Цистанцхе: Ехинакозид потискује раст ћелија аденокарцинома панкреаса индукујући апоптозу преко пута протеина киназе активираног митогеном

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

ВЕИ ВАНГ, ЈИНБИН ЛУО, ИИНГХУИ ЛИАНГ и КСИНФЕНГ ЛИ

Апстрактан.

Клиничка примена природних производа који потичу из традиционалне кинеске медицине привукла је пажњу у хемотерапији рака.Ецхинацосиде(ЕЦХ), један од фенилетаноида, изолован из стабљикаЦистанцхе(кинески биљни лек) има заштитно и анти-апоптотичко дејство на централни нервни систем. Међутим, остаје у великој мери неухватљиво да ли ЕЦХ поседује тумор-супресивну активност. У овој студији је показано да ЕЦХ може значајно да инхибира пролиферацију ћелија аденокарцинома панкреаса индукујући производњу реактивних врста кисеоника и пертурбацију потенцијала митохондријалне мембране и на тај начин покреће апоптозу. Штавише, разјашњено је да ЕЦХ(Ецхинацосиде)потискује раст туморских ћелија кроз модулацију МАПК активности. У закључку, ова студија открива нову функцију ЕЦХ(Ецхинацосиде) у превенцији развоја рака, и имплицира да би употреба ЕЦХ могла бити потенцијална хемотерапеутска стратегија за рак.

Увод

Пут супресора тумора п53 путем индукције туморског супресора, АРФ ублажава онкогену Е3-лигазу мишјег двоструког минута (МДМ)2-посредовану деградацију п53 (3). Ово је ауто-регулисани, самозаштитни механизам који спречава ћелије од малигне трансформације. Посебно, п53 може потиснути Миц активност тако што ће транскрипционо активирати, на пример, миР-145 који циљаМицмРНА за утишавање транслације (4,5), чиме се формира регулаторна петља негативне повратне спреге.

Најједноставнија и најефикаснија стратегија за лечење рака је убијање ћелија рака. Показало се да често коришћени лекови против рака, као што су цисплатин (6), актиномицин Д (7) и адриамицин (8) инхибирају раст тумора промовишући апоптозу. Недавно је све више доказа показало да бројни природни производи и деривати из биљака, посебно из лековитих биљака који се користе у традиционалној кинеској медицини (ТЦМ), показују функцију супресије тумора тако што изазивају апоптозу ћелија рака и имају потенцијал за клиничку примену. у терапији рака (9). На пример, природни антрахинон емодин је изолован из бројних типова ћелија рака (10,11). Камптотецин, изведен од кинеског 'срећног дрвета',Цамптотхеца ацуминате, је вредан природни производ који инхибира лигацију ДНК након прекида ланаца посредованих топо И (12). У другој ретроспективној кохортној студији заснованој на популацији од укупно 729 пацијената са узнапредовалим раком дојке, сугерисано је да ТЦМ терапија може допринети лечењу рака. Од ове кохорте, 115 пацијената је користило ТЦМ, док 614 пацијената није користило ТЦМ. Мултиваријантна анализа је показала да је, у поређењу са не-корисницима, употреба ТЦМ повезана са значајно смањеним ризиком од смртности од свих узрока (13). Сви наведени налази указују да је ТКМ важан комплементарни и алтернативни лек који се може користити у лечењу рака.

мишеви са акутном повредом плућа (16,17). Такође, ЕЦХ(Ецхинацосиде)показало се да има заштитне ефекте на нервно ткиво и побољшава поремећаје понашања код мишјих модела Паркинсонове болести (18). Посебно је откривено да ЕЦХ промовише ћелијску пролиферацију и инхибира апоптозу у МОДЕ-К ћелијама епителног црева миша (19). До сада је, међутим, мање пажње посвећено потенцијалној улози ЕЦХ у превенцији рака.

У овој студији је истражено да ли третман ЕЦХ утиче на раст и пролиферацију туморских ћелија и да ли ЕЦХ(Ецхинацосиде)индукује апоптозу, подиже производњу реактивних врста кисеоника (РОС) и смањује потенцијал митохондријалне мембране (ММП), и последично сузбија раст туморских ћелија. Штавише, ова студија је имала за циљ да идентификује молекуларне механизме одговорне за инхибицију раста ћелија посредовану ЕЦХ.

Материјали и методе

Ћелија линија, реагенс, и антитела.СВ1990 ћелије аденокарцинома панкреаса (АТЦЦ, Манассас, ВА, САД) узгајане су у Дулбеццо-овом модификованом медијуму Еагле са додатком 10% феталног говеђег серума, 50 У/мл пеницилина и 0,1 мг/мл стрептомицина на 37˚Ц 5% ЦО2 влажна атмосфера. ЕЦХ(Ецхинацосиде)је купљен од Јрдун Биотецхнологи Цорп. (Шангај, Кина). Антитела против АКТ, П-АКТ, ЕРК, П-ЕРК, ЈНК, п-ЈНК, П38, п-П38 и ГАПДХ су купљена од Целл Сигналинг Тецхнологи (Данверс, МА, САД); анти-Бак и анти-Бцл-2 су купљени од Санта Цруз Биотецхнологи Инц. (Санта Круз, Калифорнија, САД); а анти-Цаспасе{10}} је купљен од Абцам-а (Шангај, Кина).

Ћелија Одрживостесеј. Да би се проценила брзина раста туморских ћелија, коришћен је комплет за бројање ћелија{{0}} (ЦЦК-8; Дојиндо Молецулар Тецхнологиес, ​​Роцквилле, МД, САД) према упутствима произвођача. Ћелијске суспензије су засејане на 5,000 ћелија по бунарчићу са ЕЦХ третманом током 0, 12, 24, 48 или 72 х у 96 -плочама за културу бунара. Инхибиција раста ћелија одређена је додавањем ВСТ-8 реагенса из комплета ЦЦК-8 у коначној концентрацији од 10 процената у сваки бунар, а апсорбанција узорака је мерена на 450 нм коришћењем читача микроплоче (Мултискан МК3; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Инц., Валтхам, МА, САД).

Хоецхст 33342 бојење.Ћелије (60 процената конфлуенције) су третиране са Хоецхст 33342 (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи, Хаимен, Кина) у коначној концентрацији од 1µг/мл, инкубирано у инкубатору на 37˚Ц 15 минута, испрано физиолошким раствором пуферованим фосфатом два пута, фиксирано у 4 процентном параформалдехиду 30 минута на собној температури и постављено на плочице. Морфолошке промене ћелијских језгара су уочене под флуоресцентним микроскопом (Олимпус БКС51, Мелвилле, НИ, УСА). Нормална језгра су била округла и обојена светло плавом бојом, док су апоптотска језгра била скупљена и обојена светло плавом бојом.

Флуоресцентно активирано ћелија сортирање (ФАЦС) анализе.За процену апоптозе, коришћен је флуоресцеин изотиоцијанат (ФИТЦ)-Аннекин В комплет за детекцију апоптозе (БД Биосциенцес, Шангај, Кина) према упутствима произвођача. Укратко, 5к104 ћелије су испране ледено хладним ПБС, ресуспендоване у 0,1 мл пуфера за везивање (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи) и обојене са 10 мл ФИТЦ-коњугованог Анексина В (10 мг/мл) и 10 мл пропидијум јодида (ПИ) (50 мг/мл). Након инкубације од 15 минута на собној температури у мраку и додавања 400 мл пуфера за везивање, ћелије су анализиране проточним цитометром (Ц6; БД Биосциенцес, Шангај, Кина).

Меасуремент оф реактиван кисеоник врсте (РОС).Да би се проценила производња РОС, коришћен је комплет за испитивање врста реактивног кисеоника (Вигороус Биотецхнологи, Пекинг, Кина) према упутствима произвођача. Укратко, ћелије (80 процената конфлуенције) су сакупљене и испране са ПБС пре бојења раствором дихидроетидијума (ДХЕ) (Беиотиме Институте оф Биотецхнологи). Ћелије су затим анализиране проточном цитометријском анализом.

Меасуремент оф митохондријски мембрана потенцијал (ММП).

Комплет за анализу тетраметилродамин метил естра (ТМРМ) (ИммуноЦхемистри Тецхнологиес, ​​Блоомингтон, МН, САД) је коришћен за откривање промена у ММП. Укратко, ћелије (80 процената конфлуенције) су сакупљене, испране ПБС и обојене ТМРМ током 15-20 минута у инкубатору на 37 ° Ц. Ћелије су затим једном испране са ПБС и подвргнуте проточној цитометријској анализи.

Имуноблотинганализе. Ћелије (80 процената конфлуенције) су сакупљене и лизиране у РИПА пуферу (Јрдун Биотецхнологи) који се састоји од 50 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,4; 150 мМ НаЦл, 1 мМ ЕДТА, 1 проценат НП-40, 1 проценат натријум деоксихолне киселине и 0,1 проценат СДС и свеже додати инхибитори протеазома. Једнаке количине бистрог ћелијског лизата коришћене су за анализу имуноблотинга као што је претходно описано (20).

Статистички анализа.Квантитативни подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. Статистичке разлике су процењене неупареним Студентовим т-тестом коришћењем статистичког софтвера СПСС 15.0. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Резултати

ЕЦХ (Ецхинацосиде)потискује тумор ћелијараст. Иако је објављено да је ЕЦХ(Ецхинацосиде)показује заштитну улогу инхибирањем апоптозе и инфламаторних сигнала у соматским ћелијама, као што су неуронске и интестиналне епителне ћелије (16-19), остаје неухватљиво да ли ЕЦХ контролише раст и пролиферацију ћелија рака. Да би се ово тестирало, спроведен је тест преживљавања ћелија третирањем СВ1990 ћелија, добијених из аденокарцинома панкреаса ИИ степена, са титрираним дозама ЕЦХ као што је приказано на слици 1. Посебно, показано је да ЕЦХ значајно успорава пролиферацију туморских ћелија у дози -зависни начин током 5-дневног периода културе (слика 1).ЕЦХ окидачиапоптоза. Како је губитак апоптозе један од главних узрочних механизама који леже у основи неконтролисане пролиферације ћелија рака панкреаса (21), ова студија је извела низ експеримената како би утврдила да ли ЕЦХ покреће апоптозу. Прво, бојењем језгара туморских ћелија са Хоецхст 33342, показано је да ЕЦХ доводи до апоптозе на начин који зависи од дозе (слика 2А). Поред тога, ФАЦС анализе су спроведене коришћењем бојења Анексином В/ПИ да би се додатно потврдио апоптотички ефекат ти ЕЦХ (слика 2Б). Просечан проценат апоптотичких ћелија био је 1,1 проценат у нормалним условима културе, док се овај проценат значајно повећао на 10,6, 21,4 и 51,3 процената као одговор на третман ЕЦХ на начин зависан од дозе (слика 2Ц). Ови резултати, заједно са тестом виталности ћелија приказаним на Слици 1, показују да ЕЦХ третман потискује пролиферацију туморских ћелија тако што покреће апоптозу.

генерисање етидијума који се интеркалира са ДНК, коришћен је у овој студији за процену производње РОС. Утврђено је да, као и други лекови против карцинома, ЕЦХ такође стимулише производњу РОС на начин који зависи од дозе, што показује повећан интензитет флуоресценције након третмана ЕЦХ (слика 3).

ЕЦХ (Ецхинацосиде)смањује ММП.Показало се да је митохондријална дисфункција имплицирана у индукцији апоптозе. Показало се да отварање прелазних пора митохондријалне пермеабилности изазива деполаризацију трансмембранског потенцијала и ослобађање про-апоптотичких фактора (23). Стога је тестирано да ли ЕЦХ може да изазове губитак ММП у туморским ћелијама извођењем ТМРМ теста, што је добро успостављен приступ, пошто је интензитет ТМРМ флуоресценције пропорционалан мембранском потенцијалу. Показано је да третман ЕЦХ значајно смањује ММП на начин који зависи од дозе (слика 4).ЕЦХ контроле тумор ћелија раст преко протеин активиран митогеноммолекуларна основа ЕЦХ посредоване смрти туморских ћелија, испитивана је активност неколико виталних сигналних путева, као што су МАПК и АКТ (24,25), који контролишу преживљавање и смрт ћелија. МАПК су еволутивно очуване, пролином усмерене Сер/Тхр протеин киназе, укључујући киназе регулисане екстрацелуларним сигналом (ЕРК), ц-Јун НХ2-терминалне киназе (ЈНК) и чланове породице п38 који се активирају преко три- сигналне каскаде киназе слоја (26,27). У овој студији је процењена експресија МАПК и АКТ, као и њихови активирани фосфорилисани облици и откривено је да ЕЦХ значајно потискује ЈНК и ЕРК1/2 активност, али појачава активност п38 (слика 5). Посебно је показано да АКТ активност, која је такође критично важна за пролиферацију ћелија, није под утицајем ЕЦХ третмана (слика 5). Поред тога, показало се да третман ЕЦХ подиже експресију Бака и каспазе-3 док истовремено смањује експресију Бцл-2 (слика 5), што је у складу са сликом 2. Дакле, резултати показују да ЕЦХ покреће апоптозу туморских ћелија путем МАПК пута.

Дискусија

Колико нам је познато, ово је прва студија која показује да ЕЦХ има функцију супресије тумора тако што покреће апоптозу (слика 2), промовише производњу РОС (слика 3) и изазива деполаризацију потенцијала митохондријалне мембране (слика 4). , што последично доводи до инхибиције раста туморских ћелија (слика 1). Штавише, показало се да се молекуларна основа смрти туморских ћелија посредоване ЕЦХ јавља регулацијом МАПК сигналних путева (слика 5). Ови налази показују нову функцију ЕЦХ у превенцији туморигенезе и стога сугеришу да би то могло бити средство кандидат за терапију рака.

Већина лекова против рака може индуковати апоптозу туморских ћелија, старење и/или заустављање ћелијског циклуса, што доводи до инхибиције раста и пролиферације туморских ћелија. Заустављање ћелијског циклуса је ћелијски одговор на благе сигнале стреса који омогућавају ћелијама да поправе оштећену ДНК пре покретања репликативне ДНК синтезе или митозе, док се апоптоза и старење (трајно заустављање ћелијског циклуса) јављају као одговор на сигнале стреса који елиминишу непоправљиве или малигне ћелије ( 28,29). Стога је у овој студији процењен само апоптотички ефекат ЕЦХ на туморске ћелије, пошто је убијање ћелија рака главни критеријум за процену потенције антиканцерогеног агенса. Посебно је показано да ЕЦХ индукује експресијуБак(Слика 5), про-апоптотички ген, транскрипционо активиран туморским супресором п53 (30). Стога је вредно тестирати да ли ЕЦХ може да активира сигнални пут п53. Ако је тако, ЕЦХ би такође могао да изазове п53-зависно заустављање ћелијског циклуса, старење, апоптозу или аутофагију. У овој студији, разјашњена је тумор-супресивна функција ЕЦХ у ћелијској линији аденокарцинома панкреаса СВ1990. Међутим, потребне су даље студије које посматрају више ћелијских линија рака панкреаса. Показало се да су мутације у онкогеном протеину РАС и тумор супресору п53 повезане са развојем карцинома панкреаса (31); међутим, према бази података ИАРЦ п53 (хттп://п53.иарц.фр/ЦеллЛинес.аспк), ћелијска линија СВ1990 не садржи никакву мутацију п53. Стога је важно истражити да ли ЕЦХ може утицати на раст и пролиферацију других ћелијских линија рака панкреаса са различитим мутацијама п53. Поред тога, било би занимљиво утврдити да ли је ЕЦХ у стању да промовише апоптозу и инхибира раст других врста тумора.

Показало се да су повишење РОС-а и смањење ММП-а, које су узроковане третманом ЕЦХ-ом, од суштинске важности у индукцији апоптозе (22). Поред тога, откривено је да РОС може индуковати оксидацију митохондријалних пора доприносећи ослобађању цитокромаc, интермедијер у апоптози, због поремећаја ММП (22). Дакле, остаје да се утврди да ли ЕЦХ ремети ММП индиректно кроз индукцију РОС. Штавише, показало се да је оксидативни стрес изазван РОС укључен у модулацију безброј сигнала за контролу раста ћелија, укључујући п53, НФ-κБ, ХИФс и ПИ3К (32). Остаје да се утврди да ли и, ако јесте, како ЕЦХ регулише ове важне сигналне путеве. Значајно је да оксидативни стрес узрокује различите неуродегенеративне болести због велике потрошње кисеоника, слабих антиоксидативних система и карактеристика терминалне диференцијације централног нервног система (33). Међутим, неколико студија је показало да ЕЦХ има заштитне и анти-апоптотске ефекте на нервно ткиво. С тим у вези, разумно је претпоставити да ЕЦХ може смањити производњу РОС у терминално диференцираним нервним ћелијама. Стога, такође остаје да се утврди да ли регулација производње РОС од стране ЕЦХ зависи од статуса диференцијације ћелија. Дакле, садашњи резултати заједно са другим студијама откривају да ЕЦХ, широко коришћени ТЦМ, може бити важна хемотерапеутска стратегија не само за лечење неуродегенеративних болести већ и малигних карцинома.

У последње време, употреба ТЦМ у терапији рака добија све већу пажњу. Потенцијал природних производа од лековитог биља који се користе у ТКМ препознала је научна заједница чак иу западном свету (9). Потребни су напори да се разјасне основни механизми деловања ових природних производа, који на крају могу довести до развоја ефикасних и безбедних лекова за терапију рака.

У закључку, ова студија је показала туморску инхибиторну функцију ЕЦХ и такође разрађује молекуларну основу супресије тумора посредоване ЕЦХ, сугеришући на тај начин потенцијалну клиничку примену ЕЦХ у терапији рака.

Признања

Ова студија је финансирана и подржана од стране Кључног програма научних истраживања ФМУ (грант бр. 09ЗД014). Аутори желе да се захвале Биомедворлду (Шангај, Кина) на помоћи у уређивању рукописа.

Референце

1. Ханахан Д и Веинберг РА: Ознаке рака: следећа генерација. Ћелија 144: 646-674, 2011.

2. Алдертон ГК: Транскрипција: транскрипциони ефекти МИЦ-а. Нат Рев Цанцер 14: 513, 2014.

3. Зинди Ф, Еисцхен ЦМ, Рандле ДХ, Камијо Т, Цлевеланд ЈЛ, Схерр ЦЈ и Роуссел МФ: Миц сигнализација преко АРФ супресора тумора регулише п53-зависну апоптозу и имортализацију. Генес Дев 12: 2424-2433, 1998.

4. Сацхдева М, Зху С, Ву Ф, Ву Х, Валиа В, Кумар С, Елбле Р, Ватабе К и Мо ИИ: п53 потискује ц-Миц кроз индукцију туморског супресора миР-145. Проц Натл Ацад Сци УСА 106: 3207-3212, 2009.

5. Лиао ЈМ, Цао Б, Зхоу Кс и Лу Х: Нови увид у функције п53 кроз његове циљне микроРНА. Ј Мол Целл Биол 6: 206-213, 2014.

6. Замбле ДБ и Липпард СЈ: Цисплатин и поправка ДНК у хемотерапији рака. Трендс Биоцхем Сци 20: 435-439, 1995.

7. Клеефф Ј, Корнманн М, Савхнеи Х и Корц М: Актиномицин Д индукује апоптозу и инхибира раст ћелија рака панкреаса. Инт Ј Цанцер 86: 399-407, 2000.

8. Тацар О, Сриаморнсак П и Дасс ЦР: Доксорубицин: ажурирање молекуларног дејства против рака, токсичности и нових система за испоруку лекова. Ј Пхарм Пхармацол 65: 157-170, 2013.

9. Еффертх Т, Ли ПЦ, Конкималла ВС и Каина Б: Од традиционалне кинеске медицине до рационалне терапије рака. Трендови Мол Мед 13: 353-361, 2007.