Дизајн, синтеза и антимеланогени ефекти деривата (2-супституисаног фенил-1,3-дитиолан-4-ил)метанола
Mar 22, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
До Хиун Ким1Су Јеонг Ким1Султан Уллах1Хви Иоунг Иун1Пусоон Цхун2Хиунг Рионг Моон1
Апстрактан:Аутори су дизајнирали и синтетизовали 17 (2-супституисани фенил-1,3-дитиолан-4-}ил) деривата метанола (ПДТМ) како би пронашли нову хемијску скелу, показујући одличнетирозиназа-инхибиторактивност. Њихове активности инхибиције тирозиназе су процењене у односу на тирозиназу печурака на 50 μМ, а утврђено је да пет деривата ПДТМ (ПДТМ3, ПДТМ7–ПДТМ9 и ПДТМ13) инхибирају гљиве.тирозиназевише од којичне киселине или арбутина, позитивне контроле. Од седамнаест ПДТМ, ПДТМ3 (полу-максимална инхибиторна концентрација 13,94±1,76 μМ), са 2,4-дихидроксифенил остатком, показао је највеће инхибиторне ефекте (полу-максимална инхибиторна концентрација коичне киселине 18.86± 2,14 μМ). Занимљиво је да су једињења ПДТМ без хидроксилне групе, ПДТМ7–ПДТМ9, такође имала јаче инхибиторне активности од којичне киселине. Ин силицо студије интеракција између тирозиназе и пет ПДТМ сугеришу да су њихови афинитети везивања уско повезани са њиховим активностима инхибиције тирозиназе. Експерименти засновани на ћелијама изведени коришћењем ћелија меланома коже миша Б16Ф10 показали су да ПДТМ3 ефикасно инхибирамеланогенезаи ћелијскитирозиназеактивност. Студија одрживости ћелија спроведена коришћењем ћелија Б16Ф10 показала је да се антимеланогени ефекат ПДТМ3 не може приписати његовој цитотоксичности. Кинетичке студије су показале да ПДТМ3 компетитивно инхибира тирозиназу, што указује на везивање за место активног са тирозиназом. Открили смо да би ПДТМ3 са новим хемијским оквиром могао да буде обећавајући кандидат за агенсе за избељивање коже и да би 1,3-дитиолански прстен могао да се користи као хемијски оквир за снажну инхибицију тирозиназе.Кључне речи:инхибитор тирозиназе, меланогенеза, 1,3-дитиолан, ПДТМ
Цистанцхе је инхибитор тирозиназе.
Увод
Последњих неколико деценија,инхибитори тирозиназесу биле од великог интересовања, због кључне улоге коју игра тирозиназа умеланогенеза. Меланин се производи комбинацијом ензимски катализованих и хемијских реакција. Биосинтетички пут одговоран за производњу меланина првобитно су разјаснили Рапер1 и Масон2, а недавно су га модификовали Цооксеи ет ал3 и Сцхаллреутер ет ал.4 Меланогенезу покреће ензим тирозиназа, који катализује прва два оксидативна корака у меланину: пут биосинтезе меланина. од л-тирозина у л-допу, а затим од л-допе у л-допахинон (слика 1). Ова два корака су такође кораци који одређују брзину у биосинтези меланина јер физиолошки пХ може спонтано да настави са следећим корацима.5 Допахинон произведен у другом кораку се претвара у цистенилдопу помоћу глутатиона или цистеина, и коначно у феомеланин, који је одговоран за жуту до црвене боје коже сисара, или до допахрома аутооксидацијом и коначно еумеланина, који је одговоран за смеђе/црне боје коже сисара (слика 1). Меланин штити људску кожу од штетног ултраљубичастог зрачења и такође одређује фенотипски изглед. С друге стране, прекомерна акумулација меланина у кожи може изазвати болести повезане са хиперпигментацијом и козметичке проблеме, као што су пеге, мелазма и сенилни лентигин.
тирозиназаје широко распрострањен у бактеријама, гљивама, инсектима, биљкама и животињама, укључујући људе, и одговоран је за боје људске коже и косе и непожељно смеђе боје воћа и поврћа.6 Нежељено ензимско смеђе боје и болести повезане са хиперпигментацијом на кожи охрабрили су научнике да траже нове моћне инхибиторе тирозиназе за употребу као агенси за избељивање коже и против смеђе боје. Многиинхибитори тирозиназеоткривени су до данас,7–9, али релативно мали број је одобрен као материјал за избељивање коже, због забринутости за безбедност или слабих ефеката избељивања.
У нашим претходним студијама, на основу структура л-тирозина и л-допе, природних супстрата тирозиназе, дизајнирали смо два потенцијална инхибитора тирозиназе са тиазолидинским прстеном (МХИ384 и МХИ794; слика 1) и синтетизовали их кондензацијом одговарајућег бензалдехид и л-цистеин или цистеамин хидрохлорид. Ова два једињења су идентификована као моћна конкурентнаинхибитори тирозиназеи да ефикасно смањи меланогенезу код ХРМ2 мишева без длаке.10,11 Поред директног инхибирања активности тирозиназе, МХИ384 је инхибирао експресију тирозиназе супресијом цикличког аденозин монофосфата–ПКА10 и НО-индукованог цикличког гванозин-монофосфата143 и такође супресованог МПК143 и монофосфата1Хосфа29,тирозиназеекспресија индукована посредовањем НОмеланогенезасигнализација.11 Ови позитивни резултати и чињеница да је двовалентни –С– класичан изостер двовалентног –НХ– подстакли су нас да синтетишемо деривате са дитиоланским прстеном као сурогатом тиазолидинског прстена који уобичајено постоји у МХИ384 и МХИ794, како бисмо пронашли нове инхибитори тирозиназе.
У овој студији, као део наших сталних напора да пронађемо нову и јаку хемијску скелу за инхибицију тирозиназе и развијемо новеинхибитори тирозиназе, синтетизовали смо класу структурно нових деривата (2-супституисани фенил-1,3-дитиолан-4-ил)метанол (ПДТМ) (Слика 1) и истражили њихове антимеланогене ефекте коришћењем тирозиназа печурака и тестови засновани на ћелијама. У овој студији, којична киселина и арбутин су коришћени као позитивна контрола за активност инхибиције тирозиназе, јер је којична киселина једна од најчешће коришћених позитивних контрола за процену инхибиције тирозиназе, а арбутин се клинички користи као средство за избељивање.
материјали и методе
Материјали
Осим ако није другачије назначено, сви комерцијално доступни реагенси – л-тирозин (шифра Т3754), л-допа (шифра ПХР1271), којична киселина (шифра К3125), МТТ (3-(4,5-диметил{{ 8}}тиазолил)-2,5-дифенил-2Х-тетразолијум бромид) (шифра М2128), ПМСФ (фенилметилсулфонил флуорид) (шифра П7626), Тритон Кс-100 ( 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиетилен гликол) (шифра Т8787), калијум хидроген фосфат (шифра П9666), калијум дихидроген фосфат (шифра ПХР1330), 2,3- димеркапто{26}}пропанол (шифра 64046), 1,4-диоксан (шифра 296309), сумпорна киселина (шифра 339741) и бензалдехиди – купљени су од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). Фетални говеђи серум, Дулбеццо-ов модификовани орлов медијум, физиолошки раствор пуферован фосфатом (ПБС), пеницилин, стрептомицин и трипсин су набављени од Тхермо Фисхер Сциентифиц-а (Валтхам, МА, САД). Мусхроомтирозиназе(шифра Т3824) и хормон који стимулише меланоците (-МСХ; код М4135) такође су купљени од Сигма-Алдрицх. Спектри нуклеарне магнетне резонанце (НМР) 1Х и 13Ц снимљени су на инструментима Вариан Унити Инова 400 и Вариан Унити АС 500 (Агилент Тецхнологиес, Санта Цлара, Калифорнија, САД). Масена спектрометрија ниске резолуције (МС) и МС високе резолуције добијени су на Екпрессион ЦМС (Адвион, Итхаца, НИ, САД) и 6530 Аццурате Масс квадруполном масеном спектрометру са течном хроматографијом (Агилент), респективно. . Синтеза ПДТМ1–ПДТМ17 је обављена у нашој лабораторији.
екстракт цистанцхе
Општи поступак за синтезу ПДТМ1–ПДТМ17
У мешани раствор 2,3-димеркапто-1-пропанол (100 мг, 0,80 ммол) у 14-диоксану (1 мЛ) су додани је затим додао раствор сумпорне киселине (0,1 еквивалент) у 1,4-диоксану (1 мЛ) и одговарајући бензалдехид (1,1 еквивалент). После мешања на собној температури током 10 минута, реакциона смеша је мешана на 70 степени 40 минута до 1 сат. Смеша је затим подељена између етил ацетата и воде, а органски слој је осушен преко анхидрованог МгС04, филтриран и упарен. Добијени остатак је пречишћен коришћењем хроматографије на колони силика гела да би се добили чисти ПДТМ производи: ПДТМ1–ПДТМ17.14 Карактеризација структуре (1Х и 13Ц НМР и подаци о маси свих ПДТМ и 1-Д и 2-Д НМР спектри неких ПДТМ) синтетизованих једињења дати су у Додатним материјалима.
Инхибиција гљиватирозиназеод ПДТМ1–ПДТМ17
Инхибиторни ефекти ПДТМ аналога на тирозиназу печурака су истражени уз мање модификације, као што је претходно описано у нашем раду.15 Свако једињење (10 μЛ, коначна концентрација 50 μМ) је помешано са раствором супстрата (170 μЛ), припремљеним од 14,7 мМ калијум фосфата. пуфера (пХ 6,5) и 293 µМ раствора л-тирозина (1:1, в/в), у сваком бунарчићу 96- плоче са бунарима. У сваки бунар додат је раствор тирозиназе печурака (20 μЛ, 1,000 У/мЛ) и инкубиран 30 минута на 37 степени. Садржај допахрома формираног у бунарчићима одређен је мерењем оптичке густине на 475 нм коришћењем ВерсаМак читача микроплоча (Молецулар Девицес, Суннивале, ЦА, УСА). Којић киселина и арбутин су коришћени као позитивне контроле. Сви експерименти су изведени у три примерка. Стопе инхибицијетирозиназеизрачунате су овако:
Инхибиција ( проценат )=× 100 [ ( 1 − АБ/ )] (1)
где А означава оптичку густину тест једињења, а Б представља оптичку густину контроле.
Полумаксимална инхибиторна концентрација (ИЦ50) је концентрација једињења која инхибира стандардни одговор од 50 процената. ИЦ50 се изводи из к-осе на кривој концентрације инхибитора у односу на стварање производа и одређује се из поравнања криве доза-одговор на зависној и-оси. У овој студији, експерименти инхибиције зависни од дозе су изведени у три примерка да би се одредио ИЦ50 једињења. Према проценту инхибиције пет доза (коначне концентрације 10, 20, 30, 40 и 50 µМ) у сваком експерименту, одређене су лог-линеарне криве и њихове једначине. Појединачне вредности ИЦ50 су затим израчунате као концентрација када је и-оса била једнака 50 процената инхибиције. Приказани су резултати из три експеримента.
Анализа природе инхибиције тирозиназе печурака
Да би се разјаснила природа инхибиторног ефекта ПДТМ3 на тирозиназу печурака, спроведене су кинетичке студије. ПДТМ3 (10 μЛ [0, 5, 10 или 25 μМ коначна концентрација]) је додат у 170 µЛ раствора л-тирозина (0,5, 1, 2 или 4 мМ коначна концентрација) и затим помешан са печуркаматирозиназераствор (20 μЛ, 1,000 У/мЛ) у сваком бунарчићу 96-плоче. Након што је смеша инкубирана 30 минута на 37 степени, садржај допахрома произведеног у бунарчићима је одређен мерењем оптичке густине на 475 нм помоћу читача микроплоче. Сви експерименти су изведени у три примерка. За одређивање природе инхибиције коришћена је Линевеавер-Бурк дијаграм.
екстракт цистанцхе корист
Симулација спајања ПДТМ3 или којичне киселине са тирозиназом
Ин силицо симулација спајања протеин-лиганда је изведена са АутоДоцк Вина користећи технику систематске претраге и 3-Д структуру Агарицус биспорустирозиназе(Протеин Дата Банк ИД 2И9Кс).16,17 У кристалној структури тирозиназе, место везивања л-тирозина је коришћено као џеп за спајање. Резултати симулације су добијени спајањем између тирозиназе и синтетичких једињења (ПДТМ3, ПДТМ7, ПДТМ8, ПДТМ9 и ПДТМ13) или којичне киселине. Пре извођења симулације спајања са једињењима, 2-Д структуре једињења су трансформисане у 3-Д структуре, одређивани су набоји једињења, а атоми водоника су убачени помоћу ЦхемОффице-а. ЛигандСцоут 3.1.2 је коришћен за предвиђање могућих интеракција између лиганада и тирозиназе и идентификацију фармакофора. Слике симулације пристајања 17 ПДТМ-а дате су у додатним материјалима.
Одређивање нивоа меланогенезе у ћелијама Б16Ф10
Тестови садржаја меланина са мањим модификацијама коришћени су у Б16Ф10 ћелијама за инхибиторне ефекте ПДТМ3 намеланогенеза.19 Ћелије засејане при густини од 5×104 ћелије/бунарићу у 24-плочи са бунарима остављене су да приањају на 37 степени у влажној атмосфери која садржи 5 процената ЦО2 преко ноћи. Следећег дана, ћелије су изложене -МСХ (1 µМ) и ПДТМ3 (0, 5, 10 или 25 µМ) или којичној киселини (25 µМ), а плоча је инкубирана 24 сата под истим условима. Након што су два пута испране са ПБС, ћелије су одвојене инкубацијом на 60 степени у 200 μЛ 1 Н НаОХ током 1 сата. Лизати су премештени у плочу са 96-бунарићем, а оптичка густина је измерена на 405 нм помоћу читача за ензимски имуносорбентни тест за израчунавање средњег процента инхибиције којичне киселине и ПДТМ3. Сви експерименти су изведени у три примерка.
Тест активности тирозиназе у ћелијама Б16Ф10
Проценом брзине оксидације л-допе,тирозиназеактивности су процењене са мањим модификацијама, као што је описано у претходном раду.20 Ћелије засејане при густини од 5×104 ћелије/бунарићу у 24-плочи са бунарчићима је дозвољено да држати на 37 степени у влажној атмосфери која садржи 5 процената ЦО2 током 24 сата. Ћелије су изложене -МСХ (1 µМ) и ПДТМ3 (0, 5, 10 или 25 µМ) или којичној киселини (25 µМ), а плоча је инкубирана под истим условима 24 сата. Након што су два пута испране ПБС-ом, ћелије су лизиране са 100 μЛ пуфера за лизу који садржи 0,1 мМ ПМСФ (5 μЛ), 50 мМ ПБС (90 μЛ, пХ 6,8) и 1 проценат Тритон Кс-100 (5 μЛ) и замрзнути на -80 степени 30 минута. Лизати су одмрзнути и центрифугирани на 12,000 г 30 минута на 4 степена, а супернатанти (80 μЛ) су комбиновани са 10 мМ л-допа (20 μЛ) у 96-плочи са бунарчићима, која је затим била инкубирано 30 минута на 37 степени. Оптичке густине су израчунате на 500 нм, а инхибиторне активности тирозиназе су одређене на следећи начин:
Инхибиција ( проценат )=× 100 ([А−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)
где су Б и А оптичке густине слепог узорка пре и после инкубације, респективно, а Д и Ц су оптичке густине тест једињења пре и после инкубације, респективно.
Статистичка анализа
Једносмерна анализа варијансе праћена Дунеттовим тестом коришћена је да би се утврдило да ли се просечне вредности групе значајно разликују од оних контролних. Велчов неупарени т-тест је коришћен да се утврди да ли су ефекти ПДТМ3 и којичне киселине значајно различити. Статистичка анализа је извршена коришћењем ГрапхПад-а (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, ЦА, УСА). Сви резултати су приказани као средња вредност ± стандардна грешка три независна експеримента. Двостране П-вредности од, 0.05 сматрају се статистички значајним.
Резултати и дискусија
Припрема ПДТМ1–ПДТМ17ПДТМ1–ПДТМ17 је синтетизована као што је приказано на шеми 1. Загревање 2,3-димеркапто-1-пропанол и бројни прикладно супституисани бензалдехиди (1–17) у 14-диоксану у присуство сумпорне киселине је дало жељене ПДТМ производе као чврсте материје или лепљиво уље. Структуре финалних производа потврђене су 1Х и 13Ц НМР, корелационом спектроскопијом, хетеронуклеарном једноквантном корелационом спектроскопијом, хетеронуклеарном корелационом спектроскопијом вишеструких веза и МС ниске и високе резолуције. Присуство синглета који одговара –СЦХ(Пх)С– протону на δ=6.09–5,56 ппм у 1Х НМР спектрима потврдило је формирање дитиоланског прстена између бензалдехида и 2,3-меркапта -1-пропанол. У 1Х НМР спектроскопским подацима ПДТМ, 2-Х пик је изгледао више у доњем пољу од пикова протона везаних за сп3 атоме угљеника, а 4-Х егзометилен и 5-Х2 пикови су примећени више упфиелд у именованом редоследу. У 13Ц НМР спектроскопским подацима, осим пикова из фенилног прстена, пик угљеника егзометилена (~64 ппм) је био најниже поље, праћен редом 4-Ц (~58 ппм), 2-Ц (~55,3 ппм) и 5-Ц (~41 ппм). Четири производа – ПДТМ6, ПДТМ12, ПДТМ13 и ПДТМ15 – су добијени сваки као један рацемат, док су остали добијени као мешавина два рацемата ([2Р,4Р]/[2С,4С] и [2Р,4С]/ [2С,4Р], 1:1–1:1,5), чији су односи израчунати коришћењем 1Х НМР спектроскопских података. Феномен у формирању производа не може се једноставно објаснити стеричким, електронским и/или стереоелектронским ефектима. Тхеинхибиција тирозиназетест је изведен без одвајања рацемата.
Инхибицијски ефекти ПДТМ1-ПДТМ17 на тирозиназу печурака
Потенцијали 17 синтетизованих производа, ПДТМ1–ПДТМ17, да инхибирају активност тирозиназе печурака су испитани коришћењем којичне киселине22 и арбутина23 као позитивних контрола. Инхибиције су одређене коришћењем 293 µМ л-тирозина као супстрата и синтетичких једињења у концентрацији од 50 µМ.тирозиназаинхибиције којичном киселином и арбутином су одређене на 50 и 500 µМ, респективно.
Три једињења – ПДТМ11 (3,4,5-триметоксифенил), ПДТМ15 (4-хидрокси-3-метилфенил) и ПДТМ17 (3,5-ди-т-бутил{{ 12}}хидроксиметил) – инхибирао је тирозиназу у истој мери као коична киселина и инхибирао је више од арбутина (Табела 1). Пет деривата ПДТМ – ПДТМ3 (2,4-дихидроксифенил), ПДТМ7 (4-метоксифенил), ПДТМ8 (3,4-диметоксифенил), ПДТМ9 (2,4-диметоксифенил), и ПДТМ13 (3-бромо-4-хидроксифенил) – јаче инхибирају тирозиназу од којичне киселине. Испитиване су ИЦ50 вредности ових једињења: 13,94±1,76 µМ (ПДТМ3), 16,47±2,36 µМ (ПДТМ7), 16,97±2,99 µМ (ПДТМ8), 27,85±1,47 µМ (ПДТМ3.1µПД.1µПД). Ниске вредности ИЦ50 ПДТМ3, ПДТМ7, ПДТМ8 и ПДТМ13 указују на то да је потенција била јача од оне код којичне киселине (18.86±2,14 µМ) и арбутина (381,26±3,22 µМ), који су коришћени као позитивне контроле . Занимљиво је да се овај резултат поклапа са нашим претходним налазом да многи аналози са 2,4-дихидроксифенил остатком имају вишетирозиназа-инхибиторактивност од којичне киселине.10,13,24–32
Преостали деривати ПДТМ нису имали никакав (ПДТМ1 и ПДТМ2) или низак инхибиторни ефекат (ПДТМ4, ПДТМ5, ПДТМ6, ПДТМ10, ПДТМ12, ПДТМ14 и ПДТМ16) у поређењу са којичном киселином. Према нашим акумулираним подацима о односу структуре и активности, аналози са најмање једном хидроксилном групом били су способнији да инхибирају тирозиназу. Помало изненађујуће, четири деривата ПДТМ без хидроксилне групе су инхибирала активност тирозиназе једнако или ефикасније од којичне киселине. То су били ПДТМ7 (4-метоксифенил), ПДТМ8 (3,4-диметоксифенил), ПДТМ9 (2,4-диметоксифенил) и ПДТМ11 (3,4,5-триметоксифенил) . Једињења (ПДТМ1-2, ПДТМ4-5 и ПДТМ12) са само 4-хидроксил групом на фенил прстену или алкокси или хидроксил групом на позицији 3 са 4-хидроксил група је имала ниску или никакву активност, док су једињења (ПДТМ13–ПДТМ17) са алкил или бромо групом на позицији 3 са 4-хидроксил групом показала умерено-високу активност инхибиције тирозиназе. Ови резултати односа структура-активност подржавају хипотезу да јеинхибитори тирозиназена активност једињења са 4-хидроксилном групом у великој мери утиче тип 3-супституента.
цистанцхекорист: против старења
Начин инхибиције тирозиназе печурака помоћу ПДТМ3
Пошто је ПДТМ3 инхибирао печуркетирозиназевећина, Линевеавер-Бурк дијаграм је коришћен за одређивање природе његовог инхибиторног ефекта. Као што је приказано на слици 2, добијена је двострука реципрочна дијаграма, а све праве са различитим нагибима пресецале су и-осу у истој тачки. Стога су вредности Км (Мицхаелисова константа) постепено расле са концентрацијом ПДТМ3. Детаљне вредности кинетичких параметара су приказане у табели 2. С друге стране, концентрација ПДТМ3 није утицала на максималну брзину реакције (Вмак). Ови налази показују да је ПДТМ3 дозно-зависна и компетитивно инхибирана тирозиназа.
Ин силицо доцкинг симулације повезивања тирозиназе са ПДТМ3, ПДТМ7–ПДТМ9, ПДТМ13 и којичном киселином
АутоДоцк Вина је коришћен да би се утврдило да ли синтетисани ПДТМ аналози директно инхибирају тирозиназу кроз везивање за њено активно место. Којична киселина и пет аналога ПДТМ (ПДТМ3, ПДТМ7–ПДТМ9 и ПДТМ13), за које је утврђено да имају моћне печуркетирозиназа-инхибиторактивности, коришћени су као лиганди за симулацију пристајања. Сваки од ових аналога ПДТМ може имати четири стереоизомера, а енергије везивања стереоизомера су приказане на слици 3А. Утврђено је да свих пет аналога ПДТМ имају сличан или већи афинитет за активно место тирозиназе у поређењу са којичном киселином (-5.4 кцал/мол), а ПДТМ3 је показао највећи афинитет. Овај резултат је показао да се снажни инхибиторни ефекти ових пет деривата ПДТМ могу приписати њиховом афинитету везивања са тирозиназом, и показао је блиску везу између афинитета везивања, како је утврђено симулацијом пристајања, и инхибиције тирозиназе.
ЛигандСцоут 3.1.2 је коришћен за идентификацијутирозиназеаминокиселински остаци који ступају у интеракцију са ПДТМ аналозима. Као што је приказано на сликама 3Б и Ц, 4- хидроксилна група на фенил прстену ПДТМ3 је интераговала са Хис85 тирозиназе кроз водоничну везу, а фенилни прстен је интераговао са Вал283 и Ала286 кроз хидрофобне интеракције и са Хис263 преко π–π интеракција слагања. Водоничка веза између алкохолне хидроксилне групе и аминокиселинских остатака тирозиназе откривена је само за ПДТМ7 и ПДТМ8. Међутим, алкохолна хидроксилна група оба ПДТМ аналога је интераговала са различитим аминокиселинским остацима, на пример, ПДТМ7 је интераговао са Хис244 и Асн260, док је ПДТМ8 интераговао са Гли281. Штавише, Вал283 тирозиназе је био укључен у хидрофобне интеракције са свих пет аналога.
Тестови садржаја меланина
Ћелије Б16Ф10 су коришћене за процену активности депигментације ПДТМ аналога. ПДТМ3 је изабран за експерименте засноване на ћелијама, због своје моћне печуркетирозиназа-инхибиторефекат и недостатак токсичности за ћелије Б16Ф10. ПДТМ3 је процењен због његовог инхибиторног ефекта против -МСХ-стимулисаногмеланогенезау Б16Ф10 ћелијама одређивањем нивоа меланина у ћелијама. Нивои меланина су значајно смањени након што су ћелије третиране са ПДТМ3 и -МСХ у поређењу са ћелијама третираним само са -МСХ. У опсегу концентрација 0–25 μМ, ПДТМ3 је показао значајан антимеланоген ефекат зависан од дозе. Штавише, при концентрацији од само 10 μМ, ПДТМ3 је показао већу инхибиторну моћ од којичне киселине на 25 μМ, као што је приказано на Слици 5. Ови резултати указују да антимеланогени ефекат ПДТМ3 у Б16Ф10 ћелијама није повезан са цитотоксичношћу.
Тест активности тирозиназе у ћелијама Б16Ф10
Инхибицијски ефекат ПДТМ3 на активност ћелијске тирозиназе је испитиван у Б16Ф10 ћелијама престимулисаним са -МСХ. ПДТМ3 дозно-зависно инхибиранотирозиназеактивност у опсегу концентрације 0–25 μМ (слика 6). Штавише, ови резултати су се добро поклапали са резултатима садржаја меланина, што сугерише да се антимеланогени ефекат ПДТМ3 може приписати инхибицији тирозиназе.
Закључак
У овом раду синтетизовани су различити ПДТМ аналози и процењени њихови ефекти намеланогенезаи активност тирозиназе у Б16Ф10 ћелијама. Осам аналога је показало исто толико или већу инхибицију против тирозиназе печурака од којичне киселине, а ПДТМ3 је имао највећу инхибиторну активност. У ћелијама Б16Ф10, ПДТМ3 је значајно инхибирао биосинтезу меланина на начин зависан од дозе итирозиназеактивност у опсегу концентрација 0–25 μМ без цитотоксичног ефекта. У концентрацији од 10 μМ, ПДТМ3 је значајно више смањио биосинтезу меланина и активност тирозиназе од којичне киселине на 25 μМ. С обзиром на наше запажање да су многи ПДТМ аналози показали снажне активности инхибиције тирозиназе, предлажемо да се 1,3-дитиолан сматра одговарајућом скелом затирозиназа-инхибиторактивност. Сада тражимо услове раздвајања сваке ПДТМ мешавине два рацемата, а услови раздвајања и антимеланогени ефекат сваког појединачног рацемата биће благовремено пријављени.
