Екстракти цвећа као мултифункционалне боје у козметичкој индустрији, 2. део

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Многи природни производи се користе у традиционалним медицинским системима за лечење ублажавања симптома бола и упале, [61] стога је истражен ефекат анализираних екстраката на инхибицију активности липоксигеназе и протеиназе. У опсегу анализираних концентрација (100-500 уг/мЛ), ЦТЕ водени екстракт показао је најјачу способност да инхибира протеиназу (Слика 4) (на 57 процената за концентрацију од 500 уг/мЛ). Ова активност је упоређена са добро познатим инхибитором протеиназе диклофенаком, коришћеним као контрола (око 89 процената инхибиције при највишој тестираној концентрацији). Међутим, слични резултати су добијени за ГГЕ и КТЕ екстракт (око 56 процената и 53 процента, респективно, за највеће концентрације). Нижа инхибиција протеиназе је примећена за ПРЕ и ПГЕ екстракте. У даљем тесту мерења способности да инхибира липоксигеназу, водени екстракти из КТЕ и ЦТЕ показују највеће вредности (око 67 процената и 64 процената инхибиције, респективно, за концентрацију од 500 уг/мЛ). Диклофенак је такође коришћен као контрола Екстракти ГГЕ, ПГЕ и ПРЕ такође имају значајно високе вредности (60 процената, 57 процената и 54 процената, респективно) Такође је примећено да способност инхибиције ензима ЛОКС и протеиназе зависи од концентрације екстракта (Слика 5).

Претходне студије су показале да су многа полифенолна једињења значајно допринела антиинфламаторним активностима многих биљних екстраката[62]. Истраживања су показала учешће РОС-а у запаљенском процесу, а фенолна једињења као што су гална и кининска киселина могу блокирати метаболизам арахидонске киселине инхибирањем активности липоксигеназе, или могу послужити као чишћење реактивних слободних радикала, који се производе током арахидонске киселине. [63]. Резултати које су добили БенСаад ет ал. указују да су елагинска киселина, гална киселина и пуницалагин А&Б изоловани из П. гранатум инхибирали производњу азотног оксида(НО), простагландина Е2(ПГЕ2) и интерлеукина 6 (ИЛ-6) у липополисахаридима (ЛПС) изазвану РАВ 267.4 макрофаги. Остаје питање да ли ова једињења делују као једини агенси или имају синергистички ефекат [64]. Пошто многи флавоноиди показују антиинфламаторна својства, због свог унутрашњег антиоксидативног понашања, они су умешани у различите инфламаторне поремећаје.метода екстракције флавоноида пдф,Конкретно, кверцетин је најинтересантнији молекул јер омета специфичне биолошке путеве. Штавише, студије сугеришу да може да смањи инфламаторни процес укључен у неколико модела кроз различите механизме[65]. Конкретно, АМП-активирана протеин киназа и пут хистон/протеин деацетилазе (АМПК/СИРТ1) резултирају занимљивијим управљањем запаљењем. Дакле, АМПК активатори могу смањити упалу макрофага. Кверцетин и други флавоноиди, као активатори АМПК и СИРТ1, могу смањити упалу ометањем овог пута [66]. Такође је показано да кверцетин и кверцетин моноглукозиди испољавају већи потенцијал инхибиције ЛОКС [67] Наир ет ал. су показали антиинфламаторна својства КТЕ екстракта проценом присуства флавонола са кверцетинским делом као што су мангхаслин Ку 3-[2Г] рамнозилрутинозид, Ку 3-О-дирхамнозид и рутин. Ови молекули су показали снажну инхибицију активности ЦОКС{11}} и делимичну супресију РОС. Уопштено говорећи, полифеноли присутни у ЦТЕ су показали антиинфламаторна својства у ЛПС-индукованој упали у ћелијама макрофага РАВ 264.7[68].

Кликните овде да бисте сазнали више

2.5. Процена цитотоксичности

У стварању нових козметичких сировина, једно од најважнијих својстава је њихова сигурност употребе. Супстанце намењене за употребу у козметици морају бити нетоксичне, посебно у односу на ћелије коже, као што су кератиноцити и фибробласти. За одређивање токсичности анализираних екстраката на ХаЦаТ и БЈ ћелије коришћена су два типа тестова.флавоноидиПрва студија, коришћењем теста узимања неутралне црвене боје, омогућава нам да проценимо одрживост ћелија третираних анализираним екстрактима. Ова боја улази у лизозоме живе ћелије и ослобађа се у цитоплазму мртвих ћелија. Уочено је (Слика 6) да екстракт ЦТЕ има највећу способност да повећа пролиферацију и ХаЦаТ и БЈ ћелија. У поређењу са контролом, овај екстракт је постигао око 20 одсто и 40 одсто веће вредности од испитиваног параметра при концентрацији од 250 μЛ/мЛ (ХаЦаТ и Б】) и 500 μЛ/мЛ (БЈ ћелије) респективно. Екстракт ГГЕ у концентрацијама од 100 и 250 μЛ/мЛ и КТЕ екстракт у концентрацији од 500 μЛ/мЛ карактерише мали токсични ефекат на БЈ ћелије. Остали екстракти су позитивно утицали на одрживост ових ћелија. Екстракти ПРЕ и ПГЕ у концентрацији од 100 μЛ/мЛ нису се значајно разликовали од контроле, а повећали су пролиферацију БЈ ћелија за око 10-15 процената у поређењу са контролом при концентрацији од 250 и 500 μЛ/ мЛ. У случају кератиноцита, није примећено смањење виталности ћелија. За екстракте ПГЕ, ПРЕ и ЦТЕ примећено је повећање пролиферације са повећањем концентрације, док је смањење виталности ћелија демонстрирано са повећањем концентрације екстракта КТЕ и ГГЕ.

Други тест који је спроведен за одређивање цитотоксичности тестираних екстраката био је ресазурински тест (Аламар Блуе). Показало се (Слика 7) да виталност ћелија зависи од концентрације екстракта са којим су ћелије инкубиране. У случају фибробласта, екстракти ПРЕ, ПГЕ и ЦТЕ изазивају већу пролиферацију ћелија са повећањем њихове концентрације. При највишој анализираној концентрацији (500 μЛ/мЛ) уочена је око 20 процената већа пролиферација у поређењу са контролом.хесперидин користиКод КТЕ и ГГЕ екстраката примећено је смањење виталности ћелија са повећањем концентрације екстраката. Ови екстракти су показали мали токсичан ефекат на БЈ у концентрацијама од 250 и 500 μЛ/мЛ. У случају кератиноцита уочен је сличан ефекат анализираних екстраката на ћелије коже, али њихова способност пролиферације није била тако јака као код фибробласта. Највећа способност повећања пролиферације кератиноцита уочена је за ЦТЕ екстракт у читавом опсегу анализираних концентрација. Сличне вредности су добијене за ПРЕ екстракт у концентрацији од 250 μЛ/мЛ и за ПГЕ екстракт у концентрацији од 500 μЛ/мЛ. Екстракт КТЕ је показао значајно већи токсични ефекат на ХаЦа ћелије од ГГЕ екстракта.

Анализирани екстракти раније нису били детаљно тестирани на њихову токсичност за ћелије коже. Постоји само неколико студија цитотоксичности на екстракте или њихове главне активне састојке, посебно на ћелије рака. Аутори претходних студија су указали да ови екстракти генерално немају токсични ефекат на ћелије коже, а њихова способност да повећају пролиферацију ћелија најчешће се приписује високом садржају полифенола, антоцијанина и флавоноида [45,69-73 ]. Неки аутори су такође указали да појединачне компоненте садржане у екстрактима могу да испоље токсично дејство на ћелије коже, док екстракт у целини не. Али Хиџази и др. [69] су показали да су алкалоиди екстраховани из Пуница гранатум токсични за нормалне и ћелијске линије рака, док је цео екстракт мање токсичан. Студија Насирија ет ал. [70] указује да екстракт цвета Пуница гранатум може бити користан у убрзавању процеса зарастања рана због своје способности да повећа пролиферацију ћелија коже. У нашим претходним истраживањима [45] показано је да се водено-етанолни екстракти добијени из анализираних биљака одликују већом способношћу повећања пролиферације БЈ ћелија, а КТЕ и ГГЕ екстракти показују мањи токсични ефекат на ове ћелије. .изгубљено царство цистанцхеЕфекат водено-етанолних екстраката на ХаЦаТ ћелије био је сличан оном код чистих водених екстраката, али су у случају екстраката добијених са етанолом уочена нешто повољнија својства пролиферације него у случају водених екстраката. Разлике у саставу оба типа анализираних екстраката могу узроковати разлике у њиховој токсичности. Као што је приказано, водени екстракти нису тако богати биоактивним састојцима као екстракти воде и етанола. Највеће разлике се примећују у садржају рутина и изокверцитрина.

Цистанцхе може против старења

2.6.Одређивање фактора заштите од сунца

Неповољни ефекти УВ зрачења на кожу могу се открити како убрзо након излагања, тако и годинама касније. Сунчево зрачење има имуносупресивно дејство које убрзава процес старења коже са свим последицама које су повезане са тим, укључујући повећану канцерогенезу[74]. Трендови који се тренутно посматрају указују на растућу потребу за развојем производа које карактерише не само веома висок ниво безбедности у употреби, већ и мултифункционалност у смислу да ће производи имати заштиту коже од зрачења са ширим обимом деловања од до сада коришћених. Неке биљне супстанце играју непроцењиву улогу у овом аспекту, које могу не само да обезбеде заштиту од сунца већ и да неутралишу већ постојеће негативне ефекте сунчевог зрачења на кожу [75-77]. Спроведено истраживање је показало да се анализирани биљни екстракти ПРЕ, ПГЕ, КТЕ, ЦТЕ, ГГЕ одликују високим СПФ коефицијентом.

Урађена је анализа коефицијената (СПФ) за добијене водене екстракте из наведених биљака у концентрацијама од 10 и 50 мг/мЛ. За сваку испитивану биљку већа концентрација екстракта резултирала је значајно већом вредношћу СПФ-а.микронизована пречишћена фракција флавоноида 1000 мг користиПоређење између екстраката показује да су највеће вредности СПФ уочене за КТЕ екстракт, што важи за обе испитиване концентрације. Још једно занимљиво запажање је да чак иу нижим од испитиваних концентрација КТЕ екстракт и даље показује висок СПФ, док су вредности за друге екстракте приметно смањене. Ово је јасно када анализирамо колико је резултат за КТЕ био већи од других екстраката. За концентрацију од 50 мг/мЛ, СПФ је био већи за фактор од 1,2 (у поређењу са ПГЕ, ЦТЕ) до фактора од скоро 1,9 (у поређењу са ПРЕ, ГЕ). Исти прорачун за концентрацију од 10 мг/мЛ ће дати факторе од 1,4 (у поређењу са ПГЕ) до фактора опсега 2-3 (у поређењу са ЦТЕ, ГГЕ), чак и до фактора као што је 10 у поређењу са ПРЕ. Када се фокусирамо на КТЕ екстракт, може се приметити да смањење концентрације екстракта за фактор 5 (са вредности од 50 мг/мЛ на вредност од 10 мЛ/мЛ) доводи до смањења СПФ вредности за фактор 3,4 , што значи да СПФ опада спорије од концентрације. Горе наведено показује да КТЕ екстракт може бити ефикасан чак и када се примењује у ниским концентрацијама (Слика 8).

2.7. Транссепидермални губитак воде (ТЕВЛ) и мерења хидратације коже

Због широког спектра биолошке и фармаколошке активности биљних сировина, биљне супстанце садржане у екстрактима имају значајан утицај на стање коже. Конкретно, овде је реч о утицају секундарних метаболита на стање наше коже [78,79].

У следећој фази истраживања спроведене су анализе хидратације и ТЕВЛ. Процењено је дејство испитиваних екстраката на кожу. Мерења су вршена у двовременим интервалима од 60 и 360 мин за концентрацију екстракта од 10 мг/мЛ. За мерење ТЕВЛ, највећи процентуални пад је приказан за ПГЕ екстракт, где је контролна вредност од 13,9 пала на 8,71, што је резултирало процентуалним смањењем од 37 процената. Такође је вредно анализирати КТЕ екстракт из те перспективе, јер је овај имао највише СПФ вредности. За екстракт КТЕ, ТЕВЛ контролна вредност се смањила на вредност од 10,22, што значи смањење од 26 процената (слика 9А).

Међутим, у случају другог инструменталног мерења показало се да анализирани екстракти изазивају повећање влажности у односу на контролни узорак, како после 60 тако и после 360 мин.

Као резултат анализа, установљено је да анализирани екстракти ПРЕ, ПГЕ, КТЕ, ЦТЕ и ГГЕ повећавају хидратацију коже (Слика 9Б). Уочено је повећање хидратантних својстава заједно са повећањем концентрације екстракта у препаратима. Најјача својства хидратације примећена су за ПРЕ и ПГЕ екстракте од 32 процента и 29 процената након 60 минута и једнаких 21 процената и 22 процента након 360 минута. Најнижи ниво хидратације коже, међутим, пронађен је за КТЕ екстракт који износи 18 процената након 60 минута и близу 3 процента након 360 минута.

2.8. Анализа апликације

2.8.1. Одређивање параметара боје екстраката

Због своје природне боје, активни састојци биљног цвећа могу се користити као природне боје у многим комерцијалним производима, као што су козметика и храна. За добијене екстракте извршена је анализа боје (табела 5).

Утврђено је да екстракти ПРЕ, КТЕ и ЦТЕ имају највећи потенцијал као природни козметички пигменти. Међутим, највеће вредности хрома (Ц*) су примећене за ЦТЕ. На основу вредности параметра х степена, утврђено је да је жута боја овог екстракта та која је уочена и видљива голим оком. У случају КТЕ и ПРЕ екстраката, упркос ниској вредности Ц* (2.8), боја ових екстраката може се јасно видети голим оком и одређена је као црвено-љубичаста за ПРЕ и плаво-љубичаста за КТЕ екстракт. Водени екстракти ПГЕ и ГГЕ су били црвенкасте и благо наранџасте боје, а добијене вредности хрома биле су на нивоу од 1,3. За ову боју ове вредности нису биле значајно видљиве голим оком.

2.8.2. Одређивање параметара боје козметике на основу екстраката

Последњих година постоји велика потреба за развојем нових боја природног порекла, посебно у прехрамбеној и козметичкој индустрији. У поређењу са синтетичким добијеним бојама, оне могу имати мањи негативан утицај на здравље људи и животну средину [80]. Добијени екстракти су коришћени у формулацији модела течности за уклањање мицеларне шминке. У свакој формулацији коришћени су у концентрацији од 1 проценат. Резултати параметара боја моделске козметике приказани су у табели 6.

Примећено је да додатак 1 процента водених екстраката из ПРЕ, ПГЕ, ЦТЕ и ГГЕ значајно утиче на боју средства за уклањање шминке. Сваки узорак је био јасно видљив голим оком у боји. ПРЕ екстракт је променио боју козметике у наранџасту, а екстракт ПГЕ, ЦТЕ и ГГЕ променио је боју у жуту.

Могућност коришћења анализираних екстраката као потенцијалних боја потврђују и релативно високе вредности △Одстрањивач шминке са екстрактом/базни одстрањивач шминке, што указује на значајну промену боје модела козметике са додатком екстракта у поређењу са на основни узорак (без додавања екстраката). Подаци из литературе [73] показују да ако су вредности АЕ веће од 5, боја се перципира голим предвечерјем и перципира се као ефекат боје. За средства за скидање шминке која садрже ПРЕ, КТЕ и ЦТЕ екстракте, добијене су вредности АЕ од 8,83, 9,17 и 8,14, респективно. Код производа са екстрактима ПГЕ и ГГЕ није примећен значајан утицај екстракта на боју препарата. Вредности АЕ су у опсегу од 2.51-2.82. То значи да је разлика у боји уочљива само искусном посматрачу [80,81].

3. Материјали и методе

3.1. Биљни материјал и поступак екстракције

Биљни материјал коришћен у истраживању су суви цветови П. рхоеас Л., П.гранатум Л., Ц.тернатеа Л., Ц.тинцториус Л. и Г.глобоса Л., који су набављени у локалној травари. . Процес екстракције је изведен у ултразвучном купатилу (Дигитал Мгтрасониц Цлеанер, Берлин, Немачка), који је спроведен методом коју су описали Ианг ет ал.[82]. За припрему водених екстраката испитиваних биљака коришћено је 10 грама сувог цвећа и 100 г воде. Процес је изведен 20 минута на собној температури. Добијени екстракти су затим сакупљени и филтрирани три пута кроз Вхатман Но. 1 филтер папир. После филтрације, екстракти су упарени под сниженим притиском на 40 степени. Од осушених екстраката припремљен је основни раствор у концентрацији од 100 мг/мЛ и чуван у мраку на 4 степена до даље анализе. Користе се следеће скраћенице: ПРЕ — екстракт Папавер рхоеас, ПГЕ — екстракт Пуница гранатум, ГГЕ — екстракт Гомпхрена глобоса, ЦТЕ — екстракт Цартхамус тинцториус, КТЕ — екстракт Цлиториа тернатеа.

3.2. Одређивање биоактивних једињења помоћу ХПЛЦ-УВ-ЕСИ-МС

Добијени екстракти су анализирани да би се одредила њихова главна биоактивна једињења коришћењем ХПЛЦ(ДионекУлтиМате 300{{20}} РС Тхермо Фисхер Сциентифиц, Суннивале, ЦА, УСА), спојеног са масеним спектрометром (4000 КТРАП, АБ Сциек, Цонцорд, ОН, Канада), опремљен са електроспреј јонизационим извором (ЕСИ) и троструком масом квадруполних јона анализатор. Хроматографско одвајање је постигнуто са градијентним системом реверзне фазе. Штавише, 100×4,6 мм хроматографска колона Кинетек 3,5 μм КСБ-Ц18 100 А са изо-бутил бочним ланцима и са стационарном фазом за затварање ТМС која се користи са заштитном колоном сличног састава је купљена од Пхеноменек-а и одржавана на 30 степени . Бинарни систем растварача који се састоји од 0,1 процента (о/в) водене мравље киселине као растварача А и метанола као растварача Б коришћен је под градијентом током 19,1 мин времена рада. Примењени услови елуирања били су следећи: 0.0-15.0 мин 25-100 проценат Б,15.0-17.0 мин 100 процената Б,17.0-17.1 мин 100-25 проценат Б,17.1-19.1 мин 25 процената Б. Брзина протока мобилне фазе је била 0,6 мЛ/мин, а запремина ињекције 10 μЛ. Елуент је праћен електроспреј јонским масеним спектрометром (ЕСИ-МС) у режиму негативних јона и скениран од м/з 20 до 1000 Да. За квантификациону анализу, троструки квадруполни МС детектор је радио у режиму скенирања вишеструких реакција (МРМ). Експериментално су одређени оптимални услови анализатора масе и избор продуктних јона за поједина једињења. У ту сврху уведени су стандардни раствори испитиваних једињења (1 нг/мЛ) у саставу мобилне фазе коришћењем инфузионе пумпе која ради са константном доставом узорка. Након што се осигура да је одабран исправан јон прекурсора, потенцијал декластерирања (ДП), улазни потенцијал (ЕП), излазни потенцијал ћелије судара (ЦКСП) и енергија судара (ЦЕ) су оптимизовани за сваки прелаз МРМ (Табела С1). Праћене су две МРМ транзиције, једна за квантификацију и једна за потврду. Параметри МС-а су подешени на следећи начин: температура капилара од 600 Ц, завесни гас на 35 пси, гас небулизатора на 60 пси и гас за сушење на 50 пси. За одређивање биоактивних једињења примењен је напон извора у режиму негативне јонизације -4500 В. Азот је коришћен као гас за завесу и колизију. Анализа података је обрађена софтвером Аналист 1.5.1. Идентификација одабраних једињења је извршена према молекулској маси и фрагменту ањонских уноса сваког појединачног једињења и потврђена МС2 фрагментацијом. Одређени су идентитети девет једињења заједно са њиховом хемијском формулом, депротонираним молекуларним јонима и карактеристичним фрагментима јона за сваки појединачни пик. Шест једињења је квантификовано на основу калибрационе криве генерисане коришћењем области пикова најинтензивнијих МРМ прелаза аналитичких стандарда. Линеарност одговора детектора за квантификована једињења је демонстрирана убризгавањем калибрационих стандарда на осам нивоа концентрације у распону од 0,01 уг/мЛ до 2уг/мЛ. Калибрационе криве су биле линеарне са коефицијентима корелације (Р) већим од 0,99. У случају да узорци нису пали у линеарни опсег ЦМС детектора, узорци су разблажени.

Аналитички стандарди кининске киселине, галне киселине, кафеинске киселине, кафеоилкинске киселине (ЦКА, два изомера:3- и 5-ЦКА) и кверцетина су набављени од Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД ). Сви коришћени стандарди су били аналитичког квалитета (2 већи од или једнак 99 процената чистоће).

Стандардни основни раствори су припремљени тачним мерењем и растварањем 20 мг сваког стандарда у 10 мЛ ЛЦ-МС метанола да би се добила концентрација од 2 мг/мЛ. Серијска разблажења од 2.{{10}} уг/мЛ, 1,5 уг/мЛ, 1.0 уг/мЛ, 0.5уг/мЛ,0 .1 уг/мЛ, 0.05 уг/мЛ, 0.02 уг/мЛ и 0.01 уг/мЛ су затим направљени коришћењем ЛЦ-МС раствора метанола. Граница квантитације (ЛОК) је дефинисана као 0,01 уг/мл.

ЛЦ-МС/МС тест је изведен у три примерка. Добијени подаци су представљени као средње вредности ± стандардне девијације.

3.3. Одређивање антиоксидативних својстава

3.3.1.АБТС· плус тест чишћења

Прво, АБТС раствор је припремљен мешањем 19,5 мг АБТС и 3,3 мг калијум персулфата са 7 мЛ фосфатног пуфера (пХ=7.4) и растворен 16 х у мраку. Затим је раствор разблажен до апсорбанције на нивоу од око 1.0. Апсорбанције су мерене на таласној дужини 入=734 нм. Затим, 20 мЛ екстракта КТЕ, ПГЕ, ПРЕ, ЦТЕ и ГГЕ (10,100,250,500 уг/мЛ) је помешано са 980 мЛ разблаженог раствора АБТСе плус и затим инкубирано 10 минута у мраку. У следећем кораку, мерена је апсорпција припремљених узорака на 入=734 нм коришћењем УВ/ВИС спектрофотометра Акуамате Хелион (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Као бланко је коришћена дестилована вода. АБТС плус чишћење је израчунато из једначине (1):

где је: Ас - апсорпција узорка; Ац—апсорбанција контролног узорка. Мерења су обављена у три примерка за сваки екстраховани узорак. Поступак су описали Гавел-Бебен ет ал. [83].

3.3.2. ДППХ анализа уклањања радикала

Способност екстраката да уклоне слободне радикале спроведена је методом коју су описали Бранд-Виллиамс ет ал. [84]. Заснован је на употреби 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (ДППХ) радикала. Прво, 33 μЛ водених раствора екстраката у концентрацијама од 100 уг/мЛ је помешано са 167 μЛ метанолног раствора ДППХ (4 мМ) и пребачено у 96- плочу са бунарима, а затим помешано мућкањем. Након тога, мерена је апсорпција узорака на таласној дужини од 517 нм. Мерења су вршена сваких 5 минута током 30 минута на УВ-ВИС Филтер Мак入=5 спектрофотометру (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА). Изведене су три независне реплике за сваки екстракт. Као контрола коришћена је вода са раствором ДППХ. Антиоксидативни капацитет је изражен као проценат инхибиције ДППХ помоћу једначине (2):

где је: Ас - апсорпција узорка; Ац—апсорбанција контролног узорка. Мерења су обављена у три примерка за сваки екстраховани узорак.

3.3.3. Детекција унутарћелијских нивоа реактивних врста кисеоника (РОС)

Да би се утврдила способност анализираних екстраката да генеришу интрацелуларну производњу реактивних врста кисеоника у ХаЦаТ и БЈ ћелијама, коришћена је флуорогена Х, ДЦФДА боја. Ово једињење има способност да уђе у ћелије пасивном дифузијом, где се деацетилује интрацелуларним естеразама у нефлуоресцентно једињење. Ако су реактивне врсте кисеоника присутне у ћелији, ово једињење се трансформише у високо флуоресцентни ДЦФ. Да би се одредио интрацелуларни ниво РОС у ХаЦаТс и БЈ, ћелије су засејане у 96-плоче са бунарима. Затим су ћелије култивисане у инкубатору 24 х. ДМЕМ медијум је уклоњен и замењен са 10 μМ Х2ДЦФДА (Сигма Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) раствореним у ДМЕМ медијуму без серума. ХаЦаТ и БЈ ћелије су инкубиране у Х, ДЦФДА током 45 минута, а затим инкубиране са екстрактима у концентрацијама ∶ од 100, 250 и 500 уг/мЛ. Ћелије третиране са 1 мМ водоник пероксида (Х2О2) коришћене су као позитивне контроле. Контролни узорци су ћелије које нису третиране испитиваним екстрактима. ДЦФ флуоресценција је мерена сваких 90 минута коришћењем читача микроплоче ФилтерМак Ф5 (Тхермо Фисхер Сциентифиц) при максималној ексцитацији од 485 нм и спектрима емисије од 530 нм [85].

3.4. Процена инхибиције матриксних металопептидаза

3.4.1. Одређивање анти-еластазне активности

Да би се утврдила могућност инхибиције матрикс металопротеиназе, неутрофилне еластазе (НЕ), примењен је флуорометријски комплет (Абцам, аб118971). Тест је спроведен у складу са упутствима приложеним уз комплет и поступком који су описали Низиол-Лукасзевска ет ал. [86]. Анализе су обављене у стандардној 96-плочи за бунар са чистим равним дном. За анализу су коришћени биљни екстракти у концентрацији од 100 и 250 уг/мЛ. У почетку су раствори НЕ ензима, НЕ супстрат и инхибиторна контрола (СПЦК) припремљени према упутствима. Разблажени НЕ раствор је додат у све базенчиће, а затим су тестни узорци, контрола инхибитора и контрола ензима (Пуфер за испитивање) додати у наредне базенчиће. Након тога, узорци су помешани и инкубирани на 37 степени 5 минута. У међувремену, припремљена је реакциона смеша мешањем пуфера за испитивање и НЕ супстрата. Смеша је додата у сваки бунар и добро промешана. Флуоресценција је мерена одмах на таласној дужини ексцитације 入=400 нм и емисији 入=505 нм помоћу читача микроплоче (ФилтерМак Ф5, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) Способност инхибирања НЕ активности анализираног узорци су израчунати из једначине (3):

Коначни резултат је била аритметичка средина три независна мерења.

3.4.2. Одређивање анти-колагеназне активности

Да би се проценила способност добијених екстраката да инхибирају активност колагеназе, примењен је флуорометријски комплет (Абцам, Цамбридге, УК, аб211108). Тест је спроведен у складу са упутствима приложеним уз комплет и поступком који су описали Низиол-Лукасзевска ет ал. [86]. Анализе су обављене у стандардној 96-плочи за бунар са чистим равним дном. За анализу су коришћени биљни екстракти у концентрацији од 100 и 250 уг/мЛ. Прво, колагеназа (ЦОЛ) је растворена у пуферу за анализу колагеназе (ЦАБ). Затим су анализирани узорци додати ЦОЛ и ЦАБ. Контролни узорци инхибитора припремљени су мешањем инхибитора колагеназе (1,10-фенантролин (80 мМ) са колагеназом и ЦАБ пуфером. Контролне јажице ензима су припремљене мешањем разблаженог ЦОЛ са ЦАБ. ЦАБ пуфер је коришћен као позадинска контрола Затим су узорци инкубирани на собној температури 15 мин. Реакциона смеша је припремљена мешањем супстрата колагеназе са ЦАБ. Овако припремљена реакциона смеша је додата у све анализиране узорке и добро измешана. Након тога је мерена флуоресценција на таласне дужине ексцитације од 490 нм и емисије од 520 нм Мерење је вршено у кинетичком режиму 60 мин на 37 Ц. Способност инхибиције ЦОЛ активности добијених екстраката израчуната је једначином (4):

3.5. Одређивање антиинфламаторних својстава

3.5.1. Инхибиција денатурације протеина

Инхибициона активност протеина екстракта ПРЕ, ПГЕ, КТЕ, ЦТЕ и ГГЕ изведена је према методи Саката и сар.[87], коју су модификовали Гунатхилаке ет ал.[88]. Укратко, реакциони раствор (2 мЛ) се састојао од 1 мЛ 1 процента трипсина у 2{{10}} мМ Трис-ХЦл пуфера (пХ7,4) и 1 мЛ тест узорка ({{17} }.02 мЛ екстракта 0,980 мЛ воде). Раствор је инкубиран (37 степени током 5 мин), а затим је додат 1 мЛ 0,8 процената (в/в) казеина и смеша је даље инкубирана 20 мин. На крају инкубације додато је 2 мЛ 70% перхлорне киселине да би се реакција завршила. Смеша је центрифугирана, а апсорбанца супернатанта је мерена на 210 нм у односу на пуфер као бланко. Као контрола је коришћен раствор фосфатног пуфера. Проценат инхибиције денатурације протеина је израчунат коришћењем следеће формуле:

где је А1= апсорпција контролног узорка и А2= апсорпција тест узорка.

3.5.2. Инхибиција активности липоксигеназе

Способност добијених екстраката да инхибирају активност липоксигеназе одређена је методом коју су описали Сарвесваран ет ал. 【89】. Прво, 10 μЛ биљних екстраката у различитим концентрацијама (100, 250 и 500 уг/мЛ) је помешано у 96- плочици са 160 μЛ 100 мМ ПБС и 20 μЛ раствора сојине липоксигеназе (167 У/ мЛ）. Узорци су инкубирани на 25 степени током 10 минута и након овог времена додато је 10 μЛ натријум-линолеинске киселине да би се покренула реакција. Затим је мерена апсорпција узорака на 234 нм током периода од 3 мин у сваком минуту помоћу читача ФилтерМак Ф5 микроплоче (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА). Диклофенак је коришћен као позитивна контрола. Проценат инхибиције активности липоксигеназе израчунат је из једначине (6):

где је: Ас је апсорбанца тестираног узорка, Ац је апсорбанца негативне контроле.

Коначни резултат је била аритметичка средина три независна мерења.

3.6. Анализа цитотоксичности

3.6.1. Ћелијска култура

У овој студији коришћене су две ћелијске линије коже: нормални хумани кератиноцити (ХаЦаТ) и фибробласти (БЈ). ХаЦаТ су добијени од ЦЛСЦелл Линес Сервице (ЦЛС Целл Линес Сервице ГмбХ, Еппелхеим, Немачка) и БЈ из Америчке колекције типских култура ( Манассас, ВА, САД). Ћелије су узгајане у Дулбеццо-овој модификацији Еагле'с Медиум (ДМЕМ, Биологицал Индустриес, Цромвелл, ЦО, УСА) са натријум пируватом, Л-глутамином и високим садржајем глукозе (4,5 г/Л). Медијум је такође обогаћен са 10 процената феталног говеђег серума (Гибцо, Валтхам, МА, УСА) и 1 проценат са антибиотицима (100 У/мЛ пеницилина и 1000 уг/мЛ стрептомицина, Гибцо) да би се спречила микробна контаминација. Ћелије су узгајане у инкубатору на 37 степени у влажној атмосфери од 95 процената ваздуха и 5 процената угљен-диоксида.

3.6.2.Аламар Блуе Тест

Након што су култивисане ћелије (ХаЦаТ и БЈ) дошле до жељене конфлуенције, ДМЕМ медијум је аспириран у боце за културу. Ћелије причвршћене на дно су два пута испране стерилним физиолошким раствором пуферованим фосфатом. Ћелијски слој је одвојен трипсином, а затим су ћелије стављене у свеж ДМЕМ медијум. Ћелије су постављене у 96- плоче са равним дном (ВВР, Раднор, ПЕ, УСА) и након причвршћивања на дно плоча, ћелије су третиране екстрактима (100, 250 и 500 уг/мЛ). Ћелије су инкубиране 24 х.

Тест цитотоксичности је изведен са Аламар Блуе тестом (Сигма, Р7017, Лифе Тецхнологиес, ​​Блеисвијк, Холандија). После инкубације, раствор ресазурина у концентрацији од 60 уМ је додат у бунарчиће, а затим су плоче стављене у инкубатор на 37 степени током 2 х. Након овог времена, измерена је флуоресценција (入=570нм). Свака концентрација екстракта је изведена у три понављања.

3.6.3. Тест неутралног уноса црвене боје

Тест неутралног уноса црвене боје је други тест који се користи за одређивање цитотоксичности ПРЕ, ПГЕ, КТЕ, ЦТЕ и ГГЕ. Прво,96-плоче са равним дном су припремљене као што је описано у претходном одељку. После 24 х излагања ћелија екстрактима, оне су аспириране и замењене неутралном црвеном бојом (40 уг/мЛ) и инкубиране 2 х. После овог времена, ћелије су испране физиолошким раствором пуферованим фосфатом. У следећем кораку, пуфер за деколоризацију (150 μЛ) је додат у бунарчиће. Затим је одређен унос неутралне црвене две мерењем оптичке густине (ОД) на 540 нм. Свака концентрација екстракта је изведена у три понављања.

3.7. Одређивање фактора заштите од сунца (ин витро)

Фактор заштите од сунца (СПФ) одређен је мерењем апсорбанције воденог раствора екстраката у концентрацијама од 10 уг/мЛ и 50 уг/мЛ, у опсегу таласних дужина од 290 до 320 нм у интервалима од 5- нм. На основу добијених резултата, СПФ је израчунат из Мансурове једначине [90]: где је ∶ ЕЕ（λ）—спектар еритемског ефекта, И(入)—спектар сунчевог интензитета, АБС(入)—апсорпција производа за заштиту од сунца, ЦФ— Корекциони фактор (=10), Е (Н)×И (λ) — коришћене су вредности које је одредио Саире [91].

3.8. Трансепидермални губитак воде (ТЕВЛ) и мерења хидратације коже

ТЕВЛ и мерења хидратације коже спроведена су коришћењем сонде ТЕВАметер ТМ 300 и сонде Цорнеометер ЦМ 825 повезане на МПА адаптер (Цоураге плус Кхазака Елецтрониц, Келн, Немачка). У студији је учествовало пет добровољаца. На њиховој подлактици коже, обележено је шест површина (величине 2 × 2 цм).На пет места нанета је количина од 0,2 мЛ испитиваних биљних екстраката, шесто место је контрола (не третирана узорцима). После 60 и 360 мин. , мерења нивоа хидратације и ТЕВЛ Коначни резултат је била аритметичка средина (од сваког волонтера) пет независних мерења (хидратација коже) и 20 мерења (ТЕВЛ).

3.9. Припрема маке уп козметике (средство за уклањање шминке) која садржи екстракте

Припремљен је модел козметике (средство за скидање шминке). Све коришћене компоненте биле су у складу са захтевима ЕцоЦерт и ЦОСМОС. Формулација је приказана у табели 7.

Производ је произведен мешањем састојака (од тачке 1 до тачке 6) на собној температури док се не добије хомогена течност. У последњем кораку, пХ формулације је подешен. Средство за скидање шминке подељено је на порције. Количина од 1 проценат основних раствора екстракта је додата у сваку порцију и добро промешана.

3.10.Одређивање параметара боје екстраката и козметике (средства за уклањање шминке) која садржи екстракте

Узорци екстраката и козметике са екстрактима тестирани су на собној температури, 48 х након њихове припреме. ЦХРОМА МЕТЕР ЦР-400 (Коница Минолта, Сенсинг Инц., Токио, Јапан) је коришћен за процену параметара боје (ЦИЕЛАБ координате). ЦИЕЛАБ систем је дефинисала Међународна комисија за осветљење 1978. године. Заснован је на три атрибута боје: Л*, а*,б, где је Л* променљива светлине пропорционална вредности у Манселовом систему, а а* и б* су хроматске координате. Координате а* и б* означавају позиције на црвено/зеленој и жуто/плавој оси, респективно ( плус а=црвена, -а=зелена; плус б=жута, - б =плава).

На основу добијених података: Л*, а* и б*, израчунати су следећи параметри боје: хрома (Ц*) и нијанса (х). Коришћене су следеће једначине:

4. Закључци

На основу добијених резултата може се закључити да испитани биљни екстракти показују неколико позитивних особина, захваљујући којима се могу користити у производњи козметике као њихов безбедан и биоактиван састојак. Показало се да су ове биљке богат извор полифенола, што им даје антиоксидативна својства. ПРЕ је показао најбољу способност уклањања слободних радикала, што је вероватно зато што садржи највише полифенола у поређењу са другим биљкама. ПГЕ и ПРЕ су показали најбољу способност да смање производњу РОС у ћелијама. Штавише, биљке не показују никакву цитотоксичну активност. Сви испитивани екстракти су показали инхибиторни ефекат на ензиме еластазе и колагеназе, при чему су П. гранатум и ГГЕ имали највеће инхибиторно дејство. То може указивати на то да се ове биљке могу користити у козметици као супстанце које успоравају процесе старења. Штавише, добијени резултати указују на то да ове биљке имају антиинфламаторна својства. У овом случају, чини се да су ЦТЕ и КТЕ најбољи. КТЕ и ПГЕ су показали заштитни ефекат против УВ зрачења, чак и при ниским концентрацијама. У већим концентрацијама све биљке су имале УВ заштитно дејство. Поред тога, биљке су имале позитиван ефекат на хидратацију коже и смањују трансепидермални губитак воде. ПРЕ, КТЕ и ЦТЕ екстракти се могу користити као ефикасне боје у козметичким производима. Модел течности за скидање шминке која садржи горе наведене екстракте карактерише интензивна и стабилна боја током времена. Боју козметике са екстрактима ПГЕ и ГГЕ могу приметити само искусни посматрачи и не разликују се значајно од празног козметичког узорка, без додатка екстракта. Узимајући у обзир све добијене резултате, може се закључити да се Папавер рхоеас, Цлиториа тернатеа и Цартхамус тинцториус могу успешно користити као извори жутих, наранџастих, плавих и љубичастих боја у производњи козметике која ће бити безбедна за употребу и, штавише, имаће позитиван ефекат на кожу.

Овај чланак је извучен из Молецулес 2022, 27, 922. хттпс://дои.орг/10.3390/молецулес27030922 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/молецулес