавање Д-ИНЕ (5).

(480 мг, 4,22 ммол) је додат у мешани раствор Г4-ПАМАМ-ОХ (2,5 г, 0,176 ммол) у 20 мл анхидрованог ДМФ. У ову смешу су додати ДМАП (430 мг, 3,52 ммол) и ЕДЦ (1 г, 5,28 ммол).

Реакциона смеша је мешана уз пречишћавање азотом 24 сата на собној температури. По завршетку реакције, реакциона смеша је пребачена у епрувету за дијализу од 1000 МВЦО. ДМФ дијализа је изведена током 24 сата, а ДМФ се мењао отприлике сваких шест сати.

Затим је изведена дијализа са дејонизованом (ДИ) водом током 24 сата, при чему се вода мењала отприлике сваких шест сати. На крају, резултујући садржај епрувете за дијализу је лиофилизован током 48 сати, дајући бели, пахуљасти прах. (Принос: 61%). 1Х НМР (500 МХз, ДМСО) δ 8,10–7,67 (м, дендримерини интерни амид Х), 4,72 (с), 4,72 (с). површина дендримера ОХ), 4,01 (т, естар –ЦХ2), 3,32 (м, дендример –ЦХ2), 3,06 (м, дендримеранд линкер –ЦХ2), 2,85–2,58 (м, дендример –ЦХ2), 2,56–1,89 (м, дендример и линкер –ЦХ2), 1,78–1,61 (м, линкер –ЦХ2).Синтеза и пречишћавање Д-Тесе (6).

Теса-ТЕГ-азид (3,177,8 мг, 0.3{{10}}3 ммол) је додат у мешану мешавину Д-ИНЕ(5, 35{{2{{27} }}} мг, 0,023 ммол) у 5 мл 1:1 мешавине тетрахидрофурана (ТХФ) и воде са 0,5 мл ДМФ-а у бочици од 20 мл која је безбедна за микроталасни реактор. За ЦуААЦ клик реакцију, бакарсулфат пентахидрат (11,6 мг, 0,0467 ммол) и (+)-натријум-ласкорбат (9,3 мг, 0,0467 ммол) су додати у реакциону смешу.

Бочица је запечаћена, а реакциони суд је затим стављен у микроталасни реактор Биотаге® Инитиатор и реагован под микроталасним зрачењем од 20 В уз мешање током 8 сати на 50 степени. Реакциона смеша је пребачена у епрувету за дијализу од 1000 МВЦО и ДМФ дијализа је изведена током 24 сата, при чему је ДМФ замењен свежим растварачем отприлике свака 4 сата.

Затим је садржај епрувете за дијализу пребачен у епрувету афалцон и додата је еквивалентна количина ДИ воде. Додатно, 200 µл раствора динатријумове соли етилендиаминтетрасирћетне киселине је додато садржају соко епрувете.

Ова смеша је затим стављена у нову дијализну епрувету од 1000 МВЦО и дијализа је изведена 12 сати у 1000 мл ДИ воде са додатком раствора ЕДТА, након чега је уследила дијализа у води током 12 сати.

Смеша је затим лиофилизована 48 сати и резултирала је белим, пахуљастим прахом. (Принос: 64%) 1Х НМР (500 МХз, ДМСО) δ 8,2–7,6 (м, дендример интернамид Х), 7,36 (д, Теса АрХ), 7,21 (д, Теса АрХ), 7,03 (д, ТесаАрХ), 6,76 (д, Теса АрХ), 4,37 (с, Теса Х), 4,18–4,04 (м, линкер Х), 3,96 (дд, Теса и линкер Х), 3,70 (м, Теса и линкер Х) ,3,58–3,14 (м, дендример –ЦХ2), 3,14–2.86 (м, дендример–ЦХ2), 2,87–2,49 (м, дендример и линкер –ЦХ2), 2,25 (м, дендример –ЦХ2) , 1,82–1,67 (м, линкер –ЦХ2), 0,97 (т, Теса –ЦХ3).

Технике карактеризације

Нуклеарна магнетна резонанца (НМР). НМР спектри су снимљени на Брукер 500 МХз спектрометру на собној температури. Хемијски помаци протона (δ) су приказани у ппм.

1Х НМР је коришћен за одређивање броја Теса молекула везаних за сваки молекул Д-Теса методом интеграције протона, упоређивањем пикова унутрашњих амидних протона дендримера на δ 7,6–8,2 ппм са ароматичним протонима Теса при δ 7,36 ппсм од 7,36 ппм и 6. Теса у алифатском региону. Течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ).

Коришћен је ХПЛЦ (Ватерс Цорпоратион, Милфорд, Массацхусеттс) опремљен бинарном пумпом 1525, Ин-Лине дегассер АФ, 717 плус аутосамплер, 2998 фотодиодни низ детектор, и 2475 мулти λфлуоресценцијски детектор повезан са софтвером Ватерс Емповер.

Коришћена је колона са реверзном фазом Симметри Ц18 (Тосох, Јапан) величине честица од 5 μм, дужине 25 цм и унутрашњег пречника 4,6 мм. Једињења су праћена на 210 нм и 254 нм помоћу ПДА детектора.

Растварач А испран ХПЛЦ вода са 0.1% трифлуоросирћетне киселине (ТФА), а растварач Б је био ацетонитрил (АЦН) са 5% воде и 0.1% ТФА. Коришћена метода је почела у 1{ {7}}0 : 0 (АЦН: вода), смањен на 10: 90 (вода: АЦН) за 5 минута, остао на том поларитету 15 минута и вратио се на 100 : 0 (АЦН: вода) за 5 минута.Брзина протока је одржавана на 1 мл мин−1.Масена спектроскопија.

ЕСИ-МС је изведен на БрукермицроТОФ-ИИ масеном спектрометру коришћењем ацетонитрила/воде (9:1) као система растварача. Молекуларни јони као протонирани пикови [М + нХ]н+ или адукти [М + нКс]н+ (Кс=На, К или НХ4) коришћени су за потврду емпиријске формуле.

Динамичко расејање светлости и ζ-потенцијал. Зетасизер НаноЗС (Малверн Инструмент Лтд, Ворцхестер, УК) опремљен са а50 мВ Хе–Не ласером (633 нм) је коришћен за одређивање величине честица и расподеле ζ-потенцијала. Д-Теса је растворен у ДИ води до концентрације од 0.2 мг мл-1 за ДЛС и у 10 мМ натријум хлорида до концентрације од 0,1 мг мл-1 за ζ-потенцијал.

Мерења су извршена на 25 степени, користећи угао расејања од 173 степена као што је претходно описано.27,46 Студија ослобађања лека. Д-Теса је растворен у концентрацији од 1 мг мл-1 или у раствору фосфатног пуфера (пХ 7,4) који су опонашали услове плазме или раствор натријум цитрата (пХ 5,5) да би се опонашали услови лизозома.

Естеразе из свињске јетре (из Сигма Алдрицх) додане су у раствор натријум цитрата на почетку студије ослобађања и допуњаване су отприлике свака 3 дана током студије.

Свака бочица је садржала узорак од 15 мл и они су непрекидно мућкани на 37 степени током трајања експеримента. У различитим временским тачкама, сакупљени су дупли узорци од 200 µл из сваког пХ и активност естеразе је накнадно угашена додавањем 200 µл метанола. Као контрола послужили су узорци у временској тачки од нултог сата.

Узорци су чувани на -80 степени да би се даље избегла било каква хидролиза. Узорци су даље анализирани помоћу ХПЛЦ и израчуната је површина испод криве (на 210 нм) за пик слободног лека. Подручје испод криве је у корелацији са количином ослобођеног лека коришћењем калибрационе криве где су познате концентрације слободне Теса тестиране на ХПЛЦ на 210 нм.

For more information:1950477648nn@gmail.com