Дихидрокверцетин ублажава неуроинфламацију изазвану ЛПС-ом и недостатак памћењаⅠ

АПСТРАКТАН

Дихидрокверцетин (ДХК) је пентахидроксифлванон који се користи као важан додатак против упале и неуроинфламације узроковане оксидативним стресом. Неуроинфламација је активација одбрамбеног механизма централног нервног система, након излагања стимулансима као што су амилоид, Левијева тела, липополисахарид (ЛПС) и реактивне врсте кисеоника. Важан је патофизиолошки посредник неколико неуродегенеративних поремећаја, укључујући Алцхајмерову болест, Паркинсонову болест, мултиплу склерозу и друге.

Цлицк то цистанцхе тубулоса меморијски додатак

Циљ ове студије је да се процени неуропротективни ефекат ДХК, снажног антиоксидантног молекула, против неуроинфламације изазване ЛПС-ом. Првог дана експеримента (дан -1), неуроинфламација је изазвана интрацеребровентрикуларном ињекцијом ЛПС-а (5 уг/5 ул) у сваку бочну комору код пацова. ДХК0.5, 1 и 2 уг/кг су убризгавани у репну вену у одговарајућим групама од дана-2 до дана-10. Студије понашања су показале да је ДХК ублажио губитак дуготрајне и радне меморије изазван ЛПС-ом, што је процењено помоћу повишеног плус лабиринта и И-лавиринт теста, респективно.

Даље, биохемијске процене су откриле да ДХК зависно од дозе смањује смањење нивоа ацетилхолина изазвано ЛПС-ом и повећава активност ацетилхолин-естеразе у региону хипокампуса. ДХК је такође повећао активност каталазе и смањио азот оксид и пероксидацију липида измењену ињекцијом ЛПС.

ДХК је такође ослабио интерлеукин-6 у мозгу, који је порастао након индукције ЛПС. Смањење ИЛ-6 се приписује његовој антиоксидативној активности. Дакле, ДХК би могао бити потенцијални терапеутски кандидат у управљању неуроинфламацијом и сродним неуродегенеративним поремећајима.

1. Представљање

Неуроинфламација је феномен активације одбрамбеног механизма у централном нервном систему против разних стимулуса (Моралес ет ал., 2015). Он је важан патофизиолошки медијатор већине неуродегенеративних поремећаја укључујући Алцхајмерову болест, Паркинсонову болест, мултиплу склерозу и друге (Лиман ет ал., 2014; Моралес ет ал., 2015). Разни стимуланси укључују амилоид, Левијева тела, липополисахариде (ЛПС) и реактивне врсте кисеоника (РОС), који су кључни медијатори неуроинфламације (Лее ет ал., 2008; Стреит ет ал., 2004).

ЛПС је успостављен модел за проучавање односа између неуроинфламације и когнитивног понашања (Трипатхи ет ал., 2017). Такође се наводи да ЛПС изазива понашање налик анксиозности код модела мишева и пацова (Басси ет ал., 2012; Савигнац ет ал., 2016). Иако тачна патофизиологија неуроинфламације ЛПС-ом није у потпуности позната, један од механизама је активација НФκБ посредована рецептором сличним наплати (ТЛР)- 4, који је фактор транскрипције за многе проинфламаторне цитокине (Схих ет. ал., 2015). Важан механизам за неуроинфламацију помоћу ЛПС-а је оштећење ћелија услед стварања реактивних врста кисеоника (РОС) и активације цитокина (Хсу и Вен, 2002).

ЛПС индукује активацију астроцита и микроглије у ЦНС-у и даље повећање експресије ИЛ-6 (Ванг ет ал., 2015). ИЛ-6 је растворљиви медијатор са плеиотропним ефектом на упалу, имуни одговор и хематопоезу и сматра се маркером неуроинфламације када је присутан у ЦНС-у (Беурел и Јопе, 2009). ЛПС изазива неуродегенерацију и дефекте у учењу и памћењу (Схав ет ал., 2001). Доказано је да и мускарински и никотински ацетилхолински рецептори играју улогу у учењу понашања и консолидацији памћења путем дуготрајне потенцираности (ЛТП) (Хасселмо, 2006).

Према холинергичкој хипотези, губитак холинергичке функције у ЦНС-у је значајно повезан са падом памћења, а инхибитори ацетилхолин естеразе су кључни лекови за лечење симптома повезаних са деменцијом код Алцхајмерове болести (Давиес, 1985). Неуроинфламација је критично укључена у неуродегенеративне поремећаје; међутим, конвенционални антиинфламаторни лекови, као што су нестероидни антиинфламаторни лекови, дали су мешовите резултате, а њихови токсични ефекти нису решени (Воодлинг и Андреассон, 2016). Стога постоји потреба да се истраже новији лекови за потенцијални третман неуроинфламаторних поремећаја.

Различити природни производи показују обећавајуће резултате против оксидативног стреса и неуроинфламације, укључујући карнозин (Царусо ет ал., 2019), хедерагенин (Ванг ет ал., 2020) и ресвератрол (Зханг ет ал., 2013). Дихидрокверцетин (ДХК) је моћан антиоксиданс флавоноид који се налази у луку, француској поморски кори, млечном чичку и кори Дагласове јеле (Веидманн, 2012).

Утврђено је да има неуропротективни ефекат на ћелије неуронске културе пацова које су оштећене оксидативним стресом (Док-Го ет ал., 2003). Пријављено је да побољшава експериментални фулминантни хепатитис код мишева изазваног конкавалином-А и повећану експресију хем оксигеназе-1 (ХО-1) преко митоген-активиране протеин киназе/нуклеарног фактора еритроидног 2-повезаног 2 (МАПК/Нрф2) антиоксидативни пут у РАВ264 ћелијским линијама макрофага (Зхао ет ал., 2015).

Такође се показало да ДХК инхибира церебралну исхемију-реперфузиону повреду код пацова супресијом инфилтрације леукоцита и инхибицијом циклооксигеназе-2 и експресије индуцибилне синтазе азот-оксида (Ванг ет ал., 2006). ДХК је такође ослабио апоптозу изазвану инхибицијом протеазома у ПЦ12 ћелијама потискивањем активације митохондријалног пута и каспазе-8 и путева зависних од Бид антиоксидативним деловањем (Нам ет ал., 2015). Стога смо сматрали да би било мудро проценити анти-неуроинфламаторну активност ДХК-а јер поседује моћну антиоксидативну активност.

Стога је циљ ове студије да се процени потенцијални анти-неуроинфламаторни ефекат ДХК (0.5, 1 и 2 уг/кг) у моделу ЛПС код пацова. Функционална анализа ДХК третмана је урађена проценом церебралног крвотока и тестовима понашања за радну и дугорочну меморију, осим ефеката сличних анксиозности, коришћењем И-лавиринт и повишеног плус лавиринт теста, респективно. Ниво активности ацетилхолина (АЦх) и ацетилхолин естеразе (АЦхЕ) је истражен у региону хипокампуса да би се додатно проценило учење и памћење. Антинеуроинфламаторна активност ДХК је процењена проценом експресије ИЛ-6.

2. Материјал и методе

2.1. Експерименталне животиње

Инбред албино Вистар мужјаци пацова тежине (260 20 г) набављени су из Централ Анимал Хоусе; Институт за медицинске науке (ИМС-БХУ). Експерименти су изведени усвајањем смерница (публикација НИХ 85–23, ревидирана 2011) и одобрена од стране Институционалног етичког комитета за животиње, Банарас Хинду универзитета (БХУ; Деан/2015/ЦАЕЦ/ 1420). Животиње су аклиматизоване недељу дана у експерименталној лабораторији пре почетка експеримената.

2.2. хемикалије

Дихидрокверцетин (Дисто-Пхармацеутицалс, Индија), ЛПС (Е. цоли, Л3129), албумин говеђег серума и Грисов реагенс набављени су од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). тиобарбитурна киселина (ТБА), НАДХ, натријум сукцинат, натријум азид, феназин метансулфонат (ПМС) и нитро плави тетразолијум (НБТ) купљени су од Мерцка (Дармстадт, Немачка). Све остале хемикалије и реагенси течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ) и аналитичког квалитета су набављени од локалних добављача.

2.3. Експериментални поступак

Шематски приказ експерименталног распореда је приказан на Сл. 1. ЛПС је убризган интрацеребровентрикуларно (ИЦВ) коришћењем стереотаксијског апарата (Стоелтинг, САД). Пацови су анестезирани натријум пентобарбитоном; ип 45 мг/кг (Трипатхи ет ал., 2017). Животиња је фиксирана на стереотаксични оквир, скалп пацова је урезан, а брегма је постављена на скалп пацова. Све координате су постављене од брегме (0, 0) и избушене 0,8 мм позади од брегме, 1,5 мм латерално од сагиталног шава и 3,8 мм испод површине мозга (Хаусс-Вегрзиниак ет ал., 1998).

ЛПС је даван свим групама осим лажне употребом Куинтессентиал Стереотакиц Ињецтор. ЛПС раствор је убризган у сваку од бочних можданих комора у концентрацијама од 1 уг/ул, брзином од 1 ул/мин током 5 минута са периодом чекања од 5 минута између две ињекције. Шам група је такође била изложена операцији, а убризгаван је само физиолошки раствор (возило). Сви резултати лажне групе нису се значајно разликовали од контролне групе, тако да група није даље укључена. Да бисмо ограничили локалну инфекцију, након шивања реза, примењивали смо бетадин (раствор јода) до дана-5, а 1 мл нормалног физиолошког раствора је убризган интраперитонеално да би се спречила дехидрација код животиња (Јангра ет ал., 2021) .

Пацови су пажљиво праћени током периода опоравка и држани у просторији на 22–26 Ц. Ово се сматрало као дан-1, а након 24 х, након појаве симптома неуромоторне дисфункције, лекови су давани свакодневно. за девет дана. Сви тестови понашања су обављени на дан-10 и снимљени помоћу АНИ-МАЗЕ праћења понашања верзије 4.72 (САД). Животиње су затим одмах убијене декапитацијом, а ткива хипокампуса су микродисекована (Пакинос и Цхарлес, 2006). Ткива мозга су чувана на 80 Ц до даљих механичких студија.

2.4. Примене лека

ДХК је прво растворен у 10 ул етанола, а затим је запремина допуњена нормалним физиолошким раствором да би се добила концентрација од 1 мг/мл. Концентрација етанола у убризганом раствору била је мања од 0.001 проценат (в/в) и иста концентрација искључујући ДХК је примењена контролној групи носача. Раније је пријављено да ДХК ублажава церебралну исхемију-реперфузију повреду код пацова кроз свој антиоксидативни ефекат и модулацију активације НФкБ у дози од 0,1 и 1,0 уг/кг, интравенски (ИВ) дневно (Ванг ет ал., 2006).

Због тога смо спровели пилот студију за процену дозе ДХК ИВ и финализирали три дозе ДХК {{0}}.5 уг/кг, 1 уг/кг и 2 уг/кг. Пратећи принцип рандомизације, груписање је извршено узимајући по девет животиња у свакој групи на следећи начин: (а) Контрола, (б) ЛПС (ц) ЛПС þ ДХК 0,5 уг/кг, (д) ​​ЛПС þ ДХК 1 уг/кг, (е) ЛПС þ ДХК 2 уг/кг. У експерименту није било пар се групе која би проверавала ефекат самог ДХК на пацове јер су токсични и терапеутски ефекти ДХК добро познати (Боотх и ДеЕдс, 1958; Сунил и Ксу, 2019).

2.5. Мерење кортикалног крвотока

ЦБФ је снимљен коришћењем ласерског система за снимање крвотока (омега зона ОЗ-2 СТД, Токио, Јапан). Пацови су анестезирани, а њихове кости лобање су откривене резом на средини главе и стављене на црни сунђер испод сталка за руку. Сталак за руке држи ЦЦД камеру, сочиво (ЗМ10–18, МФ12) и ласерску јединицу (780 нм за мерење и 650 нм за позиционирање).

Необрађене слике мрља су снимљене са површине лобање помоћу ЛСИ софтвера (ЛСИ вер.3.3, Омегававе, Инц., Токио, Јапан), а просечан церебрални проток крви је одређен даљом анализом слика коришћењем ЛИА софтвера (ЛИА вер.3.3, Омегававе, Инц., Токио, Јапан). Црни лист не рефлектује ласерску светлост, а ефекат чини слику крвотока јасном (Паливал ет ал., 2018).

2.6. Тестови понашања

2.6.1. тест И-лавиринт

И-лавиринт апарат помаже у процени радне меморије, општег истраживачког понашања и просторне меморије. Апарат И-лавиринт се састоји од три идентична крака димензија 32 цм висине, 50 цм дужине и 16 цм ширине, који су постављени под углом од 120⁰ један према другом. Око руку су постављене пластичне куглице различитих боја, које се нису мењале сваки пут пре теста да би се задржале новине за животиње. Запрљана животињска постељина била је распоређена по поду лавиринта како би се створила домаћа атмосфера. У огледу 1, нови крак И-лабиринта је држан затворен, а животиње су се могле слободно кретати у два крака 15 минута.

Оглед 2 је изведен тачно након 4 х испитивања 1, у којем су животиње имале слободан приступ 5 минута у све три руке. Сви уноси су снимљени коришћењем БИЛО КОЈЕ МАЗЕ софтвера. Понашање радозналости израчунато је из укупног броја уноса у сва три крака. Проценат уписа крака у нове и познате руке сматра се индикативним за меморију просторног препознавања. Спонтано променљиво понашање означава радну меморију у којој посматрамо колико често животиња понавља своје почетне изборе уноса руку. Унос руке се рачуна када животиња има главу и предње шапе унутар руке (Гарабаду ет ал., 2015; Јосхи ет ал., 2014).

2.6.2. б повишени плус тест лавиринта

ЕПМ (Елеватед Плус Мазе) тест је спроведен да би се проценила анксиозност и понашање дугорочног просторног памћења у направљеном апарату. Произведени ЕПМ се састојао од два отворена крака (50 10 цм) и два затворена крака (50 10 40 цм), а висина крова отвореног крака била је 50 цм од пода. Латенција трансфера (ТЛ) је извршена за процену дугорочне просторне меморије.

ТЛ је мерен као време потребно животињи да пређе у једну од затворених руку са све четири ноге. Животиња је нежно гурнута у једну затворену руку ако животиња не уђе у затворену руку у року од 90 с. У том случају, ТЛ је рачунао као 90 секунди. На дан-10, изведено је испитивање у коме је пацовима дозвољено да истражују лавиринт током 2 минута. Овај задатак је поновљен након 24 х да би се проценило задржавање памћења. Процентуални уноси и време проведено на отвореном се сматрају мером анксиозности (Крисхнамуртхи ет ал., 2013).

2.7. Биохемијске процене

2.7.1. припрема узорака

Хомогенат ткива хипокампуса је направљен узимањем ткива хипокампуса у 1 мл 0.1 М перхлорне киселине у Поттер–Елвехјем хомогенизатору са финим кружним једносмерним тритурацијом. Тако добијени хомогенат је узет у полипропиленску епрувету у коју је додато 50 ул 4 М калијум ацетата да би се постигао пХ 4,0, а касније је центрифугиран 15 минута на 4000 г. Тако добијени супернатант је коришћен за процену активности ацетилхолина (Ацх) и ацетилхолин естеразе (АцхЕ) (Мутхурају ет ал., 2009).

2.7.2. Спектрофлуорометријски тест ацетилхолина

Комплет за амплек црвени тест је коришћен да се пронађе количина ацетилхолина у хомогенату. Реакција је започета додавањем Амплек Ред реагенса/ХРП/холин оксидазе/АЦхЕ радног реагенса у хомогенату епрувету. Инкубирана је 30 мин, а флуоресценција је забележена уз помоћ читача микроплоче (БиоТек, Синерги Х1М, САД) при 530 нм ексцитације и 590 нм таласне дужине емисије (Зоукхри и Кублин, 2001).

2.7.3. б процена активности АЦхЕ

Амплек Ред АЦхЕ комплет за тестирање (Молецулар Пробес, Инц., САД) је коришћен за мерење активности АЦхЕ. Процена је урађена према упутствима произвођача. Реагенси су додати узорку и чувани за инкубацију. Након инкубације, флуоресценција је одређена уз помоћ читача микроплоча (БиоТек, Синерги Х1М, УСА) на таласној дужини ексцитације од 530 нм и таласној дужини емисије од 590 нм

2.7.4. ц процена нивоа нитрита

Ниво нитрита је процењен према методи коју је дао Греен (Греен ет ал., 1982). 50 ул супернатанта добијеног из хомогената мозга помешано је са 5 ул никотинамид аденин динуклеотид фосфата (НАДПХ), 10 ул флавин аденин динуклеотида (ФАД) и 5 ​​ул нитрат редуктазе. Смеша је инкубирана 1 х на 37°Ц у мраку. Цинк сулфат је додат да би се преципитирали протеини.

После центрифугирања (6000 г), једнаке количине супернатанта (100 ул) и Грисовог реагенса (100 ул) (1:1 мешавина 1 процента сулфаниламида у 3 процента ортофосфорне киселине и 0,1 процента нафтил етилен диамина) су добијене помешано и инкубирано 10 мин на собној температури у мраку. Плоче су затим очитане на 540 нм УВ спектрофотометром, а НОк је израчунат коришћењем стандардне криве натријум нитрита.

2.7.5. д процена формирања митохондријалног ЛПО или малондиалдехида (МДА).

Садржај митохондријалног МДА је мерен према стандардном протоколу (Охкава ет ал., 1979). Хомогенат је прокуван заједно са 10 процентом СДС, КЦл (1,15 процената), сирћетном киселином (20 процената) и ТБА (0,8 процената). После хлађења у текућој води екстрахован је н-бутанолом. Органски слој тако добијен центрифугирањем је мерен на 532 нм. Концентрација МДА је изражена као микромол МДА по милиграму протеина.

2.7.6. е-процена активности каталазе

Активност каталазе је испитивана по методи Луцка (1974). Хомогенати мозга су центрифугирани на 10,000 рпм током 10 минута у Еппендорф микроцентрифуги. Аликвоти супернатанта су помешани са фосфатним пуфером и водоник пероксидом. Апсорбанца је мерена на 240 нм током 3 минута у интервалу од 30- с. Из смањења апсорпције израчуната је активност ензима (Цорреа ет ал., 2000).

2.7.7. ф процена ИЛ-6 коришћењем ЕЛИСА комплета

Цитокин ИЛ{{0}} је процењен у хомогенату мозга коришћењем комерцијално доступног ЕЛИСА комплета за ИЛ-6 пацова (НОВЕКС™, Тхермо Фисцхер, САД). Узорци мозга су суспендовани у пуферском раствору (1 проценат Тритон Кс100, апротинин 200 У/мл, 0,1 мМ ПМСФ, 0,1 мМ бензетонијум хлорид, 1 мМ бензамидин и 1 мМ ЕДТА) и затим центрифугирани на 14, 000 г током 30 минута на 4 Ц и супернатант је одвојен за процену цитокина. Нивои проинфламаторног цитокина интерлеукина-6 (ИЛ-6) у узорцима целог мозга су квантификовани коришћењем ЕЛИСА комплета према упутствима произвођача.

2.8. Статистичка анализа

Све вредности су изражене као средња стандардна девијација (СД). За просторну меморију у ЕПМ задатку, извршена је двосмерна АНОВА поновљених мерења праћена Бонферони пост-хоц тестом за кашњење преноса између дана-9 и дана-10. Слично, двосмерна АНОВА праћена Бонферони пост-хоц тестом је изведена за памћење просторног препознавања и тест понашања животиња у И-лавиринту да би се проценила локомоторна активност и у сесијама сонде и теста.

Једносмерна АНОВА праћена пост-хоц Студентовим Невман-Кеулсовим тестом је извршена за анализу свих осталих параметара понашања и биохемијских параметара. Грапх Пад Присм верзија 5 (Сан Дијего, Калифорнија) је коришћена за примену статистике, а групе са п < 0.05 су сматране значајно различитим.

Механизам неуропротекције Цистанцхеефекат

Цистанцхе је традиционална кинеска лековита биљка за коју се показало да има неуропротективне ефекте. Тачан механизам његовог деловања није у потпуности схваћен, али све је више доказа да би могао бити повезан са његовом способношћу да повећа експресију неуротрофних фактора и регулише одређене сигналне путеве у мозгу.

Један од главних неуротрофних фактора за које се показало да Цистанцхе повећава је неуротрофни фактор који потиче из мозга (БДНФ). БДНФ је протеин који игра кључну улогу у расту, диференцијацији и одржавању неурона у мозгу. Студије су показале да када су нивои БДНФ виши, постоји већи неуронски опстанак и пластичност, што може помоћи у заштити од неуродегенерације.

Цистанцхе такође може бити у стању да регулише одређене сигналне путеве у мозгу који су укључени у преживљавање ћелија и апоптозу (програмирана ћелијска смрт). На пример, показало се да инхибира активност ц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК) пута, што може довести до смрти неурона под одређеним условима. Инхибирајући ЈНК, Цистанцхе може помоћи у заштити неурона од оштећења и одржавању њиховог опстанка.

Поред тога, показало се да Цистанцхе има антиинфламаторне и антиоксидативне ефекте, што може додатно помоћи у заштити неурона од оштећења и одржавању њихове функције. Ова својства чине Цистанцхе обећавајућим терапеутским средством за лечење неуродегенеративних поремећаја као што су Алцхајмерова и Паркинсонова болест.

Наставиће се...

Кадир Алам, Саирам Кришнамурти *

Лабораторија за неуротерапеутику, Одељење за фармацеутско инжењерство и технологију, Индијски технолошки институт (Банарас Хинду универзитет), Варанаси, 221005, УП, Индија