Инхибитор фарнезилтрансферазе ЛНК-754 ублажава аксоналну дистрофију и смањује амилоидну патологију код мишева, део 1

Апстрактан

Позадина:

Депозиција амилоидног плака и дегенерација аксона су рани догађаји у патогенези АД. А омета микротубуле у пресинаптичким дистрофичним неуритима, што доводи до акумулације поремећених ендолизозомалних и аутофагних органела које транспортују ензим који цепа протеин прекурсора амилоида (БАЦЕ1). Сходно томе, дистрофични неурити стварају А 42 и значајно доприносе таложењу плака.

Аксонална дегенерација је неуролошки поремећај који узрокује оштећење аксона неурона, чиме утиче на нервну проводљивост. Имунитет је важна линија одбране људског тела да се одупре инвазији страних клица и вируса. Дакле, постоји ли веза између аксоналне дегенерације и имунитета?

Прво, аксонална дегенерација није болест узрокована имунолошким системом, тако да нема потребе да бринете да ће имунитет негативно утицати на њу. Иако је специфичан узрок аксоналне дегенерације непознат, неке студије сугеришу да дегенерација аксона може бити повезана са инфламаторним одговорима у имунолошком систему. Инфламаторни одговор је заштитни механизам имуног система против инвазије страних патогена. Међутим, ако је прекомерно активиран, то ће изазвати запаљенско оштећење неурона и промовисати дегенерацију аксона.

Друго, јак имуни систем може побољшати отпорност организма и смањити ризик од инфекције и болести, што је посебно важно за пацијенте са аксоналном дегенерацијом. Пошто је нервни систем пацијената са аксоналном дегенерацијом оштећен, способност тела за самопоправку је релативно слаба. Ако болују од других болести, стање ће се погоршати и додатно утицати на њихов квалитет живота. Стога, одржавање здраве исхране и животних навика и јачање имунитета може помоћи у смањењу ризика од других болести. Истовремено, може побољшати имуни одговор тела и промовисати поправку аксона и обнављање нервне проводљивости.

Укратко, иако не постоји неопходна веза између аксоналне дегенерације и имунитета, здрав имуни систем може пружити неопходну заштиту и подршку пацијентима са аксоналном дегенерацијом. Због тога треба обратити пажњу на важност одржавања имуног система, почевши од аспеката као што су исхрана и животне навике, и активног побољшања нивоа имунитета организма како би се поставили чврсти темељи за здравље и дуговечност. Види се да морамо побољшати памћење, а цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење јер је цистанцхе десертицола традиционални кинески медицински материјал који има много јединствених ефеката, од којих је једно побољшање памћења. Ефикасност млевеног меса потиче од различитих активних састојака које садржи, укључујући киселину, полисахариде, флавоноиде, итд. Ови састојци могу да унапреде здравље мозга на различите начине.

Кликните на сазнајте 10 начина за побољшање меморије

Инхибитори фарнезилтрансферазе (ФТИ) су недавно истражени за репозиционирање ка лечењу неуродегенеративних поремећаја и блокирање деловања фарнезилтрансферазе (ФТасе) да катализује фарнезилацију, пост-транслациону модификацију која регулише протеине укључене у функцију лизозома и стабилност микротубула. У постмортем АД мозговима, ФТасе и њена низводна сигнализација су појачано регулисани. Међутим, утицај ФТИ на амилоидну патологију и дистрофичне неурите није познат.

Методе:

Тестирали смо ефекте ФТИР ЛНК-754 и лонафарниба у 5КСФАД мишјем моделу амилоидне патологије.

Резултати:

Код 2-месечних 5КСФАД мишева који су лечени хронично током 3 месеца, ЛНК-754 је смањио оптерећење амилоидним плаком и хиперфосфорилацију тау, и ублажио акумулацију БАЦЕ1 и ЛАМП1 у дистрофичним неуритима. Код 5-месечних 5КСФАД мишева третираних акутно током 3 недеље, ЛНК-754 је смањио величину дистрофичног неурита и акумулацију ЛисоТрацкер-Греен-а у одсуству ефеката на А депозите. Акутни третман са ЛНК-754 побољшао је памћење и дефиците учења код хАПП/ПС1 амилоидних мишева.

За разлику од ЛНК-754, третман лонафарнибом је био мање ефикасан у смањењу плакова, тау хиперфосфорилације и дистрофичних неурита, што је могло бити резултат смањене потенције против ФТасе у поређењу са ЛНК-754. Истраживали смо ефекте ФТИ на аксонску трговину ендолизозомалним органелама и открили да лонафарниб и ЛНК-754 побољшавају ретроградни аксонски транспорт у примарним неуронима, што указује на то да би ФТИ могли да подрже сазревање касних ендозома аксона у лизозоме. Штавише, ФТИ третман је повећао нивое ЛАМП1 у примарним неуронима миша и мозговима 5КСФАД мишева, показујући да ФТИ стимулишу биогенезу ендолизозомалних органела.

Закључци:

Приказујемо нове податке који сугеришу да је ЛНК-754 промовисао промет аксона и функцију ендолизозомалних одељења, за које претпостављамо да су смањили аксоналну дистрофију, смањену акумулацију БАЦЕ1 и инхибирали таложење амилоида код 5КСФАД мишева. Наши резултати се слажу са претходним радом који идентификује ФТасе као терапеутску мету за лечење протеинопатија и може имати важне терапеутске импликације у лечењу АД.

Кључне речи:

Алцхајмерова болест, дистрофични неурити, инхибитори фарнезилтрансферазе.

Позадина

Алцхајмерова болест (АД) је прогресивна неуродегенеративна болест која је најчешћи узрок деменције у старијој популацији и коју карактерише значајно оштећење учења и памћења. На молекуларном нивоу, обележја АД мозга су накупљање амилоидних (А) плакова и присуство хиперфосфорилованих тау инклузија.

У раним, асимптоматским стадијумима АД, А се акумулира у мозгу више од две деценије или дуже пре појаве оштећења памћења [1–3]. Сходно томе, смањење нивоа А у мозгу је централни фокус стратегија лечења АД [4]. Тренутно, једина терапија која модификује болест коју је условно одобрила ФДА је анти-А антитело које чисти агрегиране облике А из мозга [5], потврђујући да је циљање А у мозгу обећавајући приступ лечењу АД.

Међутим, већина клиничких испитивања фокусираних на А није успела због забринутости за безбедност или ефикасност, а нагласак је сада стављен на циљеве засноване на различитим хипотезама АД, укључујући тау пропагацију, упалу, дисхомеостазу калцијума и неуроваскуларне факторе [4, 6, 7 ]. Поред тога, расте интересовање за терапеутски потенцијал активирања лизозомских деградативних путева као методе за смањење патогених протеина, што је карактеристика уобичајена код неуродегенеративних болести [8–12].

Екстензивна дисфункција ендолизозомалних и аутофагних путева је добро документована као рани догађај патогенезе АД. Многи генетски локуси осетљивости на АД су повезани са субћелијским ендолизозомалним транспортом и функцијом лизозома [13], а увећане дисфункционалне ендолизозомске и аутофагне органеле се акумулирају у АД мозгу унутар дистрофичних неурита [14, 15].

Чини се да дистрофични неурити настају након повреде неурона, а код АД се претпоставља да је то дестабилизација микротубула од стране А [16]. Ово доводи до фокалних аксоналних отока који ремете нормалне путеве промета и деградације кључних протеина укључених у производњу А, укључујући БАЦЕ1 [16, 17]. Као резултат тога, дистрофије стварају А 42 и значајно доприносе екстрацелуларном таложењу плака и аксоналној дистрофији [18], покрећући напредни пут који доводи до синаптичког губитка, неуродегенерације и когнитивних дефицита [16].

Терапијске стратегије које побољшавају транспорт и активност ендолизозомалних и аутофагних органела могле би да спрече неуритичку дистрофију да одрже разградњу патогених протеина и да буду критични механизам за смањење нивоа БАЦЕ1 и А у АД.

Како се потрага за ефикасним лечењем АД наставља, број пренаменских лекова у клиничким испитивањима за АД је значајно порастао јер клинички процењени лекови имају познате проблеме у погледу безбедности и ефикасности, чиме се убрзава процес развоја лекова [7, 19]. Последњих година, студије су идентификовале ФТИ као класу лекова са потенцијалом да се поново користе за лечење неуродегенеративних болести.

ФТИ инхибирају фарнезилацију, посттранслациону модификацију која регулише протеине у којима је фарнезил пирофосфат ковалентно модификован на остатке цистеина у протеинима који садрже ЦААКС мотив [20]. ФТИ су првобитно дизајнирани да блокирају онкогену Рас активност инхибирањем њене пренилације, али су прекинути у клиничким испитивањима за лечење рака након открића алтернативних путева Рас пренилације [21, 22].

Међутим, постоји много супстрата ФТасе [23–25], што доводи до процене ФТИ за широк спектар поремећаја, укључујући кардиоваскуларне болести, хепатитис Д и прогерију [20, 26]. Поред тога, ФТИ су показали обећање према неуродегенеративним болестима које карактерише акумулација протеинских агрегата. У моделима протеинопатија код глодара и култура ћелија, ФТИ индукују лизозомалну активност и протеолизу токсичних протеина специфичних за болест [8, 9, 27, 28].\

Раније смо показали да је ЛНК-754, ФТИ тестиран у испитивањима рака, побољшао промет лизозомалном хидролазом и смањио агрегате алфа-синуклеина (-синуклеина) у неуронима изведеним од Паркинсонове болести (ПД) пацијената и моделима ПД миша [8 ].

Друге студије су известиле о сличним резултатима ФТИ према смањењу протеинских агрегата; третирање модела ћелијске културе ПД са ФТИ-277 смањеним -синуклеином [28] и лонафарнибом, ФТИ-ом одобреним од стране ФДА за лечење прогерије [29], повећаном лизозомалном активношћу и смањеним тау инклузијама у мишјем моделу тауопатије [ 9]. Штавише, недавна студија је показала да је генетски нокаут неуронске ФТазе у АПП/ПС1 мишјем моделу АД спречио А генерацију [30]. Фокус претходних студија које су процењивале ФТИ за протеинопатије била је улога супстрата ФТазе у активности лизозома и аутофагији.

Међутим, познато је да ФТИ промовишу стабилност микротубула (МТ) и синергију са лековима који стабилизују МТ како би побољшали ацетилацију тубулина, путем пута независног од Рас [31–33]. МТ стабилизација инхибира АД патологију код АПП/ПС1 мишева [34], а тренутно се клинички истражује неколико агенаса за стабилизацију МТ за лечење АД [35]. Стога, значајни докази сугеришу да ФТИ могу имати користи од болести које карактеришу дисфункционални механизми хомеостазе протеина као што је АД. Ипак, циљеви и путеви који повезују фарнезилацију протеина са смањеним протеинским агрегатима код неуродегенеративних болести нису у потпуности схваћени.

У овој студији смо проценили да ли фармаколошки третман са ФТИ може побољшати АД патологију повезану са А. Процењивали смо ефекте ЛНК-754 и лонафарниба, два ФТИ за која је познато да смањују агрегате протеина код неуродегенеративних поремећаја, на оптерећење плаком и дистрофичне неурите у 5КСФАД мишјем моделу амилоидне патологије. Наши резултати пружају увид у путеве на које утиче инхибиција ФТасе и снажно подржавају даља истраживања о пренамјени ФТИ као терапеутика за АД и друге неуродегенеративне болести које карактерише накупљање протеина.

материјали и методе

Животиње и лечење лековима

Сав рад на животињама је обављен уз одобрење Институционалне комисије за негу и употребу животиња Нортхвестерн универзитета (ИАЦУЦ). Мишеви су храњени стандардном храном за глодаре и водом ад либитум и смештени су по стандардном 12-сатном циклусу светло/мрак. 5КСФАД мишеви на позадини Ц57БЛ6 (Јацксон Лабораториес) одржавани су укрштањем трансген-позитивних хемизиготних мужјака Ц57БЛ6 мишева са трансген-негативним женкама Ц57БЛ6 мишева (Јацксон Лабораториес).

У нашем протоколу хроничног лечења, третмани лековима су започели са 2 месеца старости, узрастом у којем почиње таложење плака [36, 37]. У протоколу акутног лечења, лечење лековима је започето са 5 месеци старости, након чега су депозиција плака и дегенерација аксона широко распрострањени [38, 39].

ЛНК{{0}} је синтетизовао Линк Медицине (Масацхусеттс УСА), а лонафарниб је набављен од Цаиман Цхемицал Цомпани (Анн Харбор, МИ). За третмане животиња, ЛНК-745 и лонафарниб су припремљени у загрејаном раствору 0.5% карбоксиметилцелулозе (Сигма-Алдрицх) као вехикулума у ​​концентрацији од 0,10мг/мЛ док се не растворе и раствор се јасно.

Аликвоти за ињекције су замрзнути на -20 степени, а затим одмрзнути и чувани на 4 степена за сваку недељу третмана. Мишеви су третирани према утврђеном протоколу за који је познато да појачава активност лизозома [8]. У протоколу хроничног лечења, 2-месечним 5КСФАД мишевима је убризгавано интраперитонеалном (ип) ињекцијом било вехикулума, ЛНК754 или лонафарниба дневно користећи 29-инзулински шприц 12 недеља док мишеви нису напунили 5 година. месецима. У режиму акутног лечења, 5-месечним 5КСФАД мишевима је ињектовано дневно током 3 недеље.

По завршетку третмана, мишеви су анестезирани и перфузирани, а мозгови су сакупљени за даље анализе (видети одељке испод). За експерименте са ћелијском културом, ЛНК-754 и лонафарниб су растворени у ДМСО и додати у културе примарних неурона миша у концентрацији од 10 нМ током 48 сати. Третман носачем је био еквивалентна количина ДМСО. Ћелије су сакупљене и анализиране као што је описано у наставку.

Антитела

Антитела коришћена за експерименте имунофлуоресценције била су анти-ЛАМП1 пацова (#1Д4Б, ДСХБ), зечји анти-А 42 (#700254, Инвитроген), зечји анти-БАЦЕ1 (#аб108394, Абцам), зечји анти-ИИИ тубулин (#аб18207, Абцам). За имуноблотинг, коришћена су антитела зеца анти-актин (#926–42,210, ЛИ-ЦОР), зечји антип44/42 МАПК (пЕрк1/2) (#ЦС9101, технологија ћелијске сигнализације), зечји анти-44/42 (Ерк1/2) (#ЦС137Ф5, технологија ћелијске сигнализације), зечји анти-ЛАМП1 (#ЦС3234, технологија ћелијске сигнализације), миш анти-БАЦЕ (3Д5; Зхао ет ал., 2007), миш анти-АПП (6Е10) ( #803001, БиоЛегенд), зечји анти-п-тау (сер404) (#ЦС20194, технологија ћелијске сигнализације), миш анти-Тау1 (#МАБ3420, Миллипоре Сигма), преламин-А, (#МАБПТ858, Миллипоре Сигма) и миш анти -ХДЈ-2 (#сц-59,554, Санта Цруз). За имуноблотове коришћена су секундарна антитела против зеца или миша из Вецтор Лабораториес.

Тестирање понашања

Животиње и лечење лековима

Анализе понашања је извршио реМИНД, Инц. користећи хАПП/ПС1 модел миша са неурон-специфичном експресијом клиничког мутанта хуманог амилоидног прекурсора протеина заједно са клиничким мутантом хуманог пресенилина 1 [40]. Овај двоструки трансгени миш показује спонтану, прогресивну акумулацију А у мозгу, што на крају доводи до амилоидних плакова унутар субикулума, хипокампуса и кортекса у доби од 6 месеци. За ову студију је коришћено 48 женки хАПП/ПС1 мишева у позадини ФВБ к Ц57Бл/6Ј старости од 6 месеци, у комбинацији са 12 женки дивљег типа контрола у ФВБ к Ц57Бл/6Ј позадини. Примена 0,9 мг/кг/дан ЛНК-754 је вршена по оралној гаважи, једном дневно, током 12 узастопних дана. Жртвовање животиња је извршено 2 сата након коначног дозирања.

Сви мишеви су генотипизовани ланчаном реакцијом полимеразе (ПЦР) у доби од 3 недеље и добили су јединствени идентификациони број, када су резултати ПЦР били познати. Сви мишеви су двапут проверени другим ПЦР-ом пре почетка студије. Сви мишеви су били слепи рандомизирани и подударни по годинама. Мишеви су компјутерски добили насумични број и насумично распоређени на третман. Група за третман је поново затворила животиње у кавез 15 дана пре почетка студије како би им се омогућило да се упознају са новим контекстом кавеза. Мишеви су имали слободан приступ претходно филтрираној и стерилној води и стандардној храни за мишеве (Сниф® Мс-Х, Сниф Спезиалдиатен ГмбХ, Соест, Немачка). Храна је чувана у сувим и хладним условима у добро проветреној складишној просторији. Количина воде и хране се свакодневно проверава, снабдева по потреби и стандардно освежава једном недељно. Мишеви су првобитно били смештени под обрнутим ритмом дан-ноћ (14 сати светлости/10 сати мрака) почевши од 19 часова у стандардним металним кавезима типа РВС Т2 (површина од 540 цм2).

Кавези су опремљени чврстим подовима и слојевима постељине. Број мишева по кавезу био је ограничен локалним законодавством о добробити животиња. 15 дана пре почетка лечења, мишеви су поново смештени у појединачне вентилисане макролон Т2 кавезе и транспортовани у лабораторију ради аклиматизације на лабораторијско окружење у оквиру припреме за лечење. У лабораторији је дневно-ноћни ритам промењен на 12 сати светлости/12 сати мрака, са почетком у 19 часова.

Моррис водени лавиринт

Моррис Ватер Мазе је изведен 8-12 дана третмана, а животиње су жртвоване непосредно након теста сондом. Базен (бела, кружна посуда пречника 1 м) је садржала воду на 20 степени са титанијум диоксидом као нетоксичним додатком без мириса који је сакрио платформу за евакуацију (1 цм испод нивоа воде). Пливање сваког миша је снимљено и анализирано (Етховисион, Нолдус Информатион Тецхнологи, Вагенинген, Холандија). Пре тренинга, сваки миш је постављен на врх платформе на 15 секунди. За тестове навигације по месту, мишеви су обучени да лоцирају скривену платформу у седам блокова од три испитивања током четири узастопна дана.

Свако испитивање се састоји од теста присилног пливања од максимално 120 секунди, након чега следи 10 минута одмора. Измерено је време потребно сваком мишу да лоцира платформу. Седам узастопних блокова резултира кривом учења. 24 сата након последњег тренинга, свака животиња је имала испитивање сондом са уклоњеном платформом. Мишевима је дозвољено да претражују 60 секунди, а мерено је време претраге квадранта и прелази првобитне позиције платформе. Током завршног теста сонде, мишевима је дозвољено да претражују претходну локацију платформе 60 секунди након што је платформа уклоњена.

Примарна култура неурона

Предњи мозгови су сецирани у Ханксовом балансираном раствору соли (ХБСС) (Тхермо Фисхер #14185–052) од трудних мишева дивљег типа Ц57БЛ6 (Јацксон) на Е15.5 да би се добили примарни неурони. Сецирани предњи мозгови су дигестирани у 2,5% трипсина на 37 степени током 20 минута. Ватрополирана Пастеурова пипета је коришћена за раздвајање неурона у ХБСС. Неурони су затим стављени на плочу са шест бунарчића обложену поли-Л-лизином, 2×106 неурона по бунарчићу у неуробазалној средини са додатком 2% Б-27, 500 μМ глутамина, 10% коњског серума и 2,5 μМ глутамат (све од Тхермо Фисхер).

Медијум је промењен 2 сата касније у Неуробасал са 2% Б-27, 500 μМ глутамина и 2,5 μМ глутамата. 24 сата касније, медијум је промењен у Неуробасал плус 2% Б-27 и 500 μМ глутамина. Половина промена медија је вршена свака 2-3 дана. Примарни неурони су култивисани 7 дана и третирани вехикулом (ДМСО) или 10нМ концентрацијама ЛНК-754 или лонафарнибом током 48 сати. Неурони су затим фиксирани или снимљени уживо као што је описано у наставку.

За фиксацију, неурони су инкубирани 20 минута у 4% параформалдехида, 0.12М сахарозе у 1КСПБС, пермеабилизовани у 0,5% Тритон Кс-100, и инкубирани са примарним антителима преко ноћи, а затим секундарна антитела магарца против миша коњугована са Алекафуором (Молецулар Пробес, 1:1000) и обојена са 300 нМ ДАПИ. Поклопци су постављени коришћењем Пролонг Голд (молекуларне сонде), а слике су добијене на Никон А1 конфокалном микроскопу са 60Кс објективом (НА 1.4) и софтвером НИС Елементс.

Живо снимање неурона

За експерименте са живом сликом, неурони су припремљени као горе и постављени у посуде са стакленим дном од 35 мм (МатТек # П35Г-1.5-14Ц) током 7 дана у култури. 10 нМ ЛНК-754 или лонафарниб је затим додат кондиционираној подлози, контролне културе су третиране са ДМСО као носачем. После 48 сати третмана, медијум је замењен кондиционираним медијумом са необрађених паралелних плоча неурона. 25 нМ ЛисоТрацкер-Греен ДНД-26 (#Л7526, Инвитроген) је додато у кондиционирани медијум, а неурони су инкубирани 30 минута на 37 степени.

Тиме-лапсе снимање неурона је изведено коришћењем Ти2 микроскопа широког поља. Снимање је почело одмах након 30 минута и трајало не дуже од 30 минута. 1--ове експозиције су снимане сваког минута, а 20–30 одвојених области по посуди је снимљено у року од 30 минута. Квантификације удаљености и брзине ЛисоТрацкер честица и анализе кимографа изведене су коришћењем НИС Елементс софтвера и детаљно описане у наставку. У одвојеним експериментима, 1 μМ Лисосенсор-Греен ДНД-189 (#Л7535, Инвитроген) је додат у кондиционирани медијум, а снимљене слике живих неурона су снимљене не дуже од 15 минута коришћењем Никон А1 конфокалног микроскопа са објективом од 60Кс (НА 1.4) и софтвер НИС Елементс.

For more information:1950477648nn@gmail.com