Ј Протеин 1 у интеракцији са ЕДС1- је суштински негативан регулатор урођеног имунитета биљака у Арабидопсису

Апстрактан

Биљке су развиле прецизне механизме за оптимизацију имуних одговора против патогена. ПОБОЉШАНА ОСЕТЉИВОСТ НА БОЛЕСТИ 1 (ЕДС1) игра виталну улогу у урођеном имунитету биљака регулацијом базалног отпора и имунитета изазваног ефекторима. Нуклеоцитоплазматски промет ЕДС1 је потребан за јачање отпора, али молекуларни механизам остаје неухватљив. Овде показујемо да ЕДС1-ИНТЕРАЦТИНГ Ј ПРОТЕИН1 (ЕИЈ1), који делује као ДнаЈ протеински пратилац као одговор на инфекцију патогеном, функционише као суштински негативан регулатор имунитета биљака у интеракцији са ЕДС1. Мутација губитка функције ЕИЈ1 није утицала на раст биљака, али је значајно повећала отпорност на патогене. Након инфекције патогеном, ЕИЈ1 се преместио из хлоропласта у цитоплазму, где је ступио у интеракцију са ЕДС1, чиме је ограничио промет ЕДС1 изазван патогеном у језгро и угрозио отпорност у раној фази инфекције. Током развоја болести, ЕИЈ1 се постепено разграђује, омогућавајући нуклеарну акумулацију ЕДС1 за појачање транскрипционе отпорности. Вирулентни сој Пст ДЦ3000 (АврРпс4) укинуо је репресивно дејство ЕИЈ1 брзо изазивајући његову деградацију у одговору имунитета изазваном ефекторима. Дакле, наши налази показују да је ЕИЈ1 суштински ЕДС1-зависни негативни регулатор урођеног имунитета биљака и пружа механичко разумевање о томе како се дистрибуција ЕДС1 у односу на цитоплазматску нуклеарну регулацију регулише током имунолошког одговора.

цистанцхе користи-јача имуни систем

Увод

Биљке су развиле компликовану мрежу за модулацију својих имунолошких одговора. Да би се одбраниле од патогена, биљке користе две главне регулаторне стратегије: имунитет изазван узорком (ПТИ) и имунитет изазван ефекторима (ЕТИ). ПТИ управљају рецептори за препознавање образаца (ПРР) који препознају молекуларне обрасце повезане са патогеном или микробом (Зипфел, 2008). Да би олакшали инфекцију, вирулентни патогени сузбијају ПТИ тако што луче ефекторе патогена и манипулишу ћелијама домаћинима да би олакшали стицање хранљивих материја и на крају репродукцију (Тсуда и Катагири, 2010). Отпорност ниског нивоа коју биљка показује на ове вирулентне патогене назива се базална резистенција (Јонес и Дангл, 2006; Клессиг ет ал., 2018). С друге стране, ЕТИ је посредован протеинима отпорности на болести (Р) кодираним биљкама, који могу директно или индиректно препознати присуство ефектора које луче патогени (Тсуда и Катагири, 2010). Већина Р протеина садржи место за везивање нуклеотида и домен понављања богатог леуцином (НБ-ЛРР). НБ-ЛРР протеини који садрже Н-терминални Толл/Интерлеукин-1 рецептор (ТИР) домен интеракције протеин-протеин познати су као ТИР-НБ-ЛРР (ТНЛ) протеини, и они чине највећу групу НБ- ЛРР протеини (Цаплан ет ал., 2008). У поређењу са базалном резистенцијом, ЕТИ изазива јачи и бржи одбрамбени одговор против патогена и често је праћен локалном смрћу ћелија, што је карактеристична карактеристика преосетљивог одговора (ХР; Доддс и Ратхјен, 2010). ПОБОЉШАНА ОСЕТЉИВОСТ НА БОЛЕСТИ 1 (ЕДС1), централни регулатор имунитета биљака, помаже у контроли базалне резистенције ограничавањем инвазије биотрофних и хемибиотрофних патогена (Виермер ет ал., 2005). ЕДС1 такође игра важну улогу у ЕТИ, који је углавном посредован ТНЛ класом Р протеина (Хеидрицх ет ал., 2012). ЕДС1 блиско сарађује са својим корегулаторима ПХИТОАЛЕКСИН ДЕФИЦИЕНТ 4 и СЕНЕСЦЕНЦЕ-АССОЦИАТЕД ГЕНЕ 101 у цитоплазми и/или језгру да регулише производњу интрацелуларних реактивних врста кисеоника (РОС), акумулацију салицилне киселине (СА) и друге процесе, чиме се појачава отпорност патогена на Русте ´руцци ет ал., 2001; Риетз ет ал., 2011; Вагнер ет ал., 2013). Сходно томе, Арабидопсис едс1 мутант је веома осетљив на Псеудомонас сирингае пв. сој парадајза (Пст) ДЦ3000 и показује компромитовани ЕТИ посредован ТНЛ-ом, у коме су експресија ИЗОХОРИЗМАТНЕ СИНТАЗЕ1 (ИЦС1; СА биосинтетички ген) и биосинтеза СА инхибиране (Паркер ет ал., 1996; Феис ет ал., 2001; Бартсцх ал., 2006). Поред тога, ЕДС1 показује промет протеина између цитоплазме и језгра посредован нуклеарним транспортним рецепторима (Гарцı´а ет ал., 2010). Иако нуклеарне функције ЕДС1 укључују базалну резистенцију и производњу РОС, програмирана ћелијска смрт и јачање резистенције захтевају координацију нуклеарне наспрам цитоплазматске локализације ЕДС1 (Хеидрицх ет ал., 2011). Баланс између количине ЕДС1 у цитосолу и количине у језгру је важан за ефикасну базалну резистенцију и имунитет изазван ТНЛ (Гарцı´а ет ал., 2010). Међутим, како ЕДС1 одржава образац дистрибуције нуклеоцитоплазме током урођених имунолошких одговора биљака остаје нејасно. ДнаЈ протеини (или Ј протеини) су протеини шаперона (Пулидо и Леистер, 2018) који припадају суперфамилији домена богатој цистеином (Цис) и учествују у савијању и састављању протеина у настајању, транспорту протеина кроз мембране са накнадним пресавијањем и одлагање несавијених или дефектних протеина (Букау ет ал., 2006). Ови процеси су потребни за нормалну функцију већине ћелијских протеина у различитим развојним фазама (Пулидо и Леистер, 2018). Истраживања у различитим организмима показују да ДнаЈ протеини такође играју различите улоге у биотичким и абиотичким одговорима на стрес, посебно у имунолошким одговорима. У Ницотиана бентхамиана, ДнаЈ протеин Нб-МИП1 функционише као кохаперон у одговору на вирусне патогене (Ду ет ал., 2013). Соја (Глицине мак Л.) Гм-протеин топлотног шока 40 (ХСП40.1), ДнаЈ протеин локализован у језгру, је позитиван регулатор отпорности на вирус мозаика соје (Лиу и Вхитхам, 2013). У парадајзу (Соланум лицоперсицум), хлоропластом локализован ДнаЈ протеин, Ле-ЦДЈ2, је пријављено да побољшава отпорност на бактеријски патоген, Псеудомонас соланацеарум (Ванг ет ал., 2014). Поред тога, Тси{68}} протеин 1 (Тсип1), ДнаЈ протеин дувана (Ницотиана табацум), регулише Тси{71}посредовану транскрипциону активацију као одговор на стрес (Хам ет ал., 2006). Ови резултати јасно показују да ДнаЈ протеини играју важну улогу у имунитету биљака, иако основни механизми захтевају даља истраживања. У овој студији, изоловали смо Арабидопсис тхалиана ЕДС1 У ИНТЕРАКЦИЈИ Ј ПРОТЕИН 1 (ЕИЈ1), ХСП40-попут ДнаЈ протеина, и показали да је ЕИЈ1 у интеракцији са ЕДС1 у планта. Биљке мутанта еиј1 са губитком функције показале су нормалан раст, јачу отпорност на патогене и већу експресију гена повезаних са отпорношћу након инфекције патогенима у поређењу са биљкама дивљег типа. Међутим, мутација губитка функције ЕИЈ1 није спасила осетљиви фенотип мутанта едс1 након изазивања са Пст ДЦ3000. Штавише, протеин ЕИЈ1, који се нормално локализује на хлоропласту, отпуштен је из хлоропласта у цитоплазму након инокулације патогена, где је ступио у интеракцију са ЕДС1, чиме је спречио промет изазван патогеном у језгро и последично компромитовао одговор отпора у раној фази. стадијум инфекције. Ови налази разјашњавају важне детаље регулаторног механизма који лежи у основи нуклеоцитоплазматског обрасца дистрибуције ЕДС1 и пружају потенцијално ефикасну мету за оплемењивање усева отпорних на болести.

цистанцхе користи-јача имуни систем

Резултати

ЕИЈ1 интерагује са ЕДС1 ин витро и ин виво

Као суштинска компонента одговора одбране биљака, ЕДС1 се налази на кључном чвору сигналне мреже урођеног имунитета биљке. Да бисмо идентификовали потенцијалне интеракцијске протеинске партнере ЕДС1, извршили смо скрининг са два хибрида квасца. ЕДС1 је показао снажну интеракцију са Арабидопсис ХСП40- попут протеина шаперона (АТ2Г24860) са непознатом функцијом (Слика 1, А и Б), који припада ДнаЈ суперфамилији (Допунска слика 1А); овај протеин се у даљем тексту назива ЕИЈ1. Анализа секвенце је показала да ЕИЈ1 садржи 144 аминокиселинских остатака, укључујући четири Цис-богата мотива Зн прстију (ЦКСКСЦКСГКСГ; Додатна слика 1А). Иако друге врсте ангиосперми имају хомологе ЕИЈ1, чини се да су најближи хомолози ограничени на Брассицацеае (додатна слика 1Б и датотека С1). Значајно је да је ЕИЈ1 показао сличност секвенце са протеином Н. табацум Тсип1, који је укључен у отпорност на патогене (додатна слика 1Б; Хам ет ал., 2006). Да би се идентификовали функционални домени одговорни за интеракцију између ЕДС1 и ЕИЈ1, две скраћене верзије ових протеина су коришћене у двохибридним тестовима квасца (Слика 1А; Додатна слика 1А). Н крај ЕИЈ1 показао је снажну интеракцију са ЕДС1 пуне дужине, као и ЕДС1 Н крајем, али слабу интеракцију са ЕДС1 Ц крајем (слика 1Б). Ово сугерише да су Н крај ЕДС1, који садржи домен сличан липази, и Н крај ЕИЈ1 неопходни и довољни за њихову интеракцију. Иако Ц терминус ЕИЈ1 садржи очуван Цис-богат домен Зн прста који може олакшати његово везивање за ДНК или друге протеине, он не доприноси интеракцији са ЕДС1. Пулл-довн тестови су додатно потврдили интеракцију између ЕДС1 и ЕИЈ1 ин витро (Слика 1Ц), док тестови ко-имунопреципитације (Цо-ИП) користећи 35Спро: ЕИЈ1- 6ХА 35Спро: ЕДС1-3ФЛАГ трансгене биљке потврдили су њихову интеракцију у плантажи (слика 1Д). Узети заједно, ови резултати показују да ЕДС1 реагује са ЕИЈ1 и ин витро и ин виво. Карактеризација ЕИЈ1 Да бисмо одредили субћелијску локализацију ЕИЈ1, спојили смо отворени оквир читања ЕИЈ1 са мЦхерри репортер геном под контролом 35С промотора вируса мозаика карфиола да бисмо генерисали 35Спро: ЕИЈ1-мЦхерри конструкцију. Овај конструкт је пролазно трансформисан у листове Н. бентхамиана агроинфилтрацијом. Флуоресцентна микроскопија је показала да је ЕИЈ1-мЦхерри локализован и на хлоропласту и на језгру (слика 2А). Овај образац локализације је потврђен имуноблот анализом трансгених 35Спро: ЕИЈ1-6ХА биљака (допунска слика 2). Да би се истражио образац експресије ЕИЈ1, геномска секвенца ЕИЈ1 је спојена са ß-глукуронидазом (ГУС) репортерским геном да би се генерисале ЕИЈ1про: ЕИЈ1-ГУС трансгене линије Арабидопсис. Јака ГУС активност је откривена у листовима и коренима розете; међутим, активност ГУС-а је била слаба у силиконима и неприметна у стабљикама и цветовима (слика 2Б). Ови резултати су били у складу са резултатима експресије за ЕИЈ1, који је испитиван квантитативном реверзном транскрипцијом-ПЦР (РТ-ПЦР) у различитим ткивима (слика 2Ц). С обзиром на то да је ЕДС1 централни регулатор имунитета биљака (Саикат ет ал., 2011), истражили смо да ли је ЕИЈ1, наводни кофактор ЕДС1, такође укључен у одговор на инфекцију патогеном. Ниво транскрипта ЕИЈ1 индукован је третманом са хемибиотрофним бактеријама Пст ДЦ3000 или СА (слика 2Д). ГУС бојење је открило да је ЕИЈ1 индукован и изразито концентрисан око трихома у листовима инокулисаним Пст ДЦ3000- (Слика 2Е–Г), што имплицира могућу биолошку релевантност ЕИЈ1 у одбрамбеном одговору (Ксин и Хе, 2013). Затим смо испитали ниво ЕИЈ1 у 35Спро: ЕИЈ1-ХА биљкама третираним са Пст ДЦ3000 или СА. Занимљиво је да је након третмана Пст ДЦ3000 или СА, ЕИЈ1 постепено деградиран након брзе индукције (слика 2, Х и И). Овај резултат није био у складу са стабилним обрасцем експресије ЕИЈ1-ХА уоченог у 35Спро: ЕИЈ1-ХА биљкама током инфекције патогеном (допунска слика 3), што указује на посттранскрипциону регулацију ЕИЈ1. Заједно, ови резултати сугеришу да је ЕИЈ1 укључен у имунолошки одговор биљке.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

Мутација губитка функције ЕИЈ1 повећава отпорност на Пст ДЦ3000 преко СА пута

Да бисмо истражили улогу ЕИЈ1 у имунитету биљака, идентификовали смо мутант Арабидопсис (САЛК_142975) који садржи Т-ДНК инсерцију у трећем егзону ЕИЈ1 (Слика 3, А и Б). Квантитативна РТ-ПЦР анализа је показала да је ЕИЈ1 био слабо експримиран у овом еиј1 Т-ДНК инсерционом мутанту; стога смо овај ЕИЈ1 алел назвали еиј{{10}} (слика 3Ц). Након тога, проценили смо фенотип отпорности на болести 3-недељних еиј1-1 биљака мутанта и Арабидопсис (А. тхалиана) екотипа Цолумбиа (Цол-0; дивљи тип) биљака инокулацијом са Пст ДЦ3000. Процена заражених листова 5 дана након инокулације (дпи) открила је мање некротичних лезија на листовима еиј1-1 него на листовима Цол-0 (слика 3Д). Конзистентно, еиј1-1 листови су показали значајно нижи бактеријски титар од листова Цол-0 при 5 дпи, иако бактеријски титар није показао никакву разлику између Цол-0 и еиј1-1 листова на 0 дпи (слика 3Е). Затим смо генерисали еиј1-1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА комплементарне линије трансформацијом ЕИЈ1 геномског фрагмента спојеног са секвенцом ознаке 6кХА у еиј1-1 позадину. Линије комплементације су у потпуности спасиле фенотип отпорности на патогене еиј1-1 (слика 3Е), подржавајући да је еиј1-1 мутант који губи функцију. Да би се одредио ефекат ЕИЈ1 на апопластични имунитет, фенотип отпорности на болест ових линија комплементације је такође процењен инфилтрацијом притиска Пст ДЦ3000, и добијени су слични резултати (додатна слика 4А). Да бисмо потврдили функцију ЕИЈ1, затим смо идентификовали још један Арабидопсис мутант еиј1-2 (ВисцДсЛок343Г09), који је садржао Т-ДНК инсерцију у промоторском региону ЕИЈ1 (додатна слика 5, А и Б). Транскрипти ЕИЈ1 једва су се могли детектовати у мутанту еиј1-2, што указује да је еиј1-2 нулти алел ЕИЈ1. Слично еиј1-1, тестови раста бактерија су открили да је еиј1-2 био присутан на значајно нижем бактеријском титру од Цол-0 (додатна слика 5, Д и Е). Укратко, ови резултати показују да ЕИЈ1 игра важну репресивну улогу у имунолошком одговору биљака.

Слика 1 ЕИЈ1 интерагује са ЕДС1 ин витро и ин планта. (А) Шематски дијаграм који приказује домене пронађене у ЕИЈ1, ЕДС1 и њиховим скраћеним верзијама. (Б) Двохибридни тестови квасца показују интеракције између ЕИЈ1, ЕДС1 и њихових скраћених верзија. Трансформисане ћелије квасца су узгајане на медијуму СД/-Трп/-Леу/-Хис/-Аде и СД/-Трп/-Леу. Празне, векторске контроле; АД, активациони домен; БД, ДНК-везујући домен. (Ц) Повлачење теста који показује директну интеракцију између Хис-ЕИЈ1 и ГСТ-ЕДС1 фузионих протеина ин витро. Хис-ЕИЈ1 протеини су инкубирани са имобилисаним ГСТ или ГСТ-ЕДС1 протеином. Имунопреципитиране фракције детектоване су анти-Хис и анти-ГСТ антителима, респективно. (Д) Цо-ИП који показује интеракцију ЕИЈ1 и ЕДС1 у листовима Арабидопсис. Укупни протеини екстраховани из 3-недељних 35Спро: ЕИЈ1-6ХА (као контрола генотипа) и 35Спро: ЕИЈ1-6ХА 35Спро: ЕДС1-3ФЛАГ листова су имунопреципитирани било анти-ФЛАГ антитело или преимуни серум (ИгГ). Коимунопреципитирани протеини су детектовани коришћењем анти-ФЛАГ и анти-ХА антитела, респективно. Репрезентативни резултати представљени у (Б-Д) поновљени су независно три пута.

Производња водоник пероксида (Х2О2), врсте реактивних врста кисеоника, је обележје успешног препознавања патогена и накнадне активације одбрамбених одговора биљака, укључујући програмирану ћелијску смрт повезану са ХР (Лам ет ал., 2001; Торрес ет ал. ал., 2006; Нанда ет ал., 2010). Због тога смо пратили ниво Х2О2 у 3-недељно старим Цол-0, еиј1-1 и еиј1-1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА биљке користећи 3,3-диаминобензидин (ДАБ) метод бојења. Резултати су показали да се Х2О2 акумулирао до високих нивоа у зараженим биљкама, али није откривен у неинокулисаним (лажним) биљкама (слика 3Ф). Виши ниво Х2О2 је детектован у листовима еиј1-1 него у листовима Цол- 0 и линијама комплементације инокулисаним са Пст ДЦ3000 (слика 3Ф). Штавише, док је бојење трипан плавом бојом открило да се ћелијска смрт (мицроХР, Алварез ет ал., 1998) десила у листовима еиј1-1 на 24- х након инокулације (ХПИ) са Пст ДЦ3000, али не мицроХР је примећен у биљкама Цол-0 и еиј1-1 ЕИЈпро1:ЕИЈ1-6ХА (Слика 3Г). Инокулација са авирулентним Пст ДЦ3000 (АврРпс4) је резултирала већом акумулацијом Х2О2 и више микроХР, иако није примећена видљива разлика између ова три генотипа (Слика 3, Ф и Г). Ови резултати су указивали на суштинску улогу ЕИЈ1 у базалној резистенцији на патогене.

Слика 2 Шема експресије ЕИЈ1 мРНА и протеина. (А) Локализација хлоропласта и језгра ЕИЈ1. ЕИЈ1-мЦхерри фузиони протеин је пролазно експримиран у листовима Н. бентхамиана и анализиран конфокалном микроскопијом. ДАПИ флуоресценција указује на језгро. Флуоресценција хлорофила је означена зеленом бојом. Бар=10 лм. (Б) ГУС бојење које показује експресију ЕИЈ1 у корену, стабљикама, листовима розете, цвећу, силици и 10-данима старим садницама (с лева на десно). Шипка=1 мм. (Ц) Образац експресије ЕИЈ1 у различитим ткивима Цол биљака укључујући корење, стабљике, листове розете, цветове и силике, као што је откривено кРТ-ПЦР. Релативна експресија је израчуната нормализацијом нивоа транскрипције испитиваног гена у односу на ниво АЦТИН2 (исто као доле). Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања. Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01; Додатни скуп података 1). (Д) Анализа експресије ЕИЈ1 коришћењем 3-недељних Цол биљака инокулисаних са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) или прсканих са 0,05 мМ СА. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања (додатни скуп података 1). (Е-Г) ГУС бојење показује индукцију експресије ЕИЈ1 од стране патогена. Тронедељне пЕИЈ1:ЕИЈ1-ГУС биљке су лажно инокулисане (10 мМ МгЦл2; Е) или инокулисане потапањем са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1; Ф). Шипка=1 мм. Увећана слика показује да се ЕИЈ1-ГУС концентрише на регион трихома у (Г). Бар=100 лм. Листови на 4 хпи су сакупљени и инкубирани са ГУС раствором за бојење. (Х) и (И) Образац експресије ЕИЈ1 након третмана Пст ДЦ3000 или СА. Укупни протеини су екстраховани из 3-недељних 35Спро: ЕИЈ1-6ХА биљака инокулисаних са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1; Х) или прсканих са 0,05 мМ СА (И), и детектован коришћењем анти-ХА антитела. Доњи панели показују бојење Цоомассие Бриллиант Блуе (ЦББ) као контролу пуњења. Имуноблот анализе представљене у (Х) и (И) су поновљене независно три пута.

Слика 3 Идентификација Арабидопсис ЕИЈ1 мутираног алела еиј1-1. (А) Шематски дијаграм који приказује место уметања Т-ДНК у еиј1-1 (САЛК_142975). Егзони су представљени кутијама, а интрони линијама између кутија. Црне кутије представљају регионе кодирања ЕИЈ1, а беле кутије представљају непреведени регион. Троугао означава место уметања Т-ДНК. (Б) ПЦР амплификација геномске ДНК потврђује да је еиј1-1 хомозиготни инсерцијски мутант. Коришћени прајмери ​​(П1, П2) су приказани у (А). ЛБ означава прајмер леве границе Т-ДНК, а М означава молекуларне маркере ДНК. (Ц) кРТ-ПЦР анализа експресије ЕИЈ1. Укупна РНК је екстрахована из 3-недељних листова еиј1 и Цол. Релативна експресија ЕИЈ1 у еиј1-1 је постављена на 1. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања (Скуп допунских података 1). (Д) Фенотип отпорности на болест Цол, еиј1-1, и две репрезентативне трансгене линије комплементарне ЕИЈ1 еиј1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА. Биљке старе три недеље су инокулисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.05). Приказани листови су фотографисани при 5 дпи. Шипке=5 мм. (Е) Раст бактерија Пст ДЦ3000 на биљкама описаним у (Д) при 0 и 5 дпи. цфу/г, јединице које формирају колоније по г свеже тежине. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања. Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01, скуп додатних података 1). (Ф) Испитивање нивоа Х2О2 у листовима Цол,

ЕИЈ1 посредује у имунитету биљака потискивањем активности ЕДС1

Да бисмо разумели генетски однос између ЕДС1 и ЕИЈ1, генерисали смо еиј1-1 едс1-22 двоструке мутантне линије укрштањем еиј1-1 мутанта са едс1-22, губитком- функција мутантног алела ЕДС1-90 (АТ3Г48090; Цол-0 позадина), који показује компромитовану отпорност на патогене (Ианг и Хуа, 2004). Није примећена морфолошка разлика међу мутантним биљкама еиј1-1, едс1-22 и еиј1-1 едс1-22 у нормалним условима раста (Слика 4, А и Б). Након инокулације са Пст ДЦ3000, еиј1-1 мутантне биљке су показале већу отпорност од Цол-0 биљака при 5 дпи (Слика 4, А и Б). Међутим, двоструки мутант еиј1-1 едс1-22 је показао изузетне некротичне лезије и висок титар бактерија, упоредив са појединачним мутантом едс1-22, што указује да алел еиј1-1 није био у стању за спасавање фенотипа едс1-22 осетљивог на болести (Слика 4, А и Б). Отпорност на болест је такође процењена након инфилтрације Пст ДЦ3000 под притиском и добијени су слични резултати (додатна слика 4Б). Штавише, користили смо нулти алел ЕДС1, едс1-2; Цол-0 позадина; Бартсцх ет ал., 2006), за генерисање еиј1-1 едс1-2 двоструких мутантних биљака за генетску анализу. Слично као код еиј1-1 едс1-22, еиј1-1 едс1-2 биљке двоструког мутанта су такође показале изузетне некротичне лезије и већи бактеријски титар од еиј1-1, који је био упоредиви са едс1-2 појединачним мутантом (допунска слика 6). Ови генетски докази сугеришу да је ЕДС1 епистатичан на ЕИЈ1. У складу са горе наведеним запажањима, Х2О2 се акумулирао до високих нивоа у еиј1-1 листовима, али до ниских нивоа у едс1- 22 и еиј1-1 едс1-22 листовима, у поређењу са Цол{{ 53}} листова, након инокулације Пст ДЦ3000 (Слика 4Ц). Штавише, микроХР у еиј1-1 је јасно потиснут губитком функције ЕДС1 на 24 хпи са Пст ДЦ3000 или авирулентним Пст ДЦ3000 (АврРпс4; Слика 4Д). У складу са овим резултатом, нивои експресије ИЦС1 и ПР1 у еиј1-1 едс1-22 и едс1-22 биљкама били су упоредиви, али знатно нижи од оних у еиј1-1 и Цол{ {71}} биљке (слика 4Е). Ови резултати потврђују да ЕИЈ{73}посредовани урођени имуни одговор зависи од ЕДС1. Да бисмо истражили улогу интеракције ЕИЈ1–ЕДС1 у имунолошком одговору биљака, извршили смо РНА-сек анализу листова еиј1-1, едс1-22 и Цол-0 при 24 хпи са Пст ДЦ3000 ; са неинокулисаним листовима Цол-0 коришћени су као лажни третман. Укупно 2762, 923 и 622 различито изражена гена (ДЕГ) идентификовано је у Цол_Пст ДЦ3000 у односу на Цол_моцк, еиј1-1_Пст ДЦ3000 против Цол_ Пст ДЦ3000 и едс1-22_Пст ДЦ3000 наспрам Цол_Пст ДЦ3000 поређења. Ови гени се у даљем тексту називају гени који реагују на патогене, ЕИЈ1-регулисани и ЕДС{100}}регулисани гени, респективно (додатна слика 7А и скуп података 2). Међу овим генима, 471 је регулисано ЕИЈ1; 396 је регулисано ЕДС1 (Слика 4Ф; Додатни скуп података 2); а 124 су корегулисали ЕИЈ1 и ЕДС1 (слика 4Ф). Кластер анализа је показала да је 93,5% (116) корегулисаних гена (124) регулисано навише од стране ЕДС1 и наниже од стране ЕИЈ1 (слика 4Ф; Додатна слика 7Б и скуп података 2), подржавајући репресивну улогу ЕИЈ1 на ЕДС1 функција. Анализа генске онтологије (ГО) је даље открила да је већина гена који су антагонистички регулисани од стране ЕИЈ1 и ЕДС1 углавном укључени у одговоре на стрес и урођене имуне одговоре (Слика 4Г; Додатна табела С1). Ове анализе сугеришу да ЕИЈ1 и ЕДС1 регулишу гене повезане са резистенцијом на контрастан начин током инфекције патогеном. Значајан део гена регулисаних ЕДС{135}(272/396) није регулисан ЕИЈ1, вероватно због ниже промене набора (52) или ЕИЈ{140}независне функције ЕДС1.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

ЕИЈ1 ступа у интеракцију са ЕДС1 у цитоплазми и инхибира нуклеарну трговину ЕДС1

ЕИЈ1 је локализован на хлоропласту и језгру ћелија листа (Слика 2А), док ЕДС1 протеин показује образац дистрибуције нуклеоцитоплазме, који се јавља на оба места (Гарцı´а ет ал., 2010). Да бисмо истражили где и како ЕИЈ1 интерагује са ЕДС1 у плантажи, извршили смо тестове пролазне експресије користећи протопласте Арабидопсис. Занимљиво, иако је ЕИЈ1 задржао свој оригинални субћелијски образац локализације у хлоропласту и језгру у присуству зеленог флуоресцентног протеина (ГФП; контрола), ЕИЈ1-мЦхерри локализован на хлоропласту је био дифундован у цитоплазми када се коекспримирао са ЕДС{ {9}}ГФП у протопластима (Слика 5А, погледајте реплике у Додатној датотеци 2). Овај феномен је потврђен у епидермалним ћелијама Н. бентхамиана, у којима је ЕИЈ1-мЦхерри био пролазно ко-експримиран или са ЕДС1-ГФП или ГФП контролом (додатна слика 8, погледајте реплике у додатном фајлу 2) . Ова запажања показују да прекомерна експресија ЕДС1 може довести до субћелијске релокализације ЕИЈ1. Затим, да бисмо одредили субћелијску локацију на којој ЕДС1 и ЕИЈ1 интерагују, извршили смо падајућу анализу користећи рекомбинантни глутатион С-трансферазу (ГСТ)-ЕДС1 фузиони протеин (мамац) и екстракт укупног протеина, фракције осиромашене језгром и језгра. обогаћене фракције 35Спро: ЕИЈ1-ХА трансгене линије (протеини плена). Наши резултати су показали да се ЕДС1 имунопреципитирао са ЕИЈ1-ХА када се користи екстракт укупног протеина и фракција осиромашених језгрима 35Спро: ЕИЈ1-ХА листови, али није када се користе фракције обогаћене језгром (Слика 5Б), што сугерише да се интеракција између ЕИЈ1 и ЕДС1 дешава у цитоплазми.

Слика 4 ЕИЈ1 и ЕДС1 супротно регулишу отпорност биљака на патогене. (А) Фенотип отпорности на болест Цол, еиј1-1, едс1-22 и еиј1-1 едс1-22. Биљке старе три недеље су инокулисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.05). Приказани листови су фотографисани при 5 дпи. Шипка=5 мм. (Б) Раст бактерија Пст ДЦ3000 на биљкама описаним у (А) при 0 и 5 дпи. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања. Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01, скуп додатних података 1). (Ц) Испитивање нивоа Х2О2 у биљкама Цол, еиј1-1, едс1-22 и еиј1-1 едс1-22. Биљке старе три недеље су инокулисане са Пст ДЦ3000 или Пст ДЦ3000 (АврРпс4; ОД600=0.1), а затим обојене са ДАБ при 24 хпи. Бар=500 лм. (Д) Анализа ћелијске смрти биљака Цол, еиј1-1, едс1-22 и еиј1-1 едс1-22. Биљке старе три недеље су дипинокулисане са Пст ДЦ3000 или Пст ДЦ3000 (АврРпс4; ОД600=0.1), а затим обојене трипан плавим на 24 хпи. Бар=500 лм.

С обзиром на то да ЕИЈ1 негативно регулише имуни одговор биљака на начин који зависи од ЕДС1-(слика 4), затим смо испитали ефекат патогена на интеракцију између ЕИЈ1 и ЕДС1. Изненађујуће, инфекција Пст ДЦ3000 је побољшала интеракцију ЕДС1-ЕИЈ1 у цитоплазми, а не у хлоропласту и језгру (Слика 5Ц, види реплике у Додатној датотеци 2). Овај налаз, заједно са нуклео-цитоплазматским узорком дистрибуције ЕДС1 и улогом нуклеарне локализације ЕДС1 у јачању отпорности патогена на нивоу транскрипције (Гарцı´а ет ал., 2010), приморао нас је да истражимо улогу ЕИЈ1 у субцелуларни промет ЕДС1 током инфекције патогеном. Када смо привремено изразили ЕДС1-3ФЛАГ у протопластима Арабидопсис изолованим из биљака еиј1-1, прекомерне експресије ЕИЈ1 и Цол-0, ЕИЈ1 је значајно потиснуо трговину ЕДС1 у језгро (допунска слика 9) . Штавише, имуноблот анализа је открила малу разлику у обиљу укупног ЕДС1 протеина између едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ и еиј1-1 едс1-22 ЕДС1про: ЕДС{{30} }ФЛАГ трансгене биљке (Слика 5Д, погледајте реплике у Додатној датотеци 2). Међутим, у поређењу са едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ трансгене биљке, Пст ДЦ3000- инокулисане еиј1-1 едс1-22 ЕДС1про: ЕДС13ФЛАГ биљке су показале значајно повећање у нивоу ЕДС1 протеина обогаћеног језгрима и смањење нивоа ЕДС1 локализованог у цитоплазми (Слика 5Д, види реплике у Додатној датотеци 2), потврђујући репресивну улогу ЕИЈ1 у промету ЕДС1 од цитоплазме до језгра. Затим смо тестирали да ли је овај процес редистрибуције посредован интеракцијом ЕИЈ1-ЕДС1 утицао на регулацију транскрипције гена повезаних са резистенцијом у биљкама. 35Спро: ЕИЈ1-мЦхерри и 35Спро: ЕДС1-3ФЛАГ ефекторски конструкти су трансформисани појединачно или заједно са репортерским конструктима у епидермалне ћелије листа Н. бентхамиана (Слика 5Е). На 24 хпи са Пст ДЦ3000, ЕДС1 је активирао експресију ПР1 и ИЦС1 (Слика 5Ф), док је ЕИЈ1 значајно инхибирао ЕДС1-индуковану експресију гена (Слика 5Ф). За разлику од ЕИЈ1 пуне дужине, Н-терминални крај протеина ЕИЈ1, који није под утицајем еиј1-1, није био у стању да инхибира експресију ПР1 изазвану ЕДС1- (додатна слика 10, А и Б ), што указује да је нетакнута структура протеина ЕИЈ1 неопходна за његову репресивну функцију. Заједно, ови резултати подржавају да ЕИЈ1 функционише као суштински репресор у одговору отпора посредованом ЕДС{77}регулацијом нуклеоцитоплазматског промета ЕДС1. Пошто је протеин ЕИЈ1 постепено разграђиван у биљкама инокулисаним Пст ДЦ3000- или СА третираним након брзе почетне индукције (слика 2, Х и И), истражили смо да ли ЕДС1, заузврат, покреће деградацију ЕИЈ1 путем интеракција протеин-протеин. Тестови деградације без ћелија и тестови ин виво детекције протеина помоћу едс1-22 35Спро: ЕИЈ1-ХА трансгених биљака показали су да ни одсуство ни присуство ЕДС1 не утичу на деградацију ЕИЈ1 (додатна слика 11), што сугерише да ЕДС1 није укључен у деградацију ЕИЈ1 изазвану патогеном.

Предности цистанцхе тубулоса- ојачати имуни систем

Инфекција патогеном мења субцелуларну локализацију ЕИЈ1

Повећана интеракција између ЕИЈ1 и ЕДС1 у цитоплазми након инокулације патогена (Слика 5, Б и Ц) имплицирала је могућу релокализацију ЕИЈ1 изазвану патогеном у биљним ћелијама. Да бисмо тестирали ову могућност, испитали смо субћелијску локализацију ЕИЈ1 у листовима Н. бентхамиана инокулисаним са Пст ДЦ3000. У неинфицираним условима, ЕИЈ1-мЦхерри је локализован на хлоропласту и језгру. Међутим, при 24 дпи, сигнали флуоресценције су у великој мери смањени у хлоропластима и појачани у цитоплазми (слика 6А). Да би се даље утврдило да ли патогени изазивају одвајање ЕИЈ1 од хлоропласта у цитоплазму у листовима, извршена је имуноблот анализа протеина ЕИЈ1 коришћењем 35Спро: ЕИЈ1-6ХА трансгених биљака. Укупни протеини, протеини хлоропласта и цитоплазматски протеини су изоловани из 35Спро: ЕИЈ{15}}ХА трансгених биљака при 0 и 4 хпи са Пст ДЦ3000. Обиље ЕИЈ1 је значајно повећано у цитоплазматској фракцији, али је смањено у фракцији хлоропласта на 24 дпи (Слика 6Б, погледајте реплике у Додатној датотеци 2), што указује на негативну корелацију између нивоа протеина ЕИЈ1 у хлоропласту и цитоплазми.

Слика 5 ЕИЈ1 ступа у интеракцију са ЕДС1 у цитоплазми како би посредовао у нуклеарној трговини ЕДС1. (А) Анализа пролазне експресије која показује локализацију ЕДС1 и ЕИЈ1 у протопластима Арабидопсис. Бар=10 лм. (Б) Пулл-довн тест интеракције између ЕИЈ1 и ЕДС1. Укупни протеини, фракције осиромашене језгром и фракције обогаћене језгрима екстраховане из 3-недељних еиј1-1 35Спро: ЕИЈ1-6ХА трансгених биљака су инкубиране са имобилисаним ГСТ-ЕДС1 или ГСТ протеинима , редом. ИП-ови су детектовани коришћењем анти-ХА или анти-ГСТ антитела. ПЕПЦ и хистон Х3 коришћени су као цитоплазматски и нуклеарни маркери, респективно. Звездице означавају траке ГСТ-ЕДС1 протеина. (Ц) Пст ДЦ3000 инфекција појачава интеракцију протеина ЕДС1 и ЕИЈ1 у цитоплазми. Укупни протеини, фракције осиромашене језгром, фракције обогаћене језгром и протеини хлоропласта екстраховани су из 3-недељних ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА 35Спро: ЕДС1-3ФЛАГ биљака инокулисаних са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) или лажно инокулисан на 4 хпи, и имунопреципитиран коришћењем или анти-ФЛАГ антитела или преимуног серума (ИгГ). Ко-имунопреципитирани протеини су детектовани коришћењем анти-ХА и анти-ФЛАГ антитела. Н-осиромашене фракције осиромашене језгрима; Н-обогаћене фракције обогаћене језгром. ПЕПЦ и хистон Х3 коришћени су као цитоплазматски и нуклеарни маркери, респективно. (Д) Имуноблот анализа показује да ЕИЈ1 посредује у цитоплазматској наспрам нуклеарне дистрибуције ЕДС1. Укупни протеини, фракције осиромашене нуклеусима и фракције обогаћене језгрима су екстраховане из 3-недељних издања1-22 ЕДС1про: ЕДС1- 3ФЛАГ и еиј1-1 издања{{59 }} ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ трансгене биљке инокулисане потапањем са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) или лажно инокулисане на 4 хпи, и откривене коришћењем анти-ФЛАГ антитела. Релативни интензитет протеина из едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ са лажним третманом инокулације постављеним на 1. М, лажни; П, Пст ДЦ3000. ПЕПЦ и хистон Х3 коришћени су као цитоплазматски и нуклеарни маркери, респективно. Резултати представљени у (А), (Ц) и (Д) поновљени су независно три пута (додатни фајл 2). (Е) и (Ф) Пролазна анализа активности промотора ПР1 и ИЦС1 регулисане ЕИЈ1 и ЕДС1. Различити конструкти који се користе у тестовима пролазне експресије приказани су у (Е). Или ПР1про: ГУС или ИЦС1про: ГУС је котрансформисан ефекторима или празним вектором (контрола) у листове Н. бентхамиана стерилисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) током 24 сата. Релативна ГУС активност (ГУС/Луцифераза) која указује на ниво експресије ПР1 и ИЦС1 регулисан различитим ефекторима је приказана на (Ф). Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања (додатни скуп података 1). Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01).

Дисоцијација ЕИЈ1 изазвана патогеном од хлоропласта сугерише потенцијалну функцију ЕИЈ1 у цитоплазми. Да бисмо тестирали ову могућност, имобилисали смо ЕИЈ1 протеин на хлоропласте везивањем секвенце која циља на хлоропласт (ЦТС; Лее ет ал., 2008) на Н-терминални крај ЕИЈ1-мЦхерри репортер гена. ЦТС-ЕИЈ1-мЦхерри фузија је затим изражена у листовима Н. бентхамиана под контролом нативног промотера. Флуоресценција је откривена само у хлоропластима, али не и у цитосолу и језгру листова Н. бентхамиана инокулисаних са Пст ДЦ3000- (додатна слика 12А). Ово запажање је потврдило да је ЦТСтаггед ЕИЈ1 задржан у хлоропласту и да није присиљен у цитоплазму инфекцијом патогеном. Након тога смо генерисали ЕИЈ1про: ЦТС-ЕИЈ1-6ХА трансгене Арабидопсис линије да проценимо биолошку функцију ЦТС-ЕИЈ1 у имунолошком одговору биљке. Као што се очекивало, за разлику од еиј1-1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА, еиј1-1 ЕИЈ1про: ЦТС-ЕИЈ1-6ХА линије нису показале значајну разлику у отпорности на патогене у поређењу са еиј1-1, што указује да ЕИЈ1 имобилисан у хлоропласту није у стању да спасе фенотип отпорности на болести еиј1-1 (слика 6Ц). У складу са овим запажањем, експресија ПР1 је одржана на високом нивоу у еиј1-1 ЕИЈ1про: ЦТСЕИЈ1-6ХА трансгеним биљкама, слично еиј1-1 (додатна слика 12Б). Поред тога, ЦТС-ЕИЈ1 је показао мању способност да потисне активност транскрипције ЕДС1 од ЕИЈ1 (Слика 6, Д и Е). Ови резултати су нас довели до закључка да рани одговор домаћина на инфекцију патогеном покреће субћелијску релокализацију ЕИЈ1, што заузврат модулира имуни одговор потискивањем промета ЕДС1 у језгро.

ЕИЈ1 регулише одговор изазван ефектором вируленције

АврРпс4 ефекторски протеин П. сирингае који се излучује системом секреције типа ИИИ препознаје ТИР-НБ-ЛРР рецептор РПС4 да иницира ЕТИ, који зависи од ЕДС1 (Гассманн ет ал., 1999; Виртхмуеллер ет ал., 2007; Хеидрицх ет ал., 2012). Инокулисали смо листове еиј1-1 са авирулентним Пст ДЦ3000 (АврРпс4) или вирулентним Пст ДЦ3000 да бисмо проценили да ли је ЕИЈ1 укључен у ЕТИ. Листови еиј1-1 показали су већу отпорност на вирулентни Пст ДЦ3000 него листови Цол-0 (слика 7А). Међутим, није примећена значајна разлика између листова Цол-0 и еиј1-1 у отпорности на авирулентни Пст ДЦ3000 (АврРпс4), иако су оба генотипа показала већу отпорност на авирулентни Пст ДЦ3000 (АврРпс4) него на Пст ДЦ3000 ( Слика 3, Ф и Г; Слика 7, А), што указује да ЕИЈ1 можда није неопходан за РПС4-индуковани ЕТИ. Такође смо утврдили отпорност биљака на Пст ДЦ3000 хрцЦ, који садржи дефектан систем секреције типа ИИИ и не успева да убризга ефекторе у ћелије домаћина да би сузбио ПТИ (Гассманн ет ал., 1999; Глоггнитзер ет ал., 2014). И еиј1-1 мутант и Цол-0 листови су показали сличну отпорност на Пст ДЦ3000 хрцЦ (додатна слика 13), што сугерише да ЕИЈ1 није укључен у ПТИ.

С обзиром да је нуклеарна акумулација ЕДС1 неопходна за репрограмирање експресије и резистенције одбрамбених гена изазвано ТИР-НБ-ЛРР (Гарцı´а ет ал., 2010), испитали смо да ли ЕИЈ1 регулише субћелијску дистрибуцију ЕДС1 као одговор на ЕТИ. Инокулисани су листови 3-недељних едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ и еиј1-1 едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ биљке са Пст ДЦ3000 или Пст ДЦ3000 (АврРпс4), а фракције осиромашене и језгрима обогаћене су екстраховане при 0 и 4 хп. У складу са претходном студијом (Гарцı´а ет ал., 2010), уочено је повећање нуклеарне локализације ЕДС1 у едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ биљкама инокулисаним са Пст ДЦ3000 (АврРпс4), али не и код оних инокулисаних са Пст ДЦ3000. Међутим, губитак функције ЕИЈ1 није утицао на ЕТИ-индуковану нуклеарну акумулацију ЕДС1 (Слика 7Б; видети реплике у Додатној датотеци 2). Ово сугерише да авирулентни Пст ДЦ3000 (АврРпс4) или покреће трговину ЕДС1 у језгро заобилазећи ЕИЈ1 или укида функцију ЕИЈ1 на непознат начин. Да бисмо тестирали ове могућности, испитали смо ефекат авирулентног Пст ДЦ3000 (АврРпс4) на ниво ЕИЈ1. Слично резултатима добијеним коришћењем линија прекомерне експресије ЕИЈ1 (Слика 2Х), биљке еиј1-1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА инокулисане са Пст ДЦ3000 показале су повећану акумулацију ЕИЈ1 у раној фази инфекције, иако је ЕИЈ1 постепено деградиран након 8 хпи (Слика 7Ц; видети реплике у Додатној датотеци 2). Акумулација ЕИЈ1 је довољна да спречи трговину ЕДС1 у језгру коју је покренуо Пст ДЦ3000- у раној фази инфекције (Слике 5, Д и 7, Б). У складу са овим резултатом, губитак функције ЕИЈ1 убрзао је нуклеарну транслокацију ЕДС1 у зараженим биљкама (додатна слика 14). Насупрот томе, Пст ДЦ3000 (АврРпс4) је укинуо функцију ЕИЈ1 брзим изазивањем деградације протеина ЕИЈ1, али не потискивањем транскрипције гена ЕИЈ1 (слика 7Ц; Додатна слика 15), чиме је промовисала више нуклеарне транслокације ЕДС1 у раној фази инфекције (слика 7Б ). Опажање да су еиј{76}} биљке инокулиране са Пст ДЦ3000 показале отпорност упоредиву са оном код биљака Цол-0 и еиј1-1 инокулисаних авирулентним Пст ДЦ3000 (АврРпс4) подржава ову хипотезу. Ово може објаснити, барем донекле, зашто авирулентни сој, али не и вирулентни сој, може да створи појачани отпор да би покренуо ЕТИ одговор. Стога, ова запажања сугеришу да је ЕИЈ1 укључен у одговор изазван ефектором вируленције у ћелијама домаћина.

Слика 6 Релокализација ЕИЈ1 у цитоплазму је неопходна за ЕДС1-зависну резистенцију. (А) Пст ДЦ3000 инфекција мења субћелијску локализацију ЕИЈ1. ЕИЈ1-мЦхерри је пролазно експримиран у листовима Н. бентхамиана стерилизираним са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) или лажно инокулисаним током 24 сата. Бар=10 лм. (Б) Инфекција Пст ДЦ3000 изазива одвајање ЕИЈ1 од хлоропласта. Укупни протеини, цитоплазматски протеини и хлоропластични протеини су екстраховани из 3-недељних ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА биљака инокулисаних потапањем са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) или лажно инокулисаних на 4 хпи и детектован анти-ХА антителом. ПЕПЦ, хистон Х3 и РбцЛ коришћени су као цитоплазматски, нуклеарни и хлоропластични маркери. Релативни интензитет протеина са лажним третманом је постављен на 1. Резултати представљени у (А) и (Б) су поновљени независно три пута (додатни фајл 2). (Ц) Имобилисани ЕИЈ1 у хлоропластима није у стању да поврати отпор еиј1-1. Биљке старе три недеље су инокулисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.05). Одређен је бактеријски титар Пст ДЦ3000 при 0 и 5 дпи. ЦТС, сигнали локализације хлоропласта. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања (додатни скуп података 1). (Д) и (Е) Пролазна анализа активности ПР промотера регулисана ЕИЈ1, ЦТС-ЕИЈ1 и ЕДС1. Различити конструкти који се користе у тестовима пролазне експресије приказани су у (Д). ПР1про: ГУС је ко-трансформисан са ефекторима или празним вектором (контрола) у листове Н. бентхамиана стерилисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1) током 24 х. Релативна ГУС активност (ГУС/Луцифераза) која указује на ниво експресије ПР1 регулисан различитим ефекторима приказана је у (Е). Траке грешака представљају стандардну девијацију троструких независних узорака. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања. Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01, скуп додатних података 1).

Слика 7 ЕИЈ1 и ЕДС1 модулирају базални отпор биљке. (А) Раст бактерија Цол и еиј1-1 мутанта. Биљке старе три недеље су инокулисане са Пст ДЦ3000 или Пст ДЦ3000 (АврРпс4; ОД600=0.05). Одређен је бактеријски титар Пст ДЦ3000 при 0 и 5 дпи. Подаци су средња вредност ± СД за три биолошка понављања. Мала слова означавају значајне разлике (једносмерна АНОВА, П 5 0.01, скуп додатних података 1). (Б) ЕИЈ1 тешко утиче на акумулацију ЕДС1 у језгрима изазвану Пст ДЦ3000 (АврРпс4). Фракције осиромашене језгром и фракције обогаћене језгрима су екстраховане из 3-недељних издања1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ и еиј1-1 едс1-22 ЕДС1про: ЕДС1-3ФЛАГ трансгене биљке потапањем инокулисане са Пст ДЦ3000 (ОД600=0.1), Пст ДЦ3000 (АврРпс4; ОД600=0.1) или лажно инокулисане на 4 хпи и откривене коришћењем анти-ФЛАГ антитело. ПЕПЦ и хистон Х3 коришћени су као цитоплазматски и нуклеарни маркери, респективно. Релативни интензитет протеина из биљака са лажним третманом постављен је на 1. М, лажни; П, Пст ДЦ3000; Р, Пст ДЦ3000 (АврРпс4). (Ц) Инфекција Пст ДЦ3000 (АврРпс4) промовише деградацију протеина ЕИЈ1. Укупни протеини су екстраховани из 3-недељних еиј1-1 ЕИЈ1про: ЕИЈ1-6ХА биљака инокулисаних са Пст ДЦ3000 или Пст ДЦ3000 (АврРпс4; ОД600=0.1) , и детектован коришћењем анти-ХА антитела. Доњи панел приказује бојење са Цоомассие Бриллиант Блуе (ЦББ) као контролу пуњења. Репрезентативни резултати представљени у (Б) и (Ц) су поновљени независно још два пута и испитани са анти-АЦТИН антителом као контролом пуњења (додатни фајл 2). (Д) Хипотетички модел ЕИЈ1 који регулише ЕДС1-зависну базалну отпорност биљака. Када биљке нападну патогени, ЕИЈ1 се брзо ослобађа из хлоропласта у цитоплазму где ступа у интеракцију са ЕДС1. Интеракција ЕИЈ1–ЕДС1 спречава пребацивање ЕДС1 из цитоплазме у језгро и на тај начин ограничава нуклеарну резистенцију ЕДС1, омогућавајући модулацију имуних одговора посредованих ЕДС{74}. Стрелице и затупљене линије указују на активацију и потискивање, респективно.

Дискусија

Да би максимизирале преживљавање, биљке су развиле прецизан механизам за оптимизацију раста и одбрану од инвазивних патогена, иако су бројни детаљи ових механизама остали нејасни. ЕДС1 заузима кључну позицију у сигналној мрежи урођеног имунитета биљке, пошто регулише отпорност на биотрофне и хемибиотрофне патогене (Виермер ет ал., 2005). У овој студији идентификовали смо ген, ЕИЈ1, који кодира протеин ДнаЈ пратиоца, и показали да ЕИЈ1 реагује на рану инфекцију патогеном и да игра улогу у урођеном имунитету биљака директном интеракцијом са ЕДС1. На основу ових налаза, предлажемо регулаторни модел за ЕИЈ1 (слика 7Д). Када биљке нападну патогени, ЕИЈ1 се брзо ослобађа из хлоропласта у цитоплазму, где ступа у интеракцију са ЕДС1. Ова интеракција ЕИЈ1–ЕДС1 спречава пребацивање ЕДС1 из цитоплазме у језгро, а то ограничава нуклеарну отпорност ЕДС1, омогућавајући модулацију имуних одговора посредованих ЕДС{13} као што је индукција биосинтезе СА и изражавање резистенције -сродни гени. Када биљке трпе континуиране стимулације од инвазивних патогена, ЕИЈ1 се постепено разграђује, што доводи до повећане нуклеарне акумулације ЕДС1 за јачање отпорности. Ови налази илуструју суштинску репресивну улогу ЕИЈ1 током раног одговора домаћина на инвазију патогена, попуњавајући празнину у нашем разумевању како је субћелијска локализација ЕДС1 регулисана да би пружила отпор.

Анализа секвенце је открила да је ЕИЈ1 ДнаЈ протеин. Геном Арабидопсис кодира седам различитих класичних типова ДнаЈ протеина (Пулидо и Леистер, 2018). Претходне студије показују да ДнаЈ протеини играју важне и различите улоге у имунитету биљака. На пример, соја (Глицине мак) ГмХСП40 позитивно регулише смрт ћелија и отпорност на болести (Лиу и Вхитхам, 2013). Насупрот томе, протеин пиринча (Ориза сатива Л.) Ос-ДјА6 негативно регулише урођени имунитет биљака кроз пут деградације протеазома посредован убиквитинацијом (Зхонг ет ал., 2018). Ефектор вируленције Хопл1 специфичан за П. сирингае, који садржи Ј домен, усмерен је на хлоропласт, где ступа у интеракцију са биљном механизацијом за одговор на стрес (Јеленска ет ал., 2007). Ове студије показују да ДнаЈ протеини играју различите улоге у одбрамбеном одговору биљака. Тсип1, Н. табацум ДнаЈ протеин хомологан ЕИЈ1, регулише Тси{13}}посредовану транскрипциону активацију гена као одговор на стрес (Хам ет ал., 2006). Тси1 кодира фактор транскрипције типа АПЕТАЛА2 (АП2) који функционише као важан регулатор у одговорима на биотички и абиотски стрес код Н. табацум (Парк ет ал., 2001). СА покреће релокализацију Тсип1 из хлоропласта у цитоплазму, што олакшава интеракцију између Тсип1 и Тси1 и накнадни улазак Тсип1-Тси1 комплекса у језгро ради транскрипционе активације гена повезаних са стресом (Хам ет ал., 2006) . За разлику од Тсип1, ЕИЈ1 је био локализован на хлоропласту и језгру у нормалним условима у овој студији. Показали смо да инфекција патогеном покреће релокализацију ЕИЈ1 из хлоропласта у цитоплазму и да интеракција између ЕИЈ1 и ЕДС1 у цитоплазми инхибира нуклеарну резистенцију посредовану ЕДС{32}}. У складу са овим налазом, еиј1 мутант са губитком функције показао је већу отпорност на патогене од дивљег типа (Цол-0). Ово потврђује да ЕИЈ1 игра негативну улогу у урођеном имунитету биљака. Према претходним студијама, координиране нуклеарне и цитоплазматске активности ЕДС1 су од суштинског значаја за биљке да доврше урођени имуни одговор на патогене (Гарцı´а ет ал., 2010; Хеидрицх ет ал., 2011). Нуклеарна локализација ЕДС1 је потребна за ТНЛ-индуковано репрограмирање транскрипције отпорности да би се индуковали СА-повезани и други одбрамбени одговори биљака (Виртхмуеллер ет ал., 2007). Цитоплазматски ЕДС1 базен се такође одржава током процеса инфекције ради потпуне отпорности на патогене (Гарцı´а ет ал., 2010). Ова запажања изазивају значајну забринутост у погледу тога како биљке прецизно регулишу алокацију ЕДС1 између цитоплазме и језгра за правилне одбрамбене одговоре када су изазване инфекцијом патогеном. Овде показујемо да је прецизна алокација ЕДС1 у различите субћелијске одељке делимично регулисана ЕИЈ1 преко интеракције протеин-протеин. Мутација губитка функције ЕИЈ1 је значајно промовисала трговину ЕДС1 у језгро (Слике 5, Д и 7, Б), што је довело до повећане отпорности на болести.

Пошто се ЕИЈ1 брзо индуковао у раној фази инфекције патогеном и потом разградио током развоја болести, спекулишемо да је ЕИЈ1 важан негативни регулатор имунитета који омогућава биљкама да побољшају своју оптималну одбрану. ЕИЈ1-посредована репресија активности ЕДС1 могла би да спречи изазивање непотребних имуних одговора на краткорочну стимулацију као што је повремени напад патогених бактерија. Алтернативно, патогене бактерије могу манипулисати имунитетом домаћина тако што покрећу одвајање ЕИЈ1 од хлоропласта, вероватно лучењем вирулентних ефектора. Нисмо могли искључити могућност да ЕИЈ1 обавља непознату функцију у хлоропласту. Као што знамо, СА, биљни хормон и сигнални молекул укључен у отпорност на биотрофне патогене, биосинтетише се првенствено у хлоропласту, а затим се извози у цитоплазму помоћу ЕДС5, транспортера више лекова и токсина (Серрано ет ал., 2013). ЕИЈ1 је вероватно негативан регулатор акумулације СА, пошто је смањио експресију биосинтетичког гена СА ИЦС1 након инокулације патогена (Слика 4Е). Поред ЕИЈ1-посредоване транскрипционе репресије путем интеракције са ЕДС1, могуће је да ЕИЈ1 такође игра директну улогу у биосинтези СА или транспорту СА из хлоропласта на неидентификован начин. Не би било изненађујуће ако би се открило да су ЕИЈ1 и процес биосинтезе СА повезани у будућој студији. Занимљиво је да је ЕИЈ1 такође био локализован на језгру. Иако ЕИЈ1 није ступио у интеракцију са ЕДС1 у језгру, вероватно због недостатка есенцијалних кофактора или модификација, функција ЕИЈ1 локализованог у језгру је вредна даљег истраживања.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Патогене бактерије производе интрацелуларне ефекторе да би субвертирале ПТИ домаћина циљајући протеине отпорности на патогене као што су ПРР, док биљни цитоплазматски рецептори слични НОД осећају ове ефекторе да иницирају ЕТИ (Доу и Зхоу, 2012; Кхан ет ал., 2016). Претходне студије и наши резултати су показали да авирулентни Пст ДЦ3000 (АврРпс4) промовише промет цитоплазматског ЕДС1 у језгро (Гарцı´а ет ал., 2010). Штавише, наши резултати нису показали значајну разлику у Пст ДЦ3000 (АврРпс4) који је покренуо нуклеарну акумулацију ЕДС1 и накнадну отпорност на патогене између биљака Цол-0 и еиј1-1 мутанта (Слика 7, А и Б) . Поред тога, отпорност коју је показао мутант еиј1-1 била је упоредива са оном коју су показале биљке Цол-0 инокулисане са Пст ДЦ3000 хрцЦ сојем са дефектним системом секреције типа ИИИ (додатна слика 12). Штавише, акумулација ЕИЈ1 је била знатно нижа у биљкама инокулисаним са авирулентним Пст ДЦ3000 (АврРпс4) него у биљкама инокулисаним са вирулентним Пст ДЦ3000 (Слика 7Ц), што указује да је ЕИЈ1 суштински регулатор имуног одговора изазваног ефектором вируленције у ћелијама домаћина. Пошто су биљке инокулисане Пст ДЦ3000-еиј1-1 опонашале фенотип резистенције Цол-0 биљака инокулисаних са Пст ДЦ3000 (АврРпс4) (слике 3, Ф, Г, 4, Ц, Д и 7, А), ЕИЈ1 може функционисати као баријера за спречавање индукције ЕТИ вирулентним сојевима. У закључку, идентификовали смо ЕИЈ1, пратећи ДнаЈ протеин, и показали да је укључен у рани имуни одговор на биљне патогене. Интеракција између ЕИЈ1 и ЕДС1 потискује нуклеарну трговину ЕДС1, вероватно да би се спречила краткорочна стимулација непотребним имунолошким одговорима биљака, да би се олакшала патогена инвазија механизмом манипулације, или обоје. Без обзира на основни механизам, алел ЕИЈ1 би се могао користити као ефикасна потенцијална мета за модификацију урођеног имунитета биљака у оплемењивању отпорности на болести. Пошто ЕИЈ1 не утиче на нормалан раст биљака, слабљење функције ЕИЈ1 путем уређивања генома може значајно подићи ниво отпорности усева на болести са малим утицајем на раст.

Референце

Алварез, МЕ, Пеннелл, РИ, Меијер, ПЈ, Исхикава, А, Дикон, РА, Ламб, Ц (1998) Реактивни кисеоник интермедијери посредују у системској сигналној мрежи у успостављању имунитета биљака. Целл 92: 773–784

Ан, Ц, Моу, З (2011) Салицилна киселина и њена функција у имунитету биљака. Ј Интегр Плант Биол 53: 412–428

Армбрустер, У, Царрилло, ЛР, Венема, К, Павловић, Л, Сцхмидтманн, Е, Корнфелд, А, Јанс, П, Берри, ЈА, Крамер, ДМ, Јоникас, МЦ (2014) Ионски антипорт убрзава фотосинтетичку аклимацију у флуктуирајућој свјетлости окружења. Нат Цоммун 5: 5439

Бартсцх, М, Гоббато, Е, Беднарек, П, Дебеи, С, Сцхултзе, ЈЛ, Баутор, Ј, Паркер, ЈЕ (2006) ПОБОЉШАНА ОСЈЕЋИВОСТ НА БОЛЕСТИ независна од салицилне киселине сигнализација у имунитету Арабидопсис и ћелијској смрти је регулисана монооксигеназом ФМО1 и Нудик хидролаза НУДТ7. Плант Целл 18: 1038–1051

Бен Рејеб, К, Лефебвре-Де Вос, Д, Ле Дискует, И, Лепринце, АС, Борденаве, М, Малдинеи, Р, Јдеи, А, Абделли, Ц, Савоуре´, А (2015) Водоник пероксид произведен од НАДПХ оксидаза повећава акумулацију пролина током стреса соли или манитола код Арабидопсис тхалиана. Нови фитол 208: 1138–1148

Букау, Б, Веиссман, Ј, Хорвицх, А (2006) Молекуларни пратиоци и контрола квалитета протеина. Ћелија 125: 443–451

Цаплан, Ј, Падманабхан, М, Динесх-Кумар, СП (2008) Биљни НБ-ЛРР имуни рецептори: од препознавања до репрограмирања транскрипције. Целл Хост Мицробе 3: 126–135 10.1016/ј.цхом.2008.02.010

Доддс, ПН, Ратхјен, ЈП (2010) Биљни имунитет: ка интегрисаном погледу на интеракције између биљака и патогена. Нат Рев Генет 11: 539–548

Доу, Д, Зхоу, ЈМ (2012) Ефектори фитопатогена који подривају имунитет домаћина: различити непријатељи, слично бојно поље. Целл Хост Мицробе 12: 484–495

Ду, И, Зхао, Ј, Цхен, Т, Лиу, К, Зханг, Х, Ванг, И, Хонг, И, Ксиао, Ф, Зханг, Л, Схен, К (2013) Протеини НбМИП1 типа И Ј-домена су потребно и за инфекцију вирусом мозаика дувана и за урођени имунитет биљака. ПЛоС Патог 9: е1003659

Фан, Х, Ху, И, Тудор, М, Ма, Х (1997) Специфичне интеракције између К домена АГ и АГЛ, чланова породице МАДС домена ДНК везујућих протеина. Плант Ј 12: 999–1010

Феис, БЈ, Моисан, Љ, Невман, МА, Паркер, ЈЕ (2001) Директна интеракција између сигналних протеина отпорности на болест Арабидопсис, ЕДС1 и ПАД4. ЕМБО Ј 20: 5400–5411

Гарцı´а, АВ, Бланвиллаин-Бауфуме´, С, Хуиберс, РП, Виермер, М, Ли, Г, Гоббато, Е, Риетз, С, Паркер, ЈЕ (2010) Уравнотежене нуклеарне и цитоплазматске активности ЕДС1 су потребне за комплетан урођени имуни одговор биљке. ПЛоС Патог 6: е1000970

Гассманн, В, Хинсцх, МЕ, Стаскавицз, БЈ (1999) Арабидопсис РПС4 ген отпорности на бактерије је члан ТИР-НБС-ЛРР породице гена отпорности на болести. Плант Ј 20: 265–277

Глоггнитзер, Ј, Акимцхева, С, Сринивасан, А, Кусенда, Б, Риехс, Н, Стампфл, Х, Баутор, Ј, Декроут, Б, Јонак, Ц, Јиме´нез-Го´мез, ЈМ (2014) Нонсенсе- посредовано распадање мРНА модулира нивое имуних рецептора да би регулисало антибактеријску одбрану биљака. Целл Хост Мицробе 16: 376–390

Хам, БК, Парк, ЈМ, Лее, СБ, Ким, МЈ, Лее, ИЈ, Ким, КЈ, Квон, ЦС, Паек, КХ (2006) Дуван Тсип1, ДнаЈ-тип Зн протеина, регрутује се и потенцира Тси{8}}посредована активација транскрипције. Плант Целл 18: 2005–2020

Хеидрицх, К, Бланвиллаин-Бауфуме´, С, Паркер, ЈЕ (2012) Молекуларна и просторна ограничења на сигнализацију НБ-ЛРР рецептора. Цурр Опин Плант Биол 15: 385–391

Хеидрицх, К, Виртхмуеллер, Л, Тассет, Ц, Поузет, Ц, Десландес, Л, Паркер, ЈЕ (2011) Арабидопсис ЕДС1 повезује препознавање ефектора патогена са имуним одговорима специфичним за ћелијски одељак. Наука 334: 1401–1404

Ху, И, Зхоу, Л, Хуанг, М, Хе, Кс, Ианг, И, Лиу, Кс, Ли, И, Хоу, Кс (2018) Гиберелини играју суштинску улогу у касној ембриогенези Арабидопсис. Нат Плантс 4: 289–298

Хуанг, М, Ху, И, Лиу, Кс, Ли, И, Хоу, Кс. (2015) Арабидопсис ЛЕАФИ ЦОТИЛЕДОН1 посредује у постембрионалном развоју кроз интеракцију са ФИТОХРОМ-ИНТЕРАКЦИЈСКИМ ФАКТОРОМ4. Плант Целл 27: 3099–3111

Јеленска, Ј, Иао, Н, Винатзер, БА, Вригхт, ЦМ, Бродски, ЈЛ, Греенберг, ЈТ (2007) Ефектор вируленције АЈ домена Псеудомонас сирингае ремоделира хлоропласте домаћина и потискује одбрану. Цурр Биол 17: 499–508

Јонес, Ј, Дангл, Ј (2006) Имуни систем биљака. Природа 444: 323–329

Кхан, М, Субраманиам, Р, Десвеаук, Д (2016) О чуварима, мамацима, мамацима и замкама: перцепција патогена у биљкама помоћу ефекторских сензора типа ИИИ. Цурр Опин Мицробиол 29: 49–55

Кинкема, М, Фан, В, Донг, Кс (2000) Нуклеарна локализација НПР1 је потребна за активацију експресије ПР гена. Плант Целл 12: 2339–2350

Коцх, Е, Слусаренко, А (1990) Арабидопсис је подложан инфекцији гљивицом пероноспоре. Плант Целл 2: 437–445

Лам, Е, Като, Н, Лавтон, М (2001) Програмирана ћелијска смрт, митохондрије и преосетљиви одговор биљака. Натуре 411: 848–853

Лее, ДВ, Ким, ЈК, Лее, С, Цхои, С, Ким, С, Хванг, И (2008) Пластидни транзитни пептиди нуклеарно кодирани Арабидопсис садрже вишеструке подгрупе секвенци са карактеристичним мотивима секвенци циљаних на хлоропласт. Плант Целл 20: 1603–1622