Екстракција фенилетаноидних гликозида из Цистанцхе Тубулоса екстракцијом хомогенизације великом брзином смицањем

Позадина:

Цистанцхе тубулоса је позната традиционална кинеска медицина која потиче из Синђијанга. Широко је распрострањена у северној Африци, Индији, итд. Циљ: Главна биоактивна компонента Ц. тубулоса јефенилетаноидни гликозиди (ПхГс). Ехинакозид и актеозид су индикативне компоненте за одређивање ПхГ и углавном се користе за заштиту јетре, имунолошку заштиту итд. Због тога је веома важно екстраховати ПхГ из Ц. тубулоса. Методе: У овој студији упоређене су методе екстракције уз помоћ ултразвука (УАЕ), екстракције уз помоћ микроталасне пећнице (МАЕ) и екстракције смичном хомогенизацијом великом брзином (ХСХЕ). Поред тога, оптимизовани су услови екстракције ХСХЕ методе. Резултати: Резултати су показали да је ХСХЕ метода била боља од метода УАЕ и МАЕ, а оптимални параметри екстракције ХСХЕ су били концентрација етанола од 50%, температура екстракције од 70 степени, брзина ротације од 16000 о/мин, екстракција време од 2 мин, однос чврсте материје и течности 1:9 и један циклус екстракције. Приноси одехинакозид и актеозидизносиле су 1.366 и 0.519%, респективно, а стопе трансфера ехинакозида и актеозида достигле су 87 и 94%, респективно. Закључци: Може се закључити да је ХСХЕ метода једноставна, брза и ефикасна техника екстракције ПхГ из Ц. тубулоса. Издвајамо: Ефикасна и еколошки прихватљива ХСХЕ метода је испитана за екстракцију ПхГ из Ц. тубулоса. Добијени су оптимални услови ХСХЕ методе за екстракцију ПхГс из Ц. тубулоса. Ово истраживање пружа нову методу за индустријску екстракцију ПхГс из Ц. тубулоса.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Cистанцхе тубулосаје уобичајена традиционална кинеска медицина која потиче из Синђианга. Широко је распрострањен у северној Африци,Арапског полуострва, Пакистана и Индије и званично је забележен у кинеској фармакопеји 2010. Главна биоактивна компонента Ц. тубулосаје фенилетаноидни гликозиди (ПхГ), класа природних производа растворљивих у води укључујућиехинакозид, актеозид, изоактеозиди 2-ацетилактеозид (1, 2). Структура ПхГс састоји се од циметне киселине и хидроксифенилетил група, од којих су оба везана за -глукопираноза кроз естари гликозидне везе, респективно (3). Фармаколошке студије су показале да ПхГс офЦ. тубулосаимају многе лековите функције, као што су антизамор (4), неуропротективни (5–7), заштитни ефекти јетре (8–10) и имунопротективни ефекти (11). Стога је ефикасна екстракција ПхГ изЦ. тубулосаје од великог значаја за развој и коришћење природних производа.

Тренутне традиционалне методе екстракције ПхГ су екстракција врућим рефлуксом, екстракција уз помоћ ултразвука (УАЕ) и екстракција уз помоћ микроталасне пећнице (МАЕ; 12–16). Ове методе имају различите недостатке, као што су ниска ефикасност, дуго време екстракције и високи трошкови. У поређењу са традиционалним методама, метода екстракције хомогенизације великом брзином смицањем (ХСХЕ) је нова, нова метода екстракције и има предности бржег времена екстракције, мањег отпада растварача, већег приноса, једноставнијих уређаја и лакшег рада (17). Принцип рада ХСХЕ методе заснива се на ротирајућем унутрашњем резачу које покреће мотор велике брзине. Унутрашњи и спољашњи секачи производе снажну силу смицања да би пореметили и мешали узорке. У међувремену, резач са великом брзином ротације изазива разлике у притиску између унутрашњих и спољашњих шупљина резача, што резултира преносом масе између узорака и растварача. Комбинацијом велике силе смицања, силе судара, притиска и других сила, може се брзо постићи растворљиви баланс између чврстих узорака и растварача (18). Дакле, процес екстракције ХСХЕ може бити завршен за неколико минута, па чак и за десетине секунди (19–22).

Недавно је ХСХЕ истражен у екстракцији биоактивних компоненти из различитих природних производа (23–25). Цхенг ет ал. користио ХСХЕ за екстракцију пет лигнана из плода Сцхисандра цхиненсис (26). Резултати су показали да су оптимални услови били концентрација етанола од 75%, време екстракције од 1 мин, однос чврсте материје и течности 1:19, напон екстракције од 180 В и честица узорка величине 120 ока. Укупан принос пет лигнана био је 13,89 ± 0,014 мг/г под оптимизованим условима. Танг ет ал. користио ХСХЕ за добијање биоактивног уља из семена периле (27). Оптимални услови су били време екстракције од 2 мин, однос чврсте материје и течности 1:10, напон екстракције од 150 В и два циклуса екстракције. Принос уља семена периле достигао је 59,3%. Горе наведени резултати показују да ХСХЕ има предности кратког времена екстракције, ниских трошкова и високих приноса. Међутим, постоји недостатак истраживања о екстракцији ПхГ од стране ХСХЕ.

У овој студији, ХСХЕ је коришћен за истраживање његове потенцијалне примене у екстракцији ПхГс из Ц. тубулоса. Принос ПхГс је одређен помоћу ХПЛЦ. Три методе екстракције, ХСХЕ, УАЕ и МАЕ, упоређене су под истим условима. Испитивани су ефекти концентрације етанола, температуре екстракције, брзине ротације, времена екстракције, односа чврстог и течног и броја циклуса екстракције приноса. Упоређују се и дискутују предности и мане овог рада и референци.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА КИНЕСКА ТРАДИЦИОНАЛНА МЕДИЦИНЕПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Материјали и методе

Материјал и хемијски реагенси

Ц. тубулоса је купљен од Ксињианг Цонгронгтанг Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд (Сињианг, Кина). Стандарди ехинакозида (чистоће веће или једнаке 98%) и актеозида (чистоће веће од или једнаке 98%) набављене су од Схангхаи Стандард Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд (Шангај, Кина). Ацетонитрил, метанол и сирћетна киселина су ХПЛЦ квалитета (Фисхер Сциентифиц, Фаир Лавн, Њ). Етанол аналитичког квалитета је купљен од Тиањин Ионгсхенг Фине Цхемицал Цо., Лтд (Тиањин, Кина). Током експеримената је коришћена дејонизована вода.

ХПЛЦ анализа

ХПЛЦ анализа је изведена на Ватерс е2695 течном хроматографу (Ватерс, Милфорд, МА) опремљеном 2489 УВ/Висибле детектором и Симметри Ц18 колоном (Ватерс), 250 × 4,6 мм, 5 μм величине честица. Концентрације ехинакозида и актеозида анализиране су ХПЛЦ методом. Мобилна фаза се састојала од (1) ацетонитрила и (2) 2% воденог раствора глацијалне сирћетне киселине. Програм градијента елуције је представљен у табели 1.

Детектована таласна дужина била је 330 нм, брзина протока је била 1 мЛ/мин, запремина убризгавања је била 10 μЛ, а температура пећнице је подешена на 30 степени. Хроматографски пик аналита је потврђен поређењем његовог времена задржавања са оним код стандарда. Квантификација је спроведена интеграцијом пика коришћењем екстерне стандардне методе.

Тест прецизности је спроведен убризгавањем истих екстракцијских узорака пет пута. За тест стабилности, исти узорци су анализирани у корацима од 0, 1, 2, 4, 12, 24 и 48 х.

Тестови опоравка ехинакозида и актеозида су спроведени додавањем стандарда у узорке за екстракцију. Забележена су сва вршна подручја и времена задржавања ехинакозида и актеозида. Резултати калибрационих кривуља за ехинакозид и актеозид су наведени у табели 2.

Обрачун приноса

Као индикативне компоненте за одређивање ПхГ коришћени су ехинакозид и актеозид. Принос ехинакозида или актеозида је израчунат коришћењем следеће једначине:

где је И=принос ехинакозида или актеозида (%); Ц=концентрације ехинакозида или актеозида (мг/мЛ); В=запремина раствора за екстракцију (мЛ); и В=тежина праха Ц. тубулоса (мг).

Методе екстракције ПхГ-а Стабљике Ц. тубулоса су прво млевене електричном млином (ЈЦ-500г; Ионгканг Каииуан Индустри & Траде Цо., Лтд, Ионгканг, Кина) и филтриране помоћу филтерског сита (приближно 380 μм ). Затим је прашак Ц. тубулоса сушен у пећници на 70 степени док тежина није била константна. Пет грама праха Ц. тубулоса је помешано са растварачем за екстракцију и стављено у боцу за екстракцију. Након тога, течна смеша је претходно загревана (30–80 степени) 5 минута у воденом купатилу са константном температуром (ДФ-101С; Јинтан Аналитицал Инструмент Цо., Лтд, Јинтан, Кина).

(а) ХСХЕ метода.-ХСХЕ је спроведен помоћу ФА25 система (ФЛУКО Цо., Лтд, Шангај, Кина), који се састојао од ротационог резача, брзог мотора и контролера. Брзина ротације унутрашњег резача је регулисана у распону од 10000–28000 о/мин, а времена извлачења у распону од 2–15 мин.

(б) УАЕ метода. - Пет грама осушеног узорка и 300 мЛ метанола су тачно измерени и додати у боцу за екстракцију. Боца за екстракцију је уроњена у ултразвучно купатило и изведена при ултразвучној снази од 300 В током 10 мин. Температура екстракције је подешена на 30 степени.

(ц) МАЕ метода. - Пет грама осушеног узорка и 300 мЛ метанола су тачно измерени и додати у боцу за екстракцију. Боца за екстракцију је стављена у микроталасни реактор и изведена на 180 В током 10 мин. Температура екстракције је подешена на 30 степени.

ХСХЕ метода је упоређена са УАЕ и МАЕ методама са истим растварачем за екстракцију, временом екстракције, температуром екстракције, односом чврсте материје и течности и бројем циклуса екстракције. Раствор за екстракцију је филтриран преко 0.22 μм мембране и анализиран помоћу ХПЛЦ да би се одредиле концентрације ехинакозида и актеозида. Сви процеси екстракције су поновљени три пута.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Одређивање преносних стопа

На основу стандардне методе у 2015 Кинеској фармакопеји, одређен је садржај ехинакозида и актеозида у праху Ц. тубулоса (28). Један грам праха Ц. тубулоса и 50 мЛ 50% метанола су тачно измерени и додати у смеђу волуметријску тиквицу од 50 мЛ. Течна смеша је измерена и натопљена 30 мин. Затим је смеђа волуметријска боца уроњена у ултразвучно купатило и изведена при ултразвучној снази од 250 В и фреквенцији од 35 кХз током 40 минута. Течна смеша је поново извагана и 50% метанола је додато да би се обезбедио губитак растварача. Раствор за екстракцију је филтриран преко 0,22 μм мембране и анализиран помоћу ХПЛЦ да би се одредиле концентрације ехинакозида и актеозида. Процеси екстракције су поновљени три пута.

Стопе преноса ехинакозида или актеозида су израчунате коришћењем следеће једначине:

где је Кс=брзина преноса ехинакозида или актеозида (%); М1=квалитет ехинакозида или актеозида у екстракту (мг); и М2=квалитет ехинакозида или актеозида у праху Ц. тубулоса (мг).

Резултати и дискусија

Валидација ХПЛЦ методе

ХПЛЦ профили ехинакозида и актеозида из Ц. тубулоса коришћењем ХСХЕ приказани су на слици 1. РСД површине пикова ехинакозида и актеозида износиле су 1,89 и 1,40%, респективно. Резултати су показали да ХПЛЦ метода има добру прецизност у квантитативној анализи ехинакозида и актеозида. У различитим временима (0–48 х), РСД површине пикова ехинакозида и актеозида биле су 1,71 и 1,70%, респективно, што указује да је узорак био стабилан за 48 х. Искориштавање ехинакозида и актеозида износило је 99,3 и 99,1%, респективно, а њихов РСД 0,70 и 0,67%, респективно, што је потврдило поузданост ХПЛЦ методе.

Поређење различитих метода екстракције Поређење ХСХЕ методе са МАЕ и УАЕ методама у погледу приноса ехинакозида и актеозида било је

спроведено, чији су резултати приказани на слици 2. Уочено је да су приноси ехинакозида и актеозида добијени ХСХЕ били већи од оних добијених од стране МАЕ и УАЕ. У поређењу са МАЕ, приноси ехинакозида и актеозида добијени ХСХЕ били су већи за 20,5 и 20,8%, респективно. У поређењу са УАЕ, приноси ехинакозида и актеозида добијених ХСХЕ били су већи за 6,6 и 7,4%, респективно. Ови резултати указују да ХСХЕ може значајно повећати приносе ПхГ.

Оптимизација ХСХЕ методе

Параметри екстракције ПхГ-а помоћу ХСХЕ укључују концентрацију етанола, температуру екстракције, брзину ротације, време екстракције, однос чврсте материје и течности и број циклуса екстракције (26, 29)

Ефекат концентрације етанола на екстракцију ПхГс

Концентрација етанола је важан фактор који утиче на приносе ПхГс. Као што је приказано на слици 3, испитивани су приноси ехинакозида и актеозида из Ц. тубулоса под различитим концентрацијама етанола. Открило је да се принос ехинакозида повећао са 0 на 30%, а затим опао са 30 на 90% са повећањем концентрације етанола. Принос актеозида се повећао од 0 до 70%, а затим се смањио са 70 на 90% са повећањем концентрације етанола. Када је концентрација етанола

износио је 50%, збир приноса ехинакозида и актеозида био је максимум. Различите концентрације етанола имају различите поларитете, што доводи до различите растворљивости ехинакозида и актеозида. Тако је оптимална концентрација етанола била 50%.

Утицај температуре екстракције на екстракцију ПхГс

Да би се проценио утицај температуре екстракције на принос ПхГ, проучаване су различите температуре екстракције (30–80 степени). Приноси ехинакозида и актеозида при различитим температурама приказани су на слици 4. Може се приметити да се повећањем температуре екстракције са 30 на 70 степени повећавају приноси ехинакозида и актеозида. Када је температура порасла на 80 степени, смањили су се приноси ехинакозида и актеозида. Ово се приписује вишој температури која убрзава разградњу ПхГ. Стога је оптимална температура екстракције била 70 степени.

Утицај брзине ротације на екстракцију ПхГс

Слика 5 показује утицаје различитих брзина ротације на приносе ПхГс. Приноси ехинакозида и актеозида су се повећавали са повећањем брзине ротације. Повећање брзине ротације може повећати силу смицања унутрашњег и спољашњег резача, чиме се повећава принос ПхГ-а. Оптимална брзина ротације била је 16000 о/мин.

Ефекат времена екстракције на екстракцију ПхГс

Приноси ехинакозида и актеозида под различитим временима екстракције приказани су на слици 6. Приноси ехинакозида и актеозида су били стабилни са повећањем времена екстракције. Стога се може закључити да се ПхГс могу потпуно екстраховати из Ц. тубулоса за 2 мин, а оптимално време екстракције је 2 мин.

Ефекат односа чврстог и течног на екстракцију ПхГс

Као што је приказано на слици 7, разматрани су приноси ехинакозида и актеозида у различитим односима чврста и течна материја. Приноси ехинакозида и актеозида су порасли са 1:3 на 1:9 и постали стабилни од 1:9 до 1:24. Пошто мала количина растварача за екстракцију не може у потпуности да раствори ехинакозид и актеозид, брзина преноса масе је смањена. Прекомерна екстракција растварача изазвала је непотребан отпад. Према томе, оптимални однос чврстог и течног био је 1:9.

Ефекат броја циклуса екстракције на екстракцију ПхГс

Слика 8 приказује ефекте бројних циклуса екстракције на приносе ПхГс. Приноси ехинакозида и актеозида су се повећавали са повећањем броја циклуса екстракције. Међутим, време екстракције се значајно повећава са повећањем циклуса екстракције и троши се више енергије. Оптималан број циклуса екстракције био је један.

Поређење ХСХЕ методе са другим методама екстракције за екстракцију ПхГс

Резултати ХСХЕ методе у поређењу са другим методама екстракције заекстракција ПхГ из Ц. тубулосанаведени су у табели 3. ХСХЕ је једноставнији и лакши од метода спајања као што су методе двофазне водене екстракције уз помоћ ултразвука и методе технологије ултразвучне микроталасне екстракције. Поред тога, притисак екстракције ХСХЕ је нижи од методе екстракције течности под притиском, а услови рада првог су сигурнији. Што је још важније, из табеле 3 се може видети да ХСХЕ показује најкраће време екстракције и најмању потрошњу растварача међу свим методама екстракције. Може се закључити да ХСХЕ метода има многе предности као што су висока ефикасност, благи услови рада, низак ниво потрошње, једноставна опрема и лак рад за екстракцију природних производа.

Закључци

У овој студији је истражена ефикасна и еколошки прихватљива ХСХЕ метода за екстракцију ПхГ из Ц. тубулоса. У поређењу са методама УАЕ и МАЕ, нова ХСХЕ метода даје већи принос ПхГ под истим условима. У поређењу са МАЕ методом, приноси одехинакозид и актеозидповећани су за 20.5 и 20,8%, респективно. У поређењу са УАЕ, приноси ехинакозида и актеозида повећани су за 6,6 и 7,4%, респективно. Оптимизовани су параметри екстракције ХСХЕ ПхГс из Ц. тубулоса. Под оптимизованим параметрима, приноси ехинакозида и актеозида достигли су 1,366 и 0,519%, респективно, а стопе трансфера ехинакозида и актеозида 87 и 94%, респективно. ХСХЕ метода има предности високе ефикасности, благих услова рада, ниског нивоа потрошње, једноставне опреме, лаког рада и ниских трошкова. Ово истраживање пружа нову методу за индустријску екстракцију ПхГс из Ц. тубулоса.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЦИСТАНЦХЕ ХЕРБС ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%