Претходно учење о страху омогућава брзу асимилацију нових сећања страха директно у кортикалне мреже, део 3

Експериментални дизајн

Репродуцибилност података је процењена са различитим понављањима (С1 табела). Први експерименти инактивације ЦНККС-а у Те2 (слике 1А-1Ц) изведени су у већем броју понављања јер су то били први експерименти које смо спровели и служили су за тестирање главне хипотезе наше студије. Животиње су а приори распоређене у различите групе понашања на начин избалансиран по тежини. Мужјаци из истог легла су насумично распоређени у сваку експерименталну групу. Прво смо се позабавили главном хипотезом наше студије, односно, кортикална инактивација може другачије утицати на консолидацију нове меморије страха код експериментално наивних пацова и код животиња које су научиле претходни догађај страха.

Мушке животиње имају изузетно јака памћења јер имају јачи инстинкт преживљавања и жељу за репродукцијом. Животиње које преживљавају у дивљини морају да памте много географских информација, врста хране, трагова предатора и локација чланова групе како би се боље прилагодиле животној средини и заштитиле живот.

На пример, мушки лавови треба да памте статус целе територије, чланске односе и локације такмичара да би заштитили територију и свој статус. Мужјаци зебре морају да запамте локацију извора воде и хране на травњаку да би преживели и размножавали се. Компанија газираних пића једном је објавила оглас који је показао да мужјак поларног медведа може да се сети рониоца и његовог јединственог мириса како би могао да га идентификује следећи пут када га виде.

Због тога мушке животиње морају имати јака памћења у смислу заштите своје територије, обезбеђивања довољно хране и репродукције потомства. Ово их такође чини важним субјектима у људским истраживањима, на пример, за истраживање болести као што су оштећење памћења и Алцхајмерова болест.

У људском свету такође можемо да црпимо инспирацију из сећања мушких животиња. Континуирано излагање новим стварима, континуирано учење и размишљање могу побољшати наше памћење и прилагодљивост и побољшати наш животни стандард и радну ефикасност. Зато, хајде да учимо од мушких животиња, наставимо да акумулирамо знање и искуство, имамо снажне инстинкте за преживљавање и репродуктивне жеље и стварамо бољу будућност. Види се да треба побољшати своје памћење. Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење јер је цистанцхе десертицола традиционални кинески медицински материјал са многим јединственим ефектима, од којих је једно побољшање памћења. Ефикасност млевеног меса потиче од различитих активних састојака које садржи, укључујући киселину, полисахариде, флавоноиде, итд. Ови састојци могу да унапреде здравље мозга на различите начине.

Кликните на сазнајте начине за побољшање функције мозга

У случају статистичких разлика између ових група, на крају смо извршили додатне контролне групе кроз ињекцију физиолошког раствора. Сличан приступ је примењен и на оптогенетске експерименте, где је ААВ-контролна група изведена тек након што су откривене статистичке разлике између наивних и претходно обучених пацова. Ови експериментални распореди су нам омогућили да избегнемо непотребне контролне групе и употребу непотребних животиња, што је кључно питање у европском и италијанском законодавству о експериментисању на животињама (принцип од 3 Рс).

Поступци понашања

Сви експерименти су спроведени током светлосне фазе дана (од 8 до 16 часова). Животиње су транспортоване појединачно од објекта до експерименталних соба у различитим малим провидним кантама у зависности од експерименталних захтева.

Аудитивни тренинг: Прва сесија понашања. Слушне животиње условљене страхом (ЦС1-ЦС2). У овој групи, пацови су нежно узимани из кућног кавеза и преношени из собе за становање у просторију са звучном изолацијом. Једном тамо, животиње су стављене у апарат за кондиционирање који се састојао од правоугаоног црног кавеза (35 × 40 цм) опремљеног решетком од нерђајућег челика (1 цм у пречнику, на размаку од 1, 5 цм) повезаном са поставом за испоруку шока.

Пацови су остављени неометани 1 минут. Након овог времена, примењено је 7 условљених стимулуса (ЦС) који се састоје од чистог тона фреквенције од 15 кХз (по 15 с трајања, 80 дБ, 36 с пробног интервала). Последњих 1 с сваког тона је упарен са болним УЗ (0,5 мА, 1 с). На крају кондиционирања, пацови су враћени у свој кућни кавез.

Животиње само за шок (схоцк-ЦС2). У овој групи, пацови су на сличан начин смештени у исти апарат за кондиционирање. Непосредно након тога, сваки пацов је подвргнут 7-ударцима стопала (1 с, 0.5 мА) један за другим. На крају стимулације, животиње су враћене у кућни кавез. Временско трајање у кавезу за кондиционирање било је мање од 9 секунди. Претходне студије су показале да овај поступак омогућава избегавање асоцијативних процеса између болних и чулних стимулуса [29,30].

Мирис животиња условљених страхом (мирис-ЦС2). У овој групи, пацови су смештени унутар истог правоугаоног црног кавеза који је употребљен у горњим експерименталним групама и повезани на поставку за испоруку шока. Пацови су остављени неометани 2 мин. Након овог времена, дато је 7 ЦС који се састоје од мириса ваниле (10 с трајања сваки, 24 с пробни интервал). Последњих 1 с сваког мириса је упарен са болним УС (0,5 мА, 1 с). Модул за кондиционирање је постављен у близини извора вентилације како би се избјегло постојаност испоручених стимулуса након њиховог отклањања. Кавез је био обезбеђен горњом решетком. Мириси су представљени помоћу олфактометра за разблаживање протока. Чист ваздух (1,5 Л/мин) је био усмерен на електромагнетни вентил, који је, када је радио, пропуштао ваздух у боцу од 15 мл која је садржала 10 мл мириса ваниле.

Животиње само за тон (Тоне-ЦС2). Пацови у овој групи су смештени у исти црни кавез и представљен им је 15-кХз тон (7 стимулуса, 15 с трајања, 36 с ИТИ) испоручен у одсуству САД.

Претходно изложене животиње (Тоне-ЦС1-ЦС2). Пацови су смештени у кавез за кондиционирање и, 1 минут касније, 20 пута им је представљен само 15-кХз тон, а 24 х касније исти тон је упарен са САД који је постао ЦС1.

Животиње условљене страхом од беле буке (ВН-ЦС2). У овој групи, пацови су смештени у правоугаони црни кавез и остављени неометани 1 минут. Након овог времена, примењено је 7 ЦС који се састоје од ВН-а (15 с трајања сваки, 75 дБ, 36 с интервала између покушаја). Последњих 1 с сваког тона је упарен са болним УС (0.5 мА, 1 с). На крају кондиционирања, пацови су враћени у свој кућни кавез.

Аудитивно учење страха: Други тренинг понашања. Две недеље након процедура описаних у горњем параграфу, животиње су обучене за још један другачији задатак кондиционирања слушног страха. Пацови су стављени у стандардну кутију за кожу, као у нашем претходном раду [10], и остављени неометани 2 мин. Након овог времена, испоручено је 7 ЦС-ова који се састоје од чистих тонова фреквенције 3 кХз (8 с трајања сваки, 80 дБ, 22 с међупробног интервала). Последњих 1 с сваког тона је упарен са болним УЗ (0,5 мА, 1 с). На крају кондиционирања, пацови су враћени у свој кућни кавез.

Страх задржавање памћења. Задржавање слушне меморије страха која је недавно стечена на ЦС2 (3 кХз) тестирана је 4 дана касније. За оптогенетичке експерименте, тест недавне меморије је изведен са ласерском испоруком 24 х након ЦС2-УС учења у аналогији са временским интервалом у којем смо извршили инактивацију кортикале кроз давање ЦНККС-а (тј. 24 х након обука). Пацови су навикнути на апарате који се разликују од оних који се користе за кондиционирање и смештени у другу просторију како би се избегло условљено понашање страха контекстуалним сигналима [10,62].

Нови апарат се састојао од прозирног пластичног кавеза са црном обојеном страном затвореном у кутији за пригушивање звука опремљеној издувним вентилатором, који је елиминисао мирисни ваздух из кућишта и обезбедио позадинску буку од 60 дБ. Животињама је било дозвољено да истражују кавез 5 минута дневно током сесије навикавања. На дан теста задржавања памћења на страх, након 2 минута слободног истраживања, испоручили смо 4 ЦС2 од 3 кХз (8 с—22 ИТИ) без праћења ниједног УС.

Ако је то захтевала експериментална потражња, пацови су затим тестирани на задржавање удаљене меморије страха, добијене 2 недеље пре другог испитивања слушног условљавања страха. У том циљу, 7 дана након теста задржавања памћења страха на 3-кХз тон, животиње су стављене у ново окружење (црно-бели пругасти кавез) и затим представљене са 15-кХз тоном. Четири тона су представљена у интервалима од 36 секунди.

Контекстуални тренинг: Прва сесија понашања. Контекстуална група за условљавање страха (ЦткА-ЦткБ). У овој групи, пацови су нежно извучени из њиховог кућног кавеза, стављени у канту и пренети из собе за становање у просторију са звучном изолацијом. Једном тамо, животиње су смештене у апарат за кондиционирање који се састоји од горе поменутог правоугаоног црног кавеза, опремљеног решетком од нерђајућег челика повезаном са поставком за испоруку шока. Пацови су остављени неометани 1 минут. Након овог времена, примењено је 5 УС (0.5 мА, 1 с) са временским интервалима од 51 с. На крају сесије, животиње су враћене у свој кућни кавез.

Група само за шок (схоцк-ЦткБ). Пацови, када су једном стављени у апарат за кондиционирање, одмах су примили 5- шокове стопала (1 с, 0.5 мА) један за другим. Временско трајање у кавезу за кондиционирање било је мање од 7 секунди. Претходне студије су показале да овај поступак омогућава избегавање асоцијативних процеса између болних и чулних стимулуса [29,30].

Група само за шок (схоцк-ЦткБ). Пацови, када су једном стављени у апарат за кондиционирање, одмах су примили 5- шокове стопала (1 с, 0.5 мА) један за другим. Временско трајање у кавезу за кондиционирање било је мање од 7 секунди. Претходне студије су показале да овај поступак омогућава избегавање асоцијативних процеса између болних и чулних стимулуса [29,30].

Ново контекстуално условљавање страха и недавно задржавање сећања на страх. Две недеље након процедура описаних у горњем параграфу, све групе су обучене да повежу ново контекстуално окружење (модул кутије скиннер, смештен у другу просторију) са болним УС (0.5 мА, 1 с) . Свака животиња је стављена у нову комору и остављена неометана 2 мин. Затим је изложен 5 УС одвојеним интервалима од 30 с.

Задржавање контекстуалне меморије страха је тестирано 4 дана након поступка условљавања страха тако што су пацови поново стављени у Скиннер кутију на 3 минута. За оптогенетичке експерименте, тест недавне меморије је изведен са ласерском испоруком 24 х након учења ЦткБ-УС у аналогији са временским интервалом у којем смо извршили инактивацију кортекса кроз давање ЦНККС-а (тј. 24 х након тренинга). Ако је то захтевала експериментална потражња, пацови су затим тестирани на задржавање удаљене меморије страха стављањем животиња у контекст упарен са САД 2 недеље пре нове асоцијације.

Животиње су ношене у 2 различите канте у коморе за кондиционирање према различитим контекстуалним процедурама.

Мера замрзавања. У свим експерименталним поступцима, процена задржавања памћења на страх је одређена као одговор замрзавања [10], анализиран као потпуно одсуство соматске покретљивости осим респираторних покрета. За сваку животињу, време (у секундама) проведено у замрзавању је мерено ван мреже од стране 2 независна посматрача који су били слепи за групе животиња.

Хируршке процедуре

Да би се дале одабране супстанце на циљна места, пацови су анестезирани изофлураном: индукција је изведена при 4% [вол/вол] у 2 Л/мин медицинском ваздуху и продужена до континуираног излагања при 2% [вол/вол]) када су пацови постављени у стереотаксички апарат.

Направљен је рез на лобањи и избушене су мале рупе за шишање да би се омогућило продирање 28-игле за инфузију. За испоруку супстанци коришћен је 10-ул Хамилтон шприц монтиран на инфузиону пумпу. Након инфузије, игла је остављена на месту још 3 мин. Рез је затим затворен клиповима за ране од нерђајућег челика, а животињи је дата поткожна ињекција аналгетичког/антиинфламаторног кетопрофена (2 мг/кг телесне тежине), а животиња је држана на топлом и под надзором до опоравка од анестезије.

Као иу претходним студијама [10,32–34], канилирање животиња није било потребно, јер су активна једињења давана директно стереотаксички. Овај поступак је повољан јер се избегава хируршка траума својствена процедури трајног канилирања, чиме се траума ограничава на пенетрацију једне игле [10,32–34]. Заиста, општа анестезија не утиче значајно на консолидацију памћења [10,32–34]. Да би се осигурало да је време примене једињења у вези са испитивањем учења било тачно, тако да су пацови примали одабрана једињења око 1 х и око 1 дан након тренинга, анестезија изофлураном је индукована 5 минута пре времена планиране ињекције, нпр. у 55. мин код пацова третираних 60 минута након тренинга и 23 х и 55 мин код животиња које су убризгане 24 х након тренинга. Сваки пацов је кондициониран, а затим оперисан одвојено. Животињама које припадају различитим групама понашања манипулисано је на испреплетани начин.

Селективни инхибитор АМПА/каинат глутаматних рецептора ЦНККС ({{0}}Цијано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион) (Тоцрис, 10 нг /ул) [20,21] је растворен у стерилном физиолошком раствору (НаЦл, 0.9%) и подешен на пХ 7,4 помоћу ХЦл. Инхибитор синтезе протеина анизомицин (Мерцк, 125 уг/ул) је растворен у еквимоларној ХЦл, разблажен стерилним физиолошким раствором и подешен на пХ 7,4 са НаОХ. Стерилни физиолошки раствор (0,9% НаЦл) је коришћен као контрола носача. Ове супстанце су билатерално убризгане брзином од 0,1 ул/мин и запремином од 0,5 ул по месту на следећим стереотаксичким координатама преузетим из Пакинос и Ватсон атласа [26], са Те2 кортикалним пољем упућеним у Зиллес атлас [25]:

Секундарни слушни кортекс (Те2): 1) АП: −5,8 Л: ±7,2 ДВ: −6. 2) АП: -6,8 Л: ±7,2 ДВ: −6.

Предњи цингуларни кортекс (АЦЦ): 1) АП: +2,5 Л: ±0,6 ДВ: −2,2. 2) АП: +3,7 Л: ±0,6 ДВ: −2,2.

Запремина ињекције (0.5 ул по месту) одабрана је на основу претходних студија у којима су активна једињења убризгана у Те2 [10,34] и АЦЦ [55,63] код одраслих пацова.

Да би се инактивирао дорзални хипокампус, активна једињења су убризгана у запремини од 0.6 ул по месту на следећим стереотаксичким координатама:

Дорзални хипокампус: 1) АП: −2,8 Л: ±1,6 ДВ: −3,3. 2) АП: −4,2 Л: ±2,6 ДВ: −3.

Иреверзибилне лезије дорзалног хипокампуса изазване су давањем НМДА (Тоцрис, 18 уг/ул, раствореног у стерилном физиолошком раствору, 0,4 ул по месту) брзином од 0.1 ул/ мин у тачкама на горе наведеним координатама. Исте координате су коришћене за контроле убризгане физиолошким раствором и лажно оперисане животиње.

Ред Ретробеадс (Лумафлуор, 1:2 разблаживање у физиолошком раствору, 0.6 ул) су убризгане у БЛА према следећим координатама: АП: -2,8; Л: ±5,4; ДВ: −8.3.

На крају експеримената, хистолошки су верификовани трагови игле у случају ињекција ЦНККС, анизомицина или физиолошког раствора или проширење лезија у случају ињекција НМДА. Пацови су дубоко анестезирани и интракардијално перфузирани са 4% формалдехида. Њихови мозгови су исечени на 30 μм на криостату. Ниссл обојени серијски пресеци су припремљени коришћењем конвенционалне процедуре и пресеци су хистолошки верификовани под микроскопом увећаним на 2,5×.

Оптогенетички експерименти

Ињекција вируса. Адено-асоциран вирус ААВ5:ЦаМКИИ ::еНпХР3.0-трешња и контролни вектор ААВ5:ЦаМКИИ -трешња су добијени са Универзитета Северне Каролине Вецтор Цоре (Цхапел Хилл, Северна Каролина, Сједињене Америчке Државе). Титар ових вируса је био 5:8 Титар вируса био је 5,8 × 10^12 вг/мл за оба вируса. Употреба промотора ЦаМКИИ омогућава експресију трансгена фаворизујући пирамидалне неуроне. Вируси су смештени у замрзивач од -80˚Ц. Вирусне инфузије усмерене на Те2 или АЦЦ изведене су на горе наведеним стереотаксичким координатама у запреминама од 0,5 ул за сваку рупу. Вирус је убризган брзином од 0,1 ул/мин, а игла је остављена на месту додатних 5 мин. Вирусне ињекције су изведене 4 недеље пре оптогенетских експеримената.

Осветљење.

Оптичка влакна (Плекон, језгро од 200/230 μм; дужина 10 мм) су имплантирана билатерално у БЛА (АП=−2,8, Л=± 5,4, В=−8,2 мм од брегма). Оптогенетска инхибиција Те2 пројекција на БЛА или АЦЦ пројекција на БЛА је добијена коришћењем ПлекБригхт Оптогенетиц Стимулатион Систем спојеног на ласерску диоду (Ласерглов Тецхнологиес). Жута светлост (589 нм) се генерише и пролази кроз оптичко влакно. Густина снаге процењена на врху оптичког влакна била је 10 до 15 мВ за осветљење места за пројекцију. Током задржавања памћења страха, емисија светлости је покренута 4 с пре почетка тона, трајала је током тона и заустављена је 4 с након офсет тона. Животиње које припадају групама за условљавање контекстуалног страха добиле су светлосну стимулацију током читавог истраживања контекста (3 мин). Пацови су упознати са патцх каблом 2 дана пре испитивања задржавања меморије.

Имунохистоцхемистри. По завршетку оптогенетских експеримената, пацови су дубоко анестезирани и перфундирани интракардијално са 4% ПАФ да би се испитала дифузија вируса. Мозгови су сецирани, чувани преко ноћи на 4˚Ц и на крају пребачени у 30% сахарозе. Коронални пресеци (30 μм) су исечени на криостату и сакупљени у ПБС. Слободно плутајуће секције су инкубиране у раствору за блокирање 1 х на собној температури. Затим су инкубирани у примарном моноклонском мишјем антителу анти мЦхерри (1:500 разблаживање, Абцам) у раствору за блокирање преко ноћи на собној температури. Након тога, секције су испране ПБС-ом и инкубиране 1 х на собној температури са секундарним флуоресцентним АлекаФлуор-568 анти-мишјим антителом (1:600, Инвитроген) разблаженим у ПБС-у. Секције су опране у ПБС-у, монтиране са медијумом за монтажу који садржи ДАПИ (Вектор), а прекривач је стављен.

Слично су прикупљени и мозгови пацова који су били подвргнути НМДА ињекцијама. Слободно плутајуће секције, после неколико испирања, инкубиране су са примарним моноклонским мишјим анти-Неун (1:1,000 разблажењем, Мерцк) антителом у раствору за блокирање преко ноћи на собној температури. Након тога, секције су испране ПБС-ом и инкубиране 1 х на собној температури са биотинилованим коњским анти-мишјим антителом (1:200 разблаживање, вектор). Комплекс авидин-биотин (АБЦ комплекс 1:100, вектор, 2 х и половина инкубације) је спојен са диаминобензидином (0,03%, Мерцк) да би се обојио Неун. Секције су затим испране у ПБС-у и пренете на желатином обложене плочице, дехидриране и прекривене покровним стакалцем.

Те2 секције пацова убризганих ретро куглицама су подвргнути инкубацији са примарним поликлоналним зечјим анти-Фос антителом (1:2,000, ћелијска сигнализација) у раствору за блокирање преко ноћи на собној температури. Након тога, кришке су испране ПБС-ом и инкубиране 1 х на собној температури са анти-зечјим Алека 488 (1:1,000, Инвитроген, у ПБС-у). Коначно, имуно обележени делови су испрани у ПБС, постављени на желатином обложене плочице и прекривене медијумом за монтажу са додатком ДАПИ.

микроскопија

Означавање мЦхерри је испитано коришћењем Зеисс Аирисцан конфокалног микроскопа: Коришћена су два ласера ​​(405 и 561 нм), од којих сваки одговара вршном спектру емисије за ДАПИ (Ниссл боја за ћелијска језгра) и Алека 568 (мЦхерри ), редом. Да би се анализирала дифузија вируса на местима убризгавања, микрографије Те2 и АЦЦ су добијене као мозаичне слике (сваки појединачни је добијен коришћењем 10× објектива). Терминали аксона у БЛА су анализирани коришћењем 40× објектива као з-стека од 10 секција, размакнутих 1 μм (159 μм квадрат; фракција зумирања, 1,0).

За животиње убризгане ретробеадс које су подвргнуте цФос имуноозначевању, слике су добијене при увећању од 40× (159 μм квадрат; фракција зумирања, 10) са 3 различита ласера, што одговара спектру вршне емисије за ДАПИ (Ниссл боја за ћелијска језгра), АлекаФлуор 488 (цФос) и Текас Ред (Ретробеадс), респективно. Секције од 0,7 μм су добијене дуж 10- μм з-стацка. Број језгара која експримирају цФос, перле означених и двоструко позитивних (цФос+ перле означене) квантификован је за сваку животињу у Те2 региону на антеропостериорним координатама од 6,7 до 7,3 мм од брегме [10]. Подаци су затим усредњени да би се добила средња вредност сваке животиње и резултати су статистички упоређени. Слике пресека са ДАБ бојењем Неуна су анализиране коришћењем софтвера Неуролуцида повезаног са микроскопом преко ЦЦД камере у боји [10].

Анализа података и критеријуми искључења

н за сваку групу је установљено а приори према нашим претходним студијама [10,16,17], раније објављеним радовима из ове области (види као референце за АЦЦ [6,22,55] и Те2 [10,59]), и кроз процене Г-снаге, према следећој табели (Табела 1):

За сваку анализу, проценили смо коначан средњи број од 8 до 10 животиња за сваку групу. Групе су вођене са интерним контролама у истој експерименталној сесији (С1 табела). С обзиром на варијабилност хируршких и бихејвиоралних процедура, а приори смо укључили већи број експерименталних субјеката (до 15% више) који су у неким случајевима испуњавали експерименталне критеријуме и били укључени, чиме смо избегли произвољно искључење. У случају хипокампалних студија, да бисмо проценили ефекте НМДА и ЦНККС ињекција у различитим временским интервалима, избалансирали смо укупан број контролних животиња између пацова са носачем и лажно оперисаним пацовима међу различитим групама.

Анализа понашања, хистолошке инспекције и бројање ћелија вршени су на слепо. Животиње са неадекватном локализацијом трага игле или лезијом у случају НМДА-иреверзибилних лезија искључене су из анализе података (С1 табела). У фармаколошким студијама искључили смо 57 животиња на укупно 465 животиња због погрешног постављања игле (22/255 за Те2, 31/179 за АЦЦ и 4/31 за хипокампус). У студијама праћења, на 21 животињи, елиминисали смо 3 субјекта код којих је ињекција ретробеадс промашила БЛА. У студијама оптогенетике Те2, на укупно 30 животиња, искључили смо 1 пацова јер постављање оптичких влакана није било изнад циљног региона, 1 пацов. На крају крајева, вирус је био одсутан у Те2 и 2 пацова јер је дифузија вируса била мања од 4,7% односно 5,3% површине Те2 на местима убризгавања. Код пацова укључених у статистичку анализу, минимална дифузија вируса била је 39,6% на предњој стереотаксичној координати и 50,2% на више постериорној стереотаксичној координати.

Слично, у експериментима АЦЦ оптогенетике, на укупно 32 животиње, 2 пацова су елиминисана јер постављање оптичких влакана није било изнад циљног региона. Два пацова су искључена јер је вирус у АЦЦ био одсутан, 1 животиња јер је вирус био у суседном секундарном моторном кортексу, а 1 пацов јер је дифузија вируса била мања од 2,3% површине АЦЦ на местима ињекције. Код преосталих пацова, минимална дифузија вируса била је 33,3% на предњој стереотаксичној координати и 42,2% на више постериорној координати.

У НМДА студијама лезија, лезије су углавном биле усмерене на ЦА1 регион дорзалног хипокампуса. Минимално (црвено) и максимално (ружичасто) проширење хипокампалних лезија на целом подручју дорзалног хипокампуса износило је 23,2% односно 53,5% на предњој стереотаксичној координати и 28,3% и 62,3% на више постериорној координати. Од укупно 73 животиње, 4 пацова су елиминисана јер је лезија одсутна, док су додатне 3 животиње одбачене јер је проширење лезија било мање од 5.0% (тачније 4,8%, 4,3%, 3,1 %) који се односи на област хипокампуса на 2 координате.

Анализа контуре подручја је извршена визуелном инспекцијом и ручним квантификацијом коришћењем алата за контуру региона софтвера ЗЕН 3.0. Вредности површине су затим нормализоване на укупну површину региона. Стереотаксичне координате Те2, АЦЦ и хипокампуса су засноване на Паксиновом атласу [26] и, у случају Те2, са кортикалним пољем упућеним у Зилов атлас [25].

Статистичка анализа

Сви подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ. Сви подаци су прошли Левенов тест за једнакост варијанси. Дакле, параметарска статистика је коришћена током свих експеримената. Подаци из 2 групе су упоређени коришћењем 2-репа непарених Студент т-тестова. Поређења више група су процењена коришћењем 1-ваи АНОВА теста са Тукеијевим пост хоц тестом. Да бисмо одговорили на разлике између и унутар група, израчунали смо АНОВА модел 3 × 2 мешовитог дизајна са групом (ЦС1-ЦС2, Тоне-ЦС1-ЦС2, ВН-ЦС2) као између- променљива субјекта и стање (пре и после недавног кондиционирања +ињекција) као променљива унутар субјекта. Тамо где је интеракција група × услов била значајна, извршили смо једноставну анализу главних ефеката и прилагодили смо сваку п-вредност Бонферонијевом корекцијом. За сваки мешовити АНОВА модел, проценили смо претпоставку о сферичности кроз Мауцхлијев тест сферичности.

Статистички параметри (тј. тачна вредност н за сваку групу, СЕМ, статистички тест, величина ефекта и тачна п-вредност) су наведени у легендама. За једнаке величине узорака, величине ефеката за неупарене т-тестове су одређене израчунавањем Цохеновог д или Глассовог д према сличности СД-а, док је, за различите величине узорка, Хедгес'г. Корелације између броја ћелија и смрзавања су израчунате коришћењем Пирсоновог коефицијента. Да бисмо утврдили да ли подаци испуњавају претпоставке статистичког приступа, одбацили смо нулту хипотезу на нивоу П < 0.05. Све статистичке анализе су обављене коришћењем СПСС Статистицс 22 (ИБМ).

Подршка информације

С1 Слика Увећање трагова игле Те2 (А) и АЦЦ кортекса (Б) убризганих ЦНККС, одабраних као примери. (Ц) Када су представљене у истом контексту 2 недеље након процедуре, животиње које су биле само у шоку показале су слаб одговор на страх, показујући да поступак није изазвао условљено замрзавање у контексту у којем је шок испоручен. (Д) Слични резултати као на слици 1 добијени су балансирањем 2 тона коришћених као ЦС (ЦС1, 3 кХз и ЦС2, 15 кХз) (Тест студента, т(14)=3.44, п {{ 13}}.0040, Гласс'с д=4.14). (Е) Код пацова кондиционираних са мирисом-ЦС смрзавање до мириса, 2 недеље након кондиционирања, било је високо чак и ако је тестирано у другом окружењу у вези са контекстом кондиционирања, показујући на тај начин да је страх посебно повезан са овом испоруком сигнала. Скала шипки, 300 μм. ��П < 0,01. Сви подаци су средњи и СЕМ. Збирни подаци за С1 Фиг могу се наћи у пратећим информацијама у датотеци под називом С1 Суппортинг Фигуре Дата. (ТИФ)

С2 Слика. ЦНККС ињекција је нарушила задржавање недавних слушних сећања на страх код пацова код којих је генерализација страха смањена само тоном пре излагања или употребом тона белог шума као ЦС1. АНОВА мешовитог дизајна 3 × 2 (главни ефекат групе: Ф(2,42)=6.478, п {{10}}.00 4, η2=0.236, главни ефекат услова: Ф(1,42)=0.161, п=0.691, η2=0.004, група × интеракција услова Ф(2,42)=3.942, п=0.027, η2=0.158) показала је да је замрзавање тона од 3 кХз пре његовог повезивања са САД било ниже код животиња које су примиле тон од 15 кХз пре упаривања од 15 кХз-УС (н=10, п=0.001) или код пацова кондиционираних на бели шум (н=13 , п=0.008) у поређењу са ЦС1-ЦС2 животињама (н=22) које су показале променљив одговор генерализације страха. Међутим, након ЦС-УС учења и цнкк ињекција у Те2 кортекс, недавно памћење страха је ослабљено у свим групама (п > 0,05). Једноставан главни ефекат унутар група (пре и после ЦС-УС учења праћеног цнкк ињекцијом): ЦС1-ЦС2, п=0.025; Тоне-ЦС1-ЦС2, п=0.189; ВН-ЦС2, п=0.347) ��П < 0,05, ��П < 0,01. Сви подаци су средњи и СЕМ. Збирни подаци за С2 Фиг могу се наћи у Подржавајућим информацијама у датотеци под називом С1 Суппортинг Фигуре Дата. (ТИФ)

С3 Слика. (А) Случајни пример ињекције ретробеадс циљаног на БЛА. (Б и Ц) Примери постављања оптичких влакана изнад БЛА животиња којима су убризгани ААВ вектори у Те2 (Б) и АЦЦ кортекс (Ц). Скала шипки, 500 μм.

Признања

Захваљујемо др Е. Манасеру на њиховој континуираној подршци и саветима.

Прилози аутора

Концептуализација: Ђулија Кончина, Анамарија Рена, Бенедето Сакети.

Курс података: Гиулиа Цонцина, Луиселла Милано, Бенедетто Саццхетти.

Формална анализа: Гиулиа Цонцина, Аннамариа Ренна, Луиселла Милано.

Финансијска аквизиција: Гиулиа Цонцина, Бенедетто Саццхетти.

Истрага: Гиулиа Цонцина, Аннамариа Ренна, Луиселла Милано.

Методологија: Гиулиа Цонцина, Аннамариа Ренна, Луиселла Милано.

Надзор: Бенедето Сакети.

Валидација: Бенедетто Саццхетти.

Писање – оригинални нацрт: Ђулија Кончина, Бенедето Сакети.

Писање – рецензија и уређивање: Аннамариа Ренна, Луиселла Милано.

Референце
1. Франкланд ПВ, Бонтемпи Б. Организација недавних и удаљених сећања. Нат Рев Неуросци. 2005; 6:119–130. хттпс://дои.орг/10.1038/нрн1607 ПМИД: 15685217

2. Дудаи И. Неуробиологија консолидација, или колико је стабилан енграм? Анну Рев Псицхол. 2004; 55:51–86. хттпс://дои.орг/10.1146/аннурев.псицх.55.090902.142050 ПМИД: 14744210

3. Скуире ЛР, Гензел Л, Виктед ЈТ, Моррис РГ. Консолидација меморије. Цолд Спринг Харб Перспецт Биол. 2015; 3:7. хттпс://дои.орг/10.1101/цсхперспецт.а021766 ПМИД: 26238360

4. Алварез П, Скуире ЛР. Консолидација меморије и медијални темпорални режањ: једноставан мрежни модел. Проц Натл Ацад Сци УС А. 1994; 91:7041–7045. хттпс://дои.орг/10.1073/пнас.91.15.7041 ПМИД: 8041742

5. МцЦлелланд ЈЛ, МцНаугхтон БЛ, О'Реилли РЦ. Зашто постоје комплементарни системи учења у хипокампусу и неокортексу: увиди из успеха и неуспеха конекционистичких модела учења и памћења. Псицхол Рев. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com