Коњугат дендример-тесаглитазар индукује фенотипски помак микроглије и појачава амилоидну фагоцитозу† 3. део

Д-Теса је повећао експресију ензима одговорних за уклањање патогених протеина

Ензим за разградњу инсулина (Иде) и матрикс металопротеаза 9 (ММП9) су ензими које луче микроглија и који разграђују екстрацелуларни -амилоид и -синуклеин.71,72 Третман Д-Теса значајно је повећао експресију Иде 3.1- пута (п < 0.001) са трендом ка повећању експресије ММП9 (1.8-повећавање, п=0.057) у поређењу са контролама које су третиране само ЛПС (Слике 6А и Б).

Последњих година све више студија показује да постоји блиска веза између ензима који разграђују инсулин и памћења. Ово откриће нам пружа вредне трагове за даље истраживање механизма формирања и одржавања памћења.

Ензим за разградњу инсулина је важан ензим, чија је главна функција да разгради инсулин како би одржао равнотежу шећера у крви. Међутим, недавне студије су показале да ензим који разграђује инсулин не игра само метаболичку улогу, већ директно утиче на раст и поправку неурона у мозгу и игра важну улогу у одржавању памћења.

Многе студије су показале да што је већи ниво ензима који разграђује инсулин, то је боље памћење. То је зато што ензими који разграђују инсулин могу да подстичу раст и поправку неурона, чиме се побољшавају способност учења и памћења мозга. Поред тога, ензими који разграђују инсулин могу такође да промовишу везу између неурона, чиме се побољшава повезаност и задржавање памћења.

Важна улога ензима који разграђују инсулин у памћењу се широко користи у области клиничке медицине. Истраживачи су открили да удисањем ензима који разграђују инсулин, не само да се може побољшати памћење, већ се могу побољшати и когнитивне способности и симптоми депресије.

Укратко, веза између ензима који разграђују инсулин и памћења је веома важно поље, које нам пружа вредне трагове за проучавање биолошког механизма памћења. Будућа истраживања ће даље истраживати функцију и улогу ензима који разграђују инсулин, помоћи ће нам да боље разумемо механизам формирања и складиштења меморије и обезбедиће бољу основу за побољшање способности учења и памћења људског мозга. Види се да треба да побољшамо памћење, а Цистанцхе може значајно да побољша памћење јер Цистанцхе може да регулише и равнотежу неуротрансмитера, као што је повећање нивоа ацетилхолина и фактора раста који су веома важни за памћење и учење. Поред тога, Цистанцхе такође може побољшати проток крви и промовисати испоруку кисеоника, што може осигурати да мозак добије довољну исхрану и енергију, чиме се побољшава виталност и издржљивост мозга.

Кликните на сазнајте начине да побољшате своје памћење

Бесплатна Теса је значајно повећала експресијуИде 2-пут (п=0.011), а незнатно повећала ММП92-пут (п=0.35) (слика 6А и Б). М2 микроглија код неуродегенеративних болести може уклонити -амилоид, -синуклеин и друге патогене протеине путем ензимске деградације или фагоцитозе, а Д-Теса појачава регулацију протеина укључених у ове процесе (тј. Иде и ММП9).71–73

Идеекспресија је смањена у АД и ПД патологији и познато је да је појачана ППАР агонистима, што је у складу са нашим резултатима.

71,72 Функционално, показало се да само 2-путоструко повећање нивоа Иде смањује акумулацију -амилоида и неуронску смрт ин виво.74,75 Према томе, 3-путоструко повећање Иде које је приметио Д-Теса, и 2-путоструко повећање Иде од стране фрееТесе може бити терапеутски ефикасно ин виво.

Д-Теса повећава фагоцитозу -амилоида

ЦД36 је микроглијални рецептор за хватање који олакшава фагоцитозу и разградњу -амилоида.73 Његова регулација у АД доводи до смањеног уклањања -амилоида, али се појачава активацијом ППАР-а.

И Д-Теса и бесплатна Теса значајно повећавају нивое експресије ЦД36 у поређењу са ћелијама изложеним само ЛПС (п < 0.0001 наспрам п < 0,005 за Д-Тесу и слободну Тесу , респективно), али је Д-Теса била много ефикаснија од слободне Теса (6- пута повећање у односу на 2.8- пута повећање за Д-Теса и слободну Теса, респективно, п < 0,0005) (слика 6Ц ).

Наши резултати су у складу са претходним студијама са пиоглитазоном (другим агонистом ППАР) које су показале да се повећана микроглијална фагоцитоза -амилоида јавља преко ППАР и ЦД36-зависног механизма.73

Да бисмо истражили да ли је повећање регулације ЦД36 од Д-Тесатреатмент-а у корелацији са повећаном фагоцитном способношћу ових ћелија, извршили смо тест функционалне фагоцитозе -амилоида. 73

Укратко, након третмана ћелија као што смо урадили у претходним ин витро тестовима, применили смо флуоресцентно обележен -амилоид1–42 на ћелије два сата, испрали ћелије, а затим извршили проточну цитометрију да бисмо истражили степен ћелијског преузимања -амилоида. Д-Теса је повећао и проценат ћелија које су фагоцитовале -амилоид и просечну количину -амилоида интернализованог по ћелији (Слике 7А и Б).

Насупрот томе, слободна Теса није дала побољшања у фагоцитози -амилоида. Врхунски ефекти Д-Тесе у поређењу са Теса-ом се вероватно могу приписати побољшаној ћелијској интернализацији омогућеној коњугацијом дендримера.

Ово је у складу са претходним радом који је показао да је преко 95% БВ2 ћелија третираних флуоресцентно обележеним Г4-ПАМАМ-ОХ интернализовало дендример у року од тридесет минута и наставило да интернализује дендример најмање 24 сата.76

Слично томе, коњугација малог молекула миноциклина са флуоресцентно обележеним Г4-ПАМАМ-ОХ показала је да је 99% БВ2 ћелија интернализовало флуоресцентно обележени коњугат дендример–лек у року од 3 сата.26 Такође су показали да коњугат смањује супериорне нивое азотоксида бесплатном леку након третмана БВ2 ћелија са ЛПС, у складу са нашим резултатима.

Ћелије третиране са Д-Тесапхагоцитосед 19-пут више -амилоида него ЛПС-третиране контролне ћелије (п < 0.001), што је упоредиво са 2.5- пута повећањем -амилоидне фагоцитозе примарних микроглијалних ћелија пацова третираних пиоглитазоном о којима су извештавали Иаманака и сарадници.73 Нешто већи степен -амилоидне фагоцитозе у претходној студији могао би бити или због тога што нису заједно лечили своје ћелије са ЛПС-ом као што смо ми, или зато што примарна микроглија експримује ППАР на виши ниво од БВ2 ћелија коришћених у овој студији.77

Као таква, доза Д-Теса нижа од оне процењене из ин витро експеримената у нашој студији вероватно може бити ефикасна ин виво студија и људи, пошто је познато да ћелије БВ2 експримирају ППАР на нижим нивоима од примарне микроглије.77

Микроглија је умешана у многе неуродегенеративне болести, а БББ је спречио многе лекове који могу да модификују фенотип микроглије од проинфламаторног, неуротоксичног М1 фенотипа у антиинфламаторни, неуропротективни М2 фенотип да достигну терапеутске нивое у мозгу. 14,15

На пример, два ППАР агониста, пиоглитазон и росиглитазон, испитани су кроз клиничка испитивања фазе ИИИ за Алцхајмерову болест због њихове способности да мењају фенотип микроглије, али вероватно нису успели због лошег транспорта кроз БББ.13,14 Дакле, постоји клинички интерес да се промени фенотип микроглије код неуродегенеративних болести.

Такав приступ захтева испоруку лека у микроглију на довољним нивоима да изазове одговор. У том циљу, показало се да Г4-ОХ-ПАМАМ дендримери испоручују лекове у микроглију на многим животињским моделима након системске ињекције, и као резултат тога, тренутно се процењују у клиничким испитивањима за лечење ццТЛД (НЦТ03500627) и тешког ЦОВИД-а -19 удружена инфламација (НЦТ04458298).18–28

Да бисмо комбиновали благотворне ефекте промене микроглијалног фенотипа са способношћу да испоруче лекове у микроглију, коњуговали смо тесаглитазар (ППАР/двоструки агонист) са Г4-ОХ-ПАМАМдендримером (сл. 1–3). Показали смо да је Д-Теса способна да промени фенотип М1 микроглије према М2 фенотипу (Слике 4 и 5), што доводи до смањења лучења штетних реактивних врста кисеоника.

Штавише, показали смо да микроглија третирана са Д-Тесом повећава експресију ензима који разграђују патолошке протеине као што су -синуклеин и -амилоид, као и да регулишу фагоцитозу -амилоида у функционалном тесту (Слике 6 и 7).

Иако не представљамо податке који показују способност Д-Тесе да заобиђе БББ и акумулира у микроглији, раније смо показали да Г4-ОХ-ПАМАМ коњугати лека са сличним оптерећењем леком, величином и зета потенцијалом могу да прођу кроз оштећен БББ и акумулација инмикроглије након интравенске примене.26,36,52

Ови резултати подржавају даљи развој Д-Тесе за лечење вишеструких неуролошких болести. Док се у овом раду фокусирамо на Алцхајмерову и Паркинсонову болест, Д-Теса има потенцијал за клиничко превођење више неуролошких поремећаја. Због сличне улоге микроглије у патологији вишеструких неуродегенеративних болести, ППАР агонист пиоглитазон је такође истражен орис који се тренутно истражује у клиничким испитивањима фазе ИИ за Паркинсонову болест,78 АЛС,79 адреномијелонеуропатију(НЦТ03864523), мултиплу склерозу310Н888 резолуција код интрацеребралног крварења (НЦТ00827892).

Ако ова клиничка испитивања такође не успеју због лоше испоруке пиоглитазона преко БББ, Д-Теса би могла да превазиђе ову препреку испоруке и лечи пацијенте са овим болестима.

Друге групе су користиле наночестице да побољшају испоруку агониста ППАР до макрофага, али нису покушале да испоруче ове агонисте у микроглију. Осински и сарадници су показали да су липозоми напуњени Теса-ом углавном преузимани од стране макрофага у висцералној белој масти у мушком моделу гојазности са недостатком лептина.80

Они су додатно показали да липозоми напуњени Теса нису променили експресију М1 маркера Мцп-1, али су повећали експресију М2 маркера Арг1, док је третман са слободном Теса смањио укупан број М1 макрофага и експресију Мцп{{6 }}, и није повећао израз Арг1.

Накасхиро ет ал. коришћене поли(млечна-ко-гликолна киселина) (ПЛГА) наночестице за испоруку пиоглитазона (ППАР агониста) до макрофага у контексту атеросклерозе.81

Ин виво, они су показали да ПЛГА-пиоглитазон смањује нивое имуних ћелија у крви. Примарни макрофаги добијени из коштане сржи третирани ЛПС и интерфероном, открили су да ПЛГА-пиоглитазон повећава ИЛ-4 и ИЛ-10 (М2 маркере) и да не смањује нивое ИЛ-6 или ТНФ.

Њихови налази су слични нашим; М2 маркери су повећани третманом агониста наночестица-ППАР, док нивои ИЛ-6 и ТНФ-а нису смањени. Ди Масцоло и др. користио наночестице ПЛГА-поливинил алкохола за испоруку росиглитазона (још један ППАР агонист).82

Ин витро су показали да њихови комплекси наночестица-лек смањују експресију иНОС, ТНФ- и ИЛ-1 у макрофагима који потичу из коштане сржи. Они су претходно третирали своје ћелије леком наночестица пре стимулације ЛПС-ом, док смо ми претходно третирали ћелије ЛПС-ом пре третмана са Д-Тесом, што би могао бити разлог да нисмо приметили смањење ТНФ- и ИЛ-1, иако смо такође приметили смањење експресије иНОС-а.

Закључак

Тренутно не постоји терапија која мења патологију за многе неуродегенеративне болести, а како становништво наставља да стари, преваленција и трошкови лечења ових болести ће наставити да расту, наглашавајући хитну потребу за развојем решења. Недавно су проинфламаторне М1 микроглије критичне у патологији вишеструких неуродегенеративних болести.

Последично, могућност да се лек испоручи преко крвно-мождане баријере који може да изазове промену фенотипа 'М1 до М2' у микроглији има терапеутски потенцијал за више болести, посебно за Алцхајмерову и Паркинсонову болест.

Д-Теса је дизајнирана да испоручи лек 'М1 до М2' који индукује микроглију након системске примене да би се смањило микроглијално лучење неуротоксичних супстанци, истовремено изазивајући антиинфламаторно стање које повећава деградацију и фагоцитозу патогених протеина у мозгу. Успешно смо синтетизовали Д-Тесу користећи високо ефикасан приступ хемији кликова.

Лек је везан за дендример преко естерске везе која се може цепати интрацелуларно у лизозомским условима, при чему се приближно 60% Теса ослобађа у првих 48 сати под лизозомским условима.

Показало се да је Д-Теса боља од Теса ин витро у изазивању промене М1 у М2а/М2б/М2цфенотип, што је резултирало смањеном секрецијом азотног оксида, повећаном експресијом ензима -синуклеина и -амилоида и повећаном фагоцитозом -амилоида.

Дакле, Д-Теса комбинује корисна својства испоруке дендримера, са својствима пребацивања М1 на М2 Теса. Због заједничке улоге микроглије и заједничке терапеутске користи изазивања промене фенотипа М1 у М2, Д-Теса има потенцијал да лечи многе неуролошке поремећаје када се примењује у правој фази прогресије болести.

Прилози аутора

ЛД, АС, КЛ, РС, СК и РМК су конципирали експерименте. ЛД, АС и РС су извршили синтезу и карактеризацију коњугата дендример–лек. ЛД, КЛ и ЈЈ су извели експерименте са ћелијама. ЛД андК. Статистику је извршио Л. ЛД и АС су написали рукопис, а сви аутори су уредили рукопис.

Сукоби интереса

РМК и СК су ко-проналазачи коришћења дендримера са хидроксилним крајем за циљану испоруку у микроглију код неуролошких болести, као и патенте који се односе на технологију дендримера описану у овом раду.

Они су суоснивачи компанија Асхваттха Тхерапеутицс, Орпхерис Инц. и РиниСигхт Инц., које су компаније које воде клинички развој платформе. СК и РМК су чланови одбора АсхваттхаТхерапеутицс Инц. РС је тренутно запослен у АсхваттхаТхерапеутицс и посједује дионице у компанији; тхе воркР. С. извео за овај лист је урађен пре него што се придружио Ашватти. Сукобом интереса управља Универзитет Џон Хопкинс.

Признања

Желели бисмо да се захвалимо Елизабетх Смитх Кхоури на корисним дискусијама о ин витро експериментима. Овај пројекат је финансирао Патз Дистингуисхед Профессорсхип Ендовмент из ЈохнсХопкинса и НИЦХД-а (број гранта ХД076901) (РМК). Захваљујемо се Вилмеровом основном гранту за истраживање вида, микроскоп и основни модул (број гранта ЕИ001865) за приступ Сони проточном цитометру.

Захваљујемо Сервиер Медицал Артс-у на коришћењу њихове колекције слика (хттп://смарт.сервиер.цом/) која је лиценцирана под Цреативе Цоммон Аттрибутион 3.0 ГенерицЛиценсе, која је модификована да направи графички сажетак.

Референце

1 ЦЛ Гооцх, Е. Працхт и АР Боренстеин, Терет неуролошке болести у Сједињеним Државама: сажети извештај и позив на акцију, Анн. Неурол., 2017, 81, 479–484.

2 ЈЛ Цуммингс, Т. Морсторф и К. Зхонг, цевовод за развој лекова за Алцхајмерову болест: мало кандидата, чести неуспеси, Алцхајмерова рез. Тхер., 2014, 6, 37.

3 П.-П. Лиу, И. Ксие, Кс.-И. Менг и Ј.-С. Канг, Историја и напредак хипотеза и клиничких испитивања за Алцхајмерову болест, Сигнал Трансдуцтион Таргетед Тхер., 2019, 4, 1–22.

4 Ц. Сото и С. Притзков, Погрешно савијање протеина, агрегација и конформациони сојеви код неуродегенеративних болести, Нат. Неуросци., 2018, 21, 1332–1340.

5 ВХ Перри и Ц. Холмес, Мицроглиал приминг ин неуродегенеративе дисеасе, Нат. Рев. Неурол., 2014, 10, 217–224.

6 И. Танг и В. Ле, Дифферентиал Ролес оф М1 анд М2 Мицроглиа ин Неуродегенеративе Дисеасес, Мол. Неуробиол., 2016, 53, 1181–1194.

7 МВ Салтер и Б. Стевенс, Мицроглиа се појављује као централни актер у болести мозга, Нат. мед., 2017, 23, 1018–1027.

8 С. Красеманн, ет ал., ТРЕМ2-АПОЕ пут покреће транскрипцијски фенотип дисфункционалне микроглије код неуродегенеративних болести, имунитет, 2017, 47, 566–581.е9.

9 К. Зхао, ет ал., Ефекти пиоглитазона слични антидепресивима у моделу миша са хроничним благим стресом повезани су са ППАР-посредованом променом фенотипа микроглијалне активације, Ј. Неуроинфламматион, 2016, 13, 259.

10 Л. Вен, ет ал., Поларизација микроглије на фенотип М2 на начин који је зависан од гама рецептора активираног пролифератором пероксизома смањује аксоналну повреду изазвану трауматском повредом мозга код мишева, Ј. Неуротраума, 2018, 303030303030234.

11 В. Цаи, ет ал., Рецептор активиран пролифератором пероксизома (ППАР): Главни чувар капије код повреда и поправке ЦНС-а, Прог. Неуробиол., 2018, 163–164, 27–58.12 Б. Бракедал, ет ал., Употреба глитазона повезана са смањеним ризиком од Паркинсонове болести, Мов. Дисорд., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com