Гомисин Н инхибира меланогенезу кроз регулисање ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК сигналних путева у меланоцитима

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан: Гомишин Н, једно од лигнанских једињења пронађених у Сцхисандра Цхиненсис показало се да поседује антиоксидативно, анти-туморогено и антиинфламаторно деловање у различитим студијама. Овде по први пут извештавамо о антимеланогеној ефикасности Гомисина Н код сисара ћелије као и у ембрионима зебрице. Гомисин Н је значајно смањио садржај меланина без ћелијске токсичности. Иако није био способан да модулише каталитичку активност печуракатирозиназеин витро,Гомишин Нсмањио нивое експресије кључних протеина који функционишу умеланогенеза. Гомисин Н је смањио меланокортин 1 рецептор (МЦ1Р), аденилил циклазу 2, транскрипциони фактор повезан са микрофталмијом (МИТФ), тирозиназу,тирозиназе-повезан протеин-1(ТРП-1) и протеин повезан са тирозиназом-2 (ТРП-2). Поред тога, ћелије Мелан-А третиране Гомисином Н показале су повећане нивое п-Акт и п-ЕРК, што имплицира да активација ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путева може функционисати да инхибирамеланогенеза. Такође смо потврдили да је Гомисин смањио производњу меланина потискивањем експресије МИТФ,тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2у мишјим и људским ћелијама, као иу развоју ембриона зебрице. Колективно закључујемо даГомишин Нинхибира синтезу меланина потискивањем експресије МИТФ-а и меланогеницензима, вероватно кроз модулацију ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путева.

Кључне речи:Сцхисандра Цхиненсис;Гомишин Н; лигнан;меланогенеза; избељивање коже

цистанцхе имају функцију избељивања коже

1. Представљање

Меланин је пигмент који се налази у већини животињских органа укључујући кожу, косу, очи, унутрашње ухо, кости, срце и мозак [1,2].Меланогенезаје сложен процес у коме је укључено више сигналних путева. Рецептор меланокортина 1 (МЦ1Р) је кључни регулатор умеланогенеза, сигнализирајући преко својих лиганда као што су меланоцит-стимулирајући хормон (МСХ) и адренокортикотропни хормон (АЦТХ) [3]. Меланин коже се биосинтетише меланоцитима у епидермису, а затим се преноси у кератиноците, где играју важну улогу у заштити коже апсорбујући УВ зрачење сунчеве светлости и уклањајући реактивне слободне радикале [4,5]. Синтеза и трансфер меланина у кожи и фоликулима косе регулисани су доступношћу његових прекурсора [6]. Л-тирозин и Л-дихидроксифенилаланин (Л-ДОПА), главни супстрати меланогених ензима, такође функционишу као регулатори слични хормонима у меланогенези [7]. С друге стране, прекомерна производња меланина доводи до нежељених проблема са кожом као што су пеге и мелазма [8,9]. Меланогенеза може утицати на понашање нормалних и малигних меланоцита модулацијом еластичних својстава ћелија [10]. Иако рецептори за серотонин и мелатонин експримирани у ћелијама коже играју кључну улогу у одржавању ћелијске хомеостазе, прекомерна производња меланина неконтролисаним хормонским променама може изазвати патолошка стања на кожи [11].

Стога су уложени велики напори да се разјасне молекуларни механизми који контролишу меланогенезу као примарни корак у лечењу хиперпигментарних поремећаја коже. Поред тога, различите врстеизбељивање кожеагенси који инхибирају синтезу меланина су идентификовани из биљних и небиљних екстраката и комерцијално коришћени у козметици [12,13]. Најраспрострањенији агенси за избељивање укључују хидрохинон, мекинол, арбутин, којичну киселину, аскорбинску киселину и ретиноичну киселину [12,14]. Међутим, постоје различита ограничења њихове употребе у лечењу акутних или хроничних симптома хиперпигментације код људи. На пример, хидрохинон, иако се дуго користи за депигментацију од 1960-их, може изазвати иритацију коже и контактни дерматитис [15,16]. Такође доводи до оштећења ДНК повећањем производње реактивних врста кисеоника и развојем егзогене охронозе у ћелијама сисара [17,18]. Други познатитирозиназеинхибитори као што су Којићева киселина и аскорбинска киселина не само да имају лошу пенетрацију у кожу, стабилност и ефикасност избељивања, већ такође могу изазвати цитотоксичност, дерматитис и еритем дуготрајне употребе [19,20]. С тим у вези, постоји све већа потреба за развојем сигурнијих и ефикаснијих средстава за избељивање за лечење хиперпигментације људске коже. Природне биљке које се користе у традиционалној медицини могу пружити алтернативне изворе за идентификацију нових агенаса за избељивање који контролишу кључне коракемеланогенезаса мање или без нежељених ефеката [21].

Сцхисандра цхиненсис, такође позната као северна бобица финог укуса, природно се налази у североисточној Кини, далеком истоку Русије, Јапану и Кореји [22]. Ова биљка се дуго користила за лечење ноћног слепила, опекотина коже, асептичног запаљења и обољења јетре у традиционалној оријенталној медицини [23,24]. Показало се да екстракт воћа С. цхиненсис и његова једињења лигнана поседују различите фармаколошке ефекте на ћелијске линије миша. На пример, шизандра А и Ц имају антиоксидативне ефекте, док шизандра Б има антифибротично, антиинфламаторно, антиоксидативно и анти-апоптотично дејство [25]. Још једно једињење лигнанаГомишин Н(Слика 1А) је пријављено да супресира апоптозу изазвану оксидативним стресом инхибирањем ослобађања цитохрома Ц из митохондрија у цитоплазму, цепање каспазе 3 и ПАРП, и Ца2 плус-индуковану транзицију митохондријалне пермеабилности у Х9ц2 пацова кардиомиоцита [7,8]. Занимљиво је да је неколико студија које су користиле моделе миша и ћелијске линије људске коже открило терапеутски потенцијал С. цхиненсис за лечење кожних поремећаја. Лее ет ал. известили су да метанолни екстракт воћа С. цхиненсис ублажава симптоме контактног дерматитиса смањујући производњу проинфламаторних цитокина као што су ТНФ- и ИФН- када се примењују локално [8,24]. Канг ет ал. је показао да водени екстракт Сцхисандра Фруцтус инхибира активацију ИκБ, чиме потискује производњу ТНФ-, ИЛ-6 и ГМ-ЦСФ у линији хуманих мастоцита ХМЦ-1 [26]. Ови налази су нас навели да претпоставимо да би лигнани С. цхиненсис могли шире утицати на функције ћелија коже. У овој студији, покушали смо да истражимо претпостављене улогеГомишин Н, једно од главних једињења лигнана у С. Цхиненсис, у регулацијимеланогенеза, на тај начин процењујући његову потенцијалну употребу као акосмецеутског агенса. Ево, извештавамо о томеГомишин Нинхибира биосинтезу меланина без ћелијске токсичности у људским и мишјим ћелијама, као иу ембрионима зебрице.

2. Резултати

2.1. Ефекти Гомисина Н на формирање меланина и виталност ћелије

Да би се проверили ефекти Гомисина Н намеланогенеза, лечили смо мишје меланоците различитим концентрацијамаГомишин Нтоком 72 х, а затим процењене промене у садржају меланина. Третман Гомисином Н смањио је садржај меланина и у нормалној ћелијској линији меланоцита Мелан-А и у ћелијама меланома Б16Ф10 на начин зависан од дозе без ћелијске токсичности (Слика 1Б, Ц). Приметили смо да Гомисин Н инхибира -МСХ-индуковану производњу меланина у Б16Ф10 ћелијама, што је било упоредиво са резултатима добијеним ПТУ третманом [27] (Слика 1Ц). Да се ​​процени да ли је дошло до смањења меланинаГомишин Нтретман је због смањене активности тирозиназе, извршили смо тест бојења Л-ДОПА у нормалним ћелијама епидермалних меланоцита (НХЕМ) човека. Као што је приказано на слици 1Е, НХЕМ ћелије третиране Гомисином Н показале су смањене нивое Л-ДОПА у поређењу са нетретираним ћелијама. Међутим, инхибиторни ефекат Гомисина Н на производњу меланина није био значајан у ћелијама хуманог меланома МНТ-1 (Слика 1Д) .

2.2. Ефекти Гомисина Н на активност тирозиназе

Да испита да лиГомишин Нинхибиратирозиназеактивности ин витро, користили смо тирозиназу печурака и лизате ћелија меланома Б16. Коична киселина, добро познати инхибитор тирозиназе, коришћена је као позитивна контрола. Када је третиран тирозиназом печурака, док је којична киселина значајно смањила ензимску активност, Гомисин Н није изазвао никакву промену у конверзији Л-ДОПА у допахром (Слика 2А). Међутим, када је третиран Б16 ћелијама меланома, Гомисин Н је довео до смањења интирозиназеактивност ћелијског лизата на начин који зависи од дозе (Слика 2Б). Штавише, када се истовремено третира са -МСХ у Б16 ћелијама,Гомишин Нпреокренуо је повећање формирања допахрома стимулисано -МСХ (Слика 3Ц). Приметно је да је Гомисин Н био ефикаснији од Којичне киселине да инхибира ћелијуактивност тирозиназеБ16 ћелија на -МСХ стимуланс. Ови налази имплицирају да инхибиторни ефекат ГомисинН-а на производњу меланина уочен у ћелијама миша и људи (слика 1) није због његове функције да директно инхибира каталитичку активност тирозиназе. Међутим, још увек је могуће да Гомисин Н регулише експресију тирозиназе или других протеина који играју кључну улогу умеланогенеза.

2.3. Ефекти Гомисина Н на инактивацију МЦ1Р сигналног пута

Покушали смо да разјаснимо основни механизам одговоран за инхибиторни ефекат ГомисинН-а на производњу меланина. То смо закључилиГомишин Нможе регулисати сигналне протеине који су укључени умеланогенезаи тиме инхибирају синтезу меланина. Рецептор за меланокортин 1 (МЦ1Р) је амеланоцитни рецептор повезан са Г протеином који функционише као кључни регулатор у синтези меланина. Активација МЦ1Р његовим лигандом -МСХ или адренокортикотропним хормоном (АЦТХ) доводи до повећања аденил циклазе, која заузврат регулише интрацелуларне нивое цАМП [2,3]. Сходно томе, ниво транскрипције МИТФ-а се повећава путем пута Протеин киназе-Ц (ПКА)/реактивног елемента-везујућег протеина (ЦРЕБ) [2,28]. Да бисмо проценили регулаторни ефекат Гомисина Н на МЦ1Р сигнални пут, проверили смо нивое експресије МЦ1Р и његових низводних сигналних молекула након третмана ћелија Мелан-А са Гомисином Н. Приметили смо да Гомисин Н значајно смањује нивое протеина и МЦ1Р и аденилил циклазе 2 на начин који зависи од дозе (Слика 3А–Ц). Као што се очекивало,Гомишин Н-третиране ћелије су такође показале смањене нивое протеина МИТФ-а и његових познатих циљева тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 (Слика 3А, Д–Г). Ови налази сугеришу да Гомисин Н инхибира ензиме који производе смеланин инактивацијом МИТФ-а преко МЦ1Р сигналног пута.

2.4. Ефекти Гомисина Н на фосфорилацију Акт и ЕРК1/2 у ћелијама Мелан-А

Познато је да су ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путеви укључени у меланогенезу путем транскрипционе или пост-транскрипционе регулације МИТФ-а [29,30]. Да бисмо проценили да ли ГомисинН утиче на ове сигналне путеве, проценили смо статус фосфорилације Акт и ЕРК1/2 помоћу Вестерн блот анализе. Као што је приказано на слици 3Х–Ј, третман високом дозом (30 µМ) одГомишин Нзначајно побољшала фосфорилацију и Акт и ЕРК. Ови подаци указују да је инхибиторни ефекат Гомисина Н намеланогенезавероватно ће бити повезан са П13К/Акт и МАПК/ЕРК путевима.

2.5. Гомисин Н је инхибирао меланогенезу у ембрионима зебрице

Затим смо желели да испитамо да ли је Гомисин Н ефикасан у инхибицијимеланогенезаин виво. У том циљу, третирали смо ембрионе зебрице са Гомисином Н током 72 х у концентрацијама од 1, 10, 20 и 30 µМ, а затим измерили нивое експресије меланогених протеина. Приметили смо да третман Гомисином Н инхибира стварање меланина у развоју ембриона зебрице.Гомишин Н-третирани ембриони су показали смањење садржаја меланина на начин који зависи од концентрације у поређењу са нетретираном контролом (Слика 4). Такође смо открили да нивои протеинатирозиназе, МИТФ, ТРП-1 и ТРП-2 су смањени третманом Гомисином Н (Слика 5). Ови резултати показују да Гомисин Н инхибира меланогенезу ин виво регулацијом транскрипционог фактора МИТФ и његових циљеватирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2.

2.6. Гомисин Н је преокренуо меланогенезу изазвану рапамицином у људском МНТ-1

Иако је Гомисин Н значајно инхибираомеланогенезау ћелијама Мелан-А и Б16, као и ембрионима рибе инзебра, нисмо приметили његов ефекат на ћелије хуманог МНТ{2}} меланома. Очекивали смо да би ефекат Гомисина Н могао бити детектован у МНТ-1 ћелијама под условом да је меланогенеза регулисана одговарајућим стимулусом. Показало се да рапамицин индукује меланогенезу повећањем активности тирозиназе и нивоа протеина МИТФ, тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 [31], делимично кроз активацију аутофагије [32]. Пратили смо нивоетирозиназе, МИТФ,ТРП-1 и ТРП-2 у МНТ-1 ћелијама Вестерн блот анализом, након заједничког третмана са Гомисин Н андрапамицином. Третман рапамицином је значајно индуковао нивое МИТФ, ТРП-1 и ТРП-2, али није утицао натирозиназенивоа (слика 6). Међутим, третман Гомисином Н значајно је преокренуо ефекте рапамицина на МИТФ, ТРП-1 и ТРП-2 на начин који зависи од концентрације. Обрнути ефекат одГомишин Нпротив рапамицина је био обећавајући при концентрацији од 20 и 30 µМ него 10 µМ. Ови резултати сугеришу да Гомисин Н инхибирамеланогенезау ћелијама меланома МНТ-1 човека регулацијом транскрипционог фактора МИТФ и његових циљева ТРП-1 и ТРП-2.

3. Дискусија

Главна функција меланина је да штити ћелије коже од УВ зрачења [33–35]. Хиперпигментација, резултат прекомерне производње меланина у кожи, изазива нежељене козметичке проблеме и повезана је са дерматитисом и раком коже. Неколико извештаја сугерисало јемеланогенезакао важан циљ за лечење метастатског меланома [36,37]. Дакле, постоји све већа потреба за развојем антимеланогених агенаса који регулишу меланогенезу без ћелијске токсичности [38]. Постоји неколико путева укључених у меланогенезу коже [39,40]. Након везивања лиганда, МЦ1Р појачава активност аденилил циклазе, која потом повећава интрацелуларне нивое цАМП [41,42]. За цАМП зависну активацију ПКА/ЦРЕБ пута се често извештава да повећава нивое транскрипције МИТФ-а, чиме се повећава синтеза меланина [43]. МИТФ функционише као главни регулатор три главна меланогена ензима тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2код кичмењака [3,21,44]. Ови ензими су трансмембрански протеини који се налазе у меланосомалној мембрани меланоцита. Тирозиназа регулише корак који ограничава брзинумеланогенезапретварањем Л-тирозиназе у Л-ДОПА [23]. ТРП-1 и ТРП-2 такође играју важну улогу у синтези меланина, иако њихове функције нису у потпуности схваћене.

У овој студији, Гомисин Н, једињење лигнана С. цхиненсис, показало је депигментирајућу активност без ћелијске токсичности. Гомисин Н је инхибирао синтезу меланина у култивисаним ћелијским линијама сисара, као и у ембрионима зебрице. Чинило се да је Гомисин Н ефикаснији од ПТУ позитивне контроле који инхибира производњу меланина у ћелијама Мелан-А (Слика 1Б). Гомисин Н је смањио садржај меланина на начин који зависи од концентрације. У поређењу са нетретираном контролном групом, 10 µМ одГомишин Нсмањио садржај меланина за око 40 процената, без ћелијске токсичности. Анти-меланогена активност 10- µМ Гомисина Н била је упоредива са оном 100- µМ ПТУ у ћелијама Мелан-А. Слично томе, изгледало је да је Гомисин Потентнији од ПТУ у ћелијама Б16Ф10 активираним -МСХ, где су ефекти 5- и 10-µМ Гомисина Н били упоредиви са ефектима 10- и {{12 }}µМ ПТУ, респективно (Слика 1Ц). НХЕМ ћелије третиране Гомисином Н показале су смањене нивое Л-ДОПА, што сугерише да ГомисинН инхибиратирозиназеактивност у култивисаним ћелијама (слика 1Е). Ови налази су нас навели да даље истражимо основни механизам којим Гомисин Н инхибира меланогенезу.

Испитивали смо да лиГомишин Ндиректно модулира каталитичку активносттирозиназеин витро. За разлику од Којичне киселине, Гомисин Н није показао инхибиторне ефекте на активност тирозиназе печурака (Слика 2А). Међутим, активност ћелијске тирозиназе у лизатима ћелија меланома Б16 је значајно смањена помоћу Гомисина Н и са и без третмана -МСХ (Слика 2Б, Ц). Утврђено је да је инхибиција активности ћелијске тирозиназе Гомисина Н на -МСХ стимулус значајнија од оне позитивне контроле којичне киселине (Слика 2Ц).

Претпоставили смо да би се анти-меланогена функција Гомисина Н могла јавити кроз транскрипциону или пост-транскрипциону регулацију тирозиназе и протеина повезаних са тирозиназом (ТРП). количина и квалитет производње меланина у меланоцитима. Очекивано, приметили смо да Гомисин Н смањује нивое МЦ1Р и аденилил циклазе 2 у ћелијама Мелан-А (Слика 3А-Ц). У наставку,Гомишин Нсмањила експресију МИТФ-а и његових циљних протеина, укључујући тирозиназу, ТРП-1 и ТРП-2 (Слика 3А,Д–Г). Ови резултати сугеришу да су смањени нивои садржаја меланина након третмана Гомисином Н резултат деактивације МЦ1Р пута.

С друге стране, ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путеви могу фосфорилизовати МИТФ, и на тај начин могу пост-транскрипционо модулирати његову активност [45]. Међутим, укупан ефекат активације ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путева умеланогенезаје контроверзна. И ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путеви су конститутивно активирани у хуманим меланомима због акумулираних мутација [46]. Познато је да се депигментација посредована Ц2-церамидом у Мел-Аб ћелијама јавља смањењем нивоа п-Акт [47]. Постоји неколико природних једињења која активирају меланогенезу тако што регулишу нивое п-ЕРК у ћелијама меланома Б16 [28]. Насупрот томе, постоје и докази да повишени нивои п-ЕРК и п-Акт инхибирају синтезу меланина [28,48]. Сложеност инрегулације меланогенезе може се делимично објаснити чињеницом да фосфорилација појачава транскрипциону активност МИТФ-а, али истовремено индукује деградацију МИТФ-а зависну од убиквиције од протеосома [26,49–51]. Наши подаци су показали да су нивои п-Акт и п-ЕРК повећани у ћелијама Мелан-А третираним Гомисином Н (Слика 3Х-Ј). Ово имплицира да путеви ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК могу допринети инхибицији производње меланина.

Даље смо потврдили антимеланогену активност Гомисина Н у моделу зебрице ин виво. Ембриони зебрице третирани Гомисином Н су показали значајно смањење пигментације меланина (Слика 4). Поред тога, Гомисин Н је значајно смањио нивоетирозиназе, МИТФ, ТРП-1 и ТРП-2 у развоју ембриона зебрице. Ови налази заједно сугеришу даГомишин Ниндукује депигментацију смањењем експресије МИТФ-а и меланогених ензима ин виво. Анти-меланогена активност Гомисина Н је даље потврђена у МНТ-1 ћелијама хуманог меланома стимулисаним рапамицином. Иако је Гомисин Н довео до само малих промена у садржају меланина у МНТ-1 ћелијама (Слика 1Д), био је ефикасан да преокрене регулацију МИТФ, ТРП-1 и ТРП-2 изазвану рапамицином у начин који зависи од концентрације (Слика 6А, Ц–Е). Узети заједно, регулаторни ефекатГомишин Нна МИТФ и меланогеним ензимима је поновљиво пронађено у ћелијама миша и човека, као иу ембрионима зебрице.

Да резимирамо, овај рад сугерише да Гомисин Н може имати велики потенцијал као романизбељивање кожеагент. Чини се да Гомисин Н инхибирамеланогенезапотискивањем експресије МИТФ-а путем МЦ1Р пута, уместо директног модулисања каталитичке активноститирозиназеандТРПс. Иако још треба да се разјасне детаљни механизми, депигментација изазвана Гомисином Н вероватно ће бити повезана са активацијом ПИ3К/Акт и МАПК/ЕРК путева (Слика 7).

4. Материјали и методе

4.1. Материјали

РПМИ1640 је купљен од Гибцо-БРЛ (Гаитхерсбург, МД, САД). Дулбеков модификовани Еаглеов медијум (ДМЕМ), фетални говеђи серум (ФБС) и пеницилин-стрептомицин (ПС) су купљени од Хицлоне (Карлсбад, Калифорнија, САД). Медијум за раст меланоцита је набављен од ПромоЦелл-а (Хеиделберг, Немачка). Фенилметилсулфонил флуорид (ПМСФ), 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат(ТПА), Којична киселина, 1-фенил-2-тиоуреа (ПТУ), тирозиназа печурака, 3,{{ 9}}дихидрокси-л-фенилаланин(Л-ДОПА), -МСХ, диметил сулфоксид (ДМСО) и параформалдехид су купљени од СигмаЦхемицал Цо. (Ст. Лоуис, МО, САД).Гомишин Нкомплекс је обезбедио Цхул Иоунг Ким (Универзитет Хањанг, Ансан, Кореја). Рапамицин је купљен од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД).

4.2. Ћелијска култура

Ћелијска линија мишјег меланома Б16Ф10 је обезбеђена из Кореан Целл Лине Банк (Сеул, Кореја). Ћелије Мелан-А мишјих меланоцита [52] биле су великодушан поклон од др. Биеонг Гон Лее (Институт за истраживање коже, Аморе Пацифиц Цо., Ионгин -си, Кореја). Људске МНТ-1 ћелије меланома великодушно је обезбедио Аеиеонг Лее (Колаж медицине на Универзитету Донггук, Гоианг-си, Кореја). Примарни нормални хумани епидермални меланоцити (НХЕМ) купљени су од ПромоЦелл-а (Хеиделберг, Немачка). Мелан-А ћелије су узгајане у медијуму РПМИ 1640 (Гибцо, Царлсбад, Калифорнија, САД) са додатком 10 процената ФБС, 1 проценат ПС и 200 нМ ТПА. ДМЕМ допуњен са 10 процената ФБС и 1 проценат ПС коришћен је за одржавање ћелија Мелан-А и НХЕМ ћелија. Све ћелије су инкубиране на 37 ◦Ц у инкубатору са 5% ЦО2.

4.3. Мерење садржаја меланина

Мелан-А ћелије су засејане у 24- плочу са бунарчићима (1 × 105 ћелија/бунарићу), третиране саГомишин Н, а затим инкубирано 72 х. После 72 х, садржај меланина је мерен као што је претходно описано [53]. Укратко, након уклањања медијума за културу, ћелије су испране три пута са ПБС. Након тога, раствор натријум хидроксида (1 мЛ, 1 Н) је додат у сваки бунар да би се растворио меланин. Апсорбанца на 405 нм је мерена коришћењем читача микроплоче. Овај тест је поновљен са Б16Ф10 ћелијама (2 × 104 ћелије/бунарићу) и МНТ-1 ћелијама по истом методу.

4.4. Вестерн блот анализа

Мелан-А ћелије су засејане у посуде од 100 мм (1 × 106 ћелија/посуда) и третиране са 1, 5 или 10 µМГомишин Нтри дана на 37 ◦Ц. Ћелије су испране са ПБС, а затим сакупљене помоћу стругача. Одвојене ћелије су стављене у 1 мл ПБС и центрифугиране на 7500 рпм током 5 мин. Након уклањања горњег раствора, ћелијске пелете су лизиране пуфером за лизу (50 мМ Трис-ХЦл, пХ 8.0, 0,1 проценат СДС, 150 мМ НаЦл, 1 проценат НП-40, 0,02 процента натријум азида, 0,5 процената натријум деоксихолата, 100 µг/мЛ ПМСФ, 1 г/мЛ апротинина) током 24 х на 4 ◦Ц. Укупни протеини су екстраховани коришћењем ултрацентрифуге на 12,000 о/мин током 30 минута на 4◦Ц. Садржај протеина је мерен коришћењем Брадфордовог теста. Протеини (30 µг) су одвојени коришћењем 10% гела за електрофорезу натријум додецил сулфат-полиакриламидног гела (СДС-ПАГЕ) и пребачени на анитроцелулозну мембрану. Мембрана је блокирана 1 х са 5% обраног млека у Трис-пуферисаном физиолошком раствору са Твеен-20 (ТБСТ), а затим инкубирана 12 х на 4 ◦Ц са примарним антителима усмереним на -тубулин (Санта Круз, Калифорнија, САД ), МИТФ (ћелијска сигнализација, Данверс, МА, САД), тирозиназа (ћелијска сигнализација), ЕРК (ћелијска сигнализација), фосфо-ЕРК (ћелијска сигнализација), АКТ (ћелијска сигнализација), фосфо-АКТ (ћелијска сигнализација), МЦ1Р ( Санта Цруз), аденилил циклазе 2 (Санта Круз), ТРП-1 (Санта Круз) и ТРП-2 (Санта Круз). Након уклањања примарних антитела, мембране су испране три пута са ТБСТ и инкубиране са секундарним антитела (зечји анти-козји ИгГ-ХРП; мишји анти-зечји ХРП, Санта Цруз) током 1 х. Мембране су третиране реагенсом за појачану хемилуминисценцију коришћењем система за снимање ЦхемиДоц КСРС плус (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД). Дензитометријска анализа трака је извршена коришћењем софтвера Имаге МастерТМ 2Д Елите (верзија 3.1, ГЕ Хеалтхцаре, Цхицаго, ИЛ, УСА).

4.5. Тест активности тирозиназе

Да се ​​процени инхибиторни ефекат Гомисина Н на гљиветирозиназеактивност, тирозиназа је инкубирана са 1, 5 или 10 µМГомишин Нили позитивна контрола Којића киселина. Сваки узорак је растворен у метанолу. Л-ДОПА (8,3 мМ) и тирозиназа печурака (125 У) су разблажене у 80 мМ фосфатног пуфера (пХ 6,8). 40 µЛ сваког узорка и 120 µЛ Л-ДОПА су помешани у 96-плочи са бунарима, након чега је додато 40 µЛ разблажене тирозиназе печурака. Плоче су затим инкубиране 15 минута, а апсорбанца је мерена на 490 нм помоћу читача микроплоче.

тирозиназаактивност у лизатима ћелија меланома Б16 мерена је са или без третмана -МСХ, као што су претходно описали Охгуцхи ет ал. [54], уз незнатне измене. Ћелијски лизат је припремљен како је горе описано у делу Вестерн блот анализе. Укупни протеини у супернатанту су мерени Брадфордовим тестом коришћењем говеђег серумског албумина као стандарда [55]. Једнака количина протеина је разблажена и коришћена за тест активности тирозиназе.

инхибирају активност тирозиназе

4.6. Л-ДОПА бојење у НХЕМ ћелијама

НХЕМ ћелије су засејане у {{0}} плочу и инкубиране 72 х са Гомисином Н. Ћелије су фиксиране са 4 процента параформалдехида током 40 мин, након чега је уследио третман са 0,1 процентом Тритон Кс{ {6}} током 2 мин. Л-ДОПА (0,1 проценат) је додат у сваки бунар, након чега је уследила инкубација од 2 х. Након уклањања раствора, ћелије су два пута испране са ПБС. Слике су фотографисане микроскопом.

4.7. Зебрафисх Екпериментс

Ембриони зебрице су добијени из Банке ресурса Зебрафисх (Даегу, Кореја). Ембриони су третирани Гомисином Н током 72 х. Депигментирајући ефекатГомишин Нна ембрионима зебрице посматрано је под стереомикроскопом. За Вестерн блот анализу, ембриони третирани Гомисином Н су лизирани коришћењем пуфера за лизу, из којег су припремљени укупни протеини као што је горе поменуто.

5. Закључци

Наш резултат подржава став да Гомисин Н има висок потенцијал за употребу као функционална храна иизбељивање кожеагент.Гомишин Нје једно од главних једињења лигнана у С. Цхиненсис. У чињеницама. Цхиненсис је биљни лек који се користи за лечење многих људских болести. Међутим, неопходне су даље епидемиолошке студије да би се доказала безбедност Гомисина Н на кожи. Сходно томе, ин виво студије и клиничка испитивања ће моћи јасније да покажу ефикасност ГомисинН-а. У закључку, ова студија сугерише даГомишин Нможе бити потенцијално хипо-пигментно средство и природноизбељивање кожекандидат за козметичку индустрију.

цистанцхе побољшати избељивање

Референце

1. Алалуф, С.; Аткинс, Д.; Барретт, К.; Блоунт, М.; Цартер, Н.; Хеатх, А. Утицај епидермалног меланина на објективна мерења боје људске коже. Пигмент Целл Рес. 2002, 15, 119–126. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Д'Мело, СА; Финлаи, ГЈ; Багулеи, БЦ; Аскариан-Амири, МЕ Сигнални путеви у меланогенези. Инт. Ј.Мол. Сци. 2016, 17, 1144. [ЦроссРеф] [ПубМед]

3. Сломински, А.; Тобин, ДЈ; Схибахара, С.; Вортсман, Ј. Пигментација меланина у кожи сисара и њена хормонска регулација. Пхисиол. Рев. 2004, 84, 1155–1228. [ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Херрлинг, Т.; Јунг, К.; Фуцхс, Ј. Улога меланина као заштитника од слободних радикала у кожи и његова улога као индикатора слободних радикала у коси. Спецтроцхим Ацта А Мол. Биомол. Спецтросц. 2008, 69, 1429–1435. [ЦроссРеф] [ПубМед]

5. Брозина, АА; Јозвицки, В.; Росзковски, К.; Филипиак, Ј.; Сломински, АТ Садржај меланина у меланомаметастазама утиче на исход радиотерапије. Онцотаргет 2016, 7, 17844–17853. [ЦроссРеф] [ПубМед]

6. Сломински, А.; Вортсман, Ј.; Плонка, ПМ; Сцхаллреутер, КУ; Паус, Р.; Тобин, ДЈ Пигментација фоликула косе.Ј. Инвестиг. Дерматол. 2005, 124, 13–21. [ЦроссРеф] [ПубМед]

7. Сломински, А.; мр Змијевски; Павелек, Ј. Л-тирозин и Л-дихидроксифенилаланин као хормонски слични регулатори функција меланоцита. Пигмент Целл Меланома Рес. 2012, 25, 14–27. [ЦроссРеф] [ПубМед]

8. Лее, АИ Недавни напредак у патогенези мелазме. Пигмент Целл Меланома Рес. 2015, 28, 648–660. [ЦроссРеф][ПубМед]9. Спеецкаерт, Р.; ван Геле, М.; Спеецкаерт, ММ; Ламберт, Ј.; ван Геел, Н. Биологија хиперпигментационих синдрома. Пигмент Целл Меланома Рес. 2014, 27, 512–524. [ЦроссРеф] [ПубМед]

10. Сломински, РМ; мр Змијевски; Сломински, АТ Улога пигмента меланина у меланому. Екп. Дерматол.2015, 24, 258–259. [ЦроссРеф] [ПубМед]11. Сломински, А.; Вортсман, Ј.; Тобин, ДЈ Кожни серотонинергички/мелатонинергички систем: Осигуравање места под сунцем. ФАСЕБ Ј. 2005, 19, 176–194. [ЦроссРеф] [ПубМед]

12. Саркар, Р.; Арора, П.; Гарг, КВ Цосмецеутицалс за хиперпигментацију: шта је доступно? Ј. ЦутанеоусАестхет. Сург. 2013, 6, 4–11. [ЦроссРеф] [ПубМед]

13. Мијамура, И.; Цоелхо, СГ; Волбер, Р.; Миллер, СА; Вакаматсу, К.; Змудзка, БЗ; Ито, С.; Смуда, Ц.; Пассерон, Т.; Цхои, В.; ет ал. Регулација пигментације људске коже и реакције на ултраљубичасто зрачење.Пигмент Целл Рес. 2007, 20, 2–13. [ЦроссРеф] [ПубМед]

14. Давис, ЕЦ; Цаллендер, ВД Постинфламаторна хиперпигментација: Преглед епидемиологије, клиничких карактеристика и опција лечења у боји коже. Ј. Цлин. Аестет. Дерматол. 2010, 3, 20–31. [ПубМед]

15. Салес-Цампос, Х.; Соуза, ПР; Пегхини, БЦ; да Силва, ЈС; Цардосо, ЦР Преглед модулаторних ефеката олеинске киселине на здравље и болест. Мини. Рев. Мед. Цхем. 2013, 13, 201–210. [ЦроссРеф] [ПубМед]

16. Парвез, С.; Канг, М.; Цхунг, ХС; Цхо, Ц.; Хонг, МЦ; Схин, МК; Бае, Х. Преглед и механизам деловања средстава за депигментацију и осветљавање коже. Пхитотхер. Рес. 2006, 20, 921–934. [ЦроссРеф] [ПубМед]

17. Луо, Л.; Јианг, Л.; Генг, Ц.; Цао, Ј.; Зхонг, Л. Генотоксичност изазвана хидрохиноном и оксидативно оштећење ДНК у ХепГ2 ћелијама. Цхем. Биол. Интеракција. 2008, 173, 1–8. [ЦроссРеф] [ПубМед]

18. Енгуита, ФЈ; Леитао, АЛ Хидрохинон: Загађење животне средине, токсичност и микробиолошки одговори. БиоМед Рес. Инт. 2013, 2013, 542168. [ЦроссРеф] [ПубМед]

19. Драелос, ЗД Препарати за осветљавање коже и контроверза хидрохинона. Дерматол. Тхер. 2007, 20,308–313. [ЦроссРеф] [ПубМед]

20. Коо, ЈХ; Лее, И.; Иун, СК; Ким, ХУ; Парк, БиХ; Парк, ЈВ Сапонификовано уље ноћурка смањује меланогенезу у ћелијама меланома Б16 и смањује пигментацију коже изазвану УВ зрачењем код људи. Липиди 2010, 45, 401–407. [ЦроссРеф] [ПубМед]

21. Цорделл, ГА; Цолвард, МД Природни производи и традиционална медицина: Укључивање парадигме. Ј. Нат. Прод.2012, 75, 514–525. [ЦроссРеф] [ПубМед]

22. Паноссиан, А.; Викман, Г. Пхармацологи оф Сцхисандра Цхиненсис Баил: Преглед руских истраживања и употребе у медицини. Ј. Етхнопхармацол. 2008, 118, 183–212. [ЦроссРеф] [ПубМед]

23. Цхен, П.; Панг, С.; Ианг, Н.; Менг, Х.; Лиу, Ј.; Зхоу, Н.; Зханг, М.; Ксу, З.; Гао, В.; Цхен, Б.; ет ал. Благотворни ефекти Сцхисандрина Б на срчану функцију у мишјем моделу инфаркта миокарда. ПЛоС ОНЕ 2013, 8,е79418. [ЦроссРеф] [ПубМед]

24. Лее, ХЈ; Јо, С.; Риу, Ј.; Јеонг, ХС; Лее, Г.; Риу, МХ; Јунг, МХ; Ким, Х.; Ким, БЈ Ефекти СцхисандраЦхиненсис Турцз. воће на контактни дерматитис изазван динитрофлуоробензеном код мишева. Мол. Мед. Извештај 2015,12, 2135–2139. [ЦроссРеф] [ПубМед]

25. Цхун, ЈН; Цхо, М.; Па сам.; Јеон, ЈХ Заштитни ефекти екстракта воћа Сцхисандра Цхиненсис и његових лигнана против кардиоваскуларних болести: Преглед молекуларних механизама. Фитотерапиа 2014, 97, 224–233.[ЦроссРеф] [ПубМед]

26. Канг, ОХ; Цхае, ХС; Цхои, ЈХ; Цхои, ХЈ; Парк, ПС; Цхо, СХ; Лее, ГХ; Дакле, ХИ; Цхоо, ИК; Квеон, ОХ; ет ал. Ефекти воденог екстракта Сцхисандра Фруцтус на ослобађање цитокина из линије хуманих маст ћелија. Ј. Мед. Храна 2006, 9, 480–486. [ЦроссРеф] [ПубМед]

27. Пома, А.; Бианцхини, С.; Миранда, М. Инхибиција производње микронуклеуса изазване Л-тирозином фенилтиоуреом у ћелијама хуманог меланома. Мутат. Рес. 1999, 446, 143–148. [ЦроссРеф]

28. Ким, ХЈ; Ким, ИС; Донг, И.; Лее, ИС; Ким, ЈС; Ким, ЈС; Воо, ЈТ; Цха, БИ Ефекат цирсимаритина који индукује меланогенезу кроз повећање транскрипционог фактора повезаног са микрофталмијом и експресије тирозиназе. Инт. Ј. Мол. Сци. 2015, 16, 8772–8788. [ЦроссРеф] [ПубМед]

29. Бусца, Р.; Аббе, П.; Мантоук, Ф.; Абердам, Е.; Пеиссоннаук, Ц.; Еицхене, А.; Ортонне, ЈП; Баллотти, Р. Расмедијира цАМП зависну активацију киназа регулисаних екстрацелуларним сигналом (ЕРКс) у меланоцитима.ЕМБО Ј. 2000, 19, 2900–2910. [ЦроссРеф] [ПубМед]

30. Бусца, Р.; Баллотти, Р. Цицлиц АМП је кључни гласник у регулацији пигментације коже. Пигмент Целл Рес.2000, 13, 60–69. [ЦроссРеф] [ПубМед]

31. Хах, ИС; Цхо, ХИ; Лим, ТИ; Парк, ДХ; Ким, ХМ; Иоон, Ј.; Ким, ЈГ; Ким, ЦИ; Иоон, ТЈ Индукција меланогенезе рапамицином у ћелијама хуманог МНТ{1}} меланома. Анн. Дерматол. 2012, 24, 151–157. [ЦроссРеф][ПубМед]

32. Иун, ВЈ; Ким, ЕИ; Парк, ЈЕ; Јо, СИ; Банг, СХ; Цханг, ЕЈ; Цханг, СЕ Ланац протеина 3 повезан са микротубулама је укључен у меланогенезу путем регулације експресије МИТФ у меланоцитима. Сци. Репорт.2016, 6, 19914. [ЦроссРеф] [ПубМед]

33. Спритз, РА; Слух, ВЈ, Јр. Генетски поремећаји пигментације. Адв. Зујати. Генет. 1994, 22, 1–45. [ПубМед]

34. Кадекаро, АЛ; Цхен, Ј.; Ианг, Ј.; Цхен, С.; Јамесон, Ј.; Свопе, ВБ; Цхенг, Т.; Кадакиа, М.; Абдел-Малек, З. -меланоцит-стимулирајући хормон потискује оксидативни стрес преко ап53-посредованог сигналног пута у људским меланоцитима. Мол. Цанцер Рес. 2012, 10, 778–786. [ЦроссРеф] [ПубМед]

35. Васмеиер, Ц.; Хуме, АН; Боласцо, Г.; Сеабра, МЦ Меланозоми на први поглед. Ј. Целл Сци. 2008, 121,3995–3999. [ЦроссРеф] [ПубМед]

37. Брозина, АА; Јозвицки, В.; Царлсон, ЈА; Сломински, АТ Меланогенеза утиче на укупно преживљавање и преживљавање без болести код пацијената са меланомом ИИИ и ИВ стадијума. Зујати. Патхол. 2013, 44, 2071–2074. [ЦроссРеф] [ПубМед]

37. Сломински, А.; Ким, ТК; Брозина, АА; Јањетовић, З.; Броокс, ДЛ; Сцхваб, ЛП; Скобовиат, Ц.; Јозвицки, В.; Сеагровес, ТН Улога меланогенезе у регулацији понашања меланома: Меланогенеза доводи до стимулације експресије ХИФ-1 и пратећих путева зависних од ХИФ. Арцх. Биоцхем. Биопхис. 2014, 563,79–93. [ЦроссРеф] [ПубМед]

38. Ким, ХЈ; Лее, ЈХ; Схин, МК; Хиун Леем, К.; Ким, ИЈ; Лее, МХ Инхибиторни ефекат меланогенезе екстракта Гастродиа елата у ћелијама меланома ХМ3КО. Ј. Цосмет. Сци. 2013, 64, 89–98. [ПубМед]

39. Хемесатх, ТЈ; Прице, ЕР; Такемото, Ц.; Бадалиан, Т.; Фисхер, ДЕ МАП киназа повезује фактор транскрипцијеМикрофталмију са ц-Кит сигнализацијом у меланоцитима. Природа 1998, 391, 298–301. [ПубМед]

40. Прице, ЕР; Динг, ХФ; Бадалиан, Т.; Бхаттацхариа, С.; Такемото, Ц.; Иао, ТП; Хемесатх, ТЈ; Фисхер, ДЕЛинеаге-специфична сигнализација у меланоцитима. Ц-кит стимулација регрутује п300/ЦБП за микрофталмију.Ј. Биол. Цхем. 1998, 273, 17983–17986. [ЦроссРеф] [ПубМед]

41. Бертолотто, Ц.; Аббе, П.; Хемесатх, ТЈ; Билле, К.; Фисхер, ДЕ; Ортонне, ЈП; Баллотти, Р. Мицропхтхалмиагене продуцт ас а сигнал трансдуцер ин цАМП-индуцед диференциатион оф меланоцитес. Ј. Целл Биол. 1998, 142,827–835. [ЦроссРеф] [ПубМед]

42. Погенберг, В.; Огмундсдоттир, МХ; Бергстеинсдоттир, К.; Сцхепски, А.; Пхунг, Б.; Деинеко, В.; Милевски, М.; Стеингримссон, Е.; Вилманнс, М. Ограничена димеризација леуцинског затварача и специфичност ДНК препознавања главног регулатора меланоцита МИТФ. Генес Дев. 2012, 26, 2647–2658. [ЦроссРеф] [ПубМед]

43. Флахерти, КТ; Ходи, ФС; Фисхер, ДЕ Од гена до лекова: Циљане стратегије за меланом. Нат. Рев. Цанцер2012, 12, 349–361. [ЦроссРеф] [ПубМед]

44. Лее, ТХ; Сео, ЈО; Баек, СХ; Ким, СИ Инхибицијски ефекти ресвератрола на синтезу меланина у пигментацији изазваној ултраљубичастим Б у кожи заморца. Биомол. Тхер. 2014, 22, 35–40. [ЦроссРеф] [ПубМед]

45. Су, ТР; Лин, ЈЈ; Тсаи, ЦЦ; Хуанг, ТК; Ианг, ЗИ; Ву, МО; Зхенг, ИК; Су, ЦЦ; Ву, ИЈ Инхибиција меланогенезе галном киселином: Могућа укљученост ПИ3К/Акт, МЕК/ЕРК и Внт/ -цатенин сигналних путева у Б16Ф10 ћелијама. Инт. Ј. Мол. Сци. 2013, 14, 20443–20458. [ЦроссРеф] [ПубМед]

46. ​​Иајима, И.; Кумасака, МИ; Тханг, НД; Гото, И.; Такеда, К.; Иамасхита, О.; Иида, М.; Охгами, Н.; Тамура, Х.; Кавамото, И.; ет ал. РАС/РАФ/МЕК/ЕРК и ПИ3К/ПТЕН/АКТ сигнализација у напредовању и терапији малигног меланома. Дерматол. Рес. Працт. 2012, 2012, 354191. [ЦроссРеф] [ПубМед]

47. Ким, ДС; Ким, СИ; Моон, СЈ; Цхунг, ЈХ; Ким, КХ; Цхо, КХ; Парк, КЦ церамид инхибира пролиферацију ћелија кроз инактивацију АКТ/ПКБ и смањује синтезу меланина у Мел-Аб ћелијама.Пигмент Целл Рес. 2001, 14, 110–115. [ЦроссРеф] [ПубМед]

48. Ким, ЈХ; Баек, СХ; Ким, ДХ; Цхои, ТИ; Иоон, ТЈ; Хванг, ЈС; Ким, МР; Квон, ХЈ; Лее, ЦХ. Смањење регулације синтезе меланина поседовањем А и њена примена на ин виво модел муње. Ј.Инвестиг. Дерматол. 2008, 128, 1227–1235. [ЦроссРеф] [ПубМед]

49. Хартман, МЛ; Цзиз, М. МИТФ у меланому: Механизми иза његове експресије и активности. Целл Мол.Лифе Сци. 2015, 72, 1249–1260. [ЦроссРеф] [ПубМед]

50. Ким, ДС; Хванг, ЕС; Лее, ЈЕ; Ким, СИ; Квон, СБ; Парк, КЦ Сфингозин-1-фосфат смањује синтезу меланина кроз континуирану активацију ЕРК и накнадну деградацију МИТФ. Ј. Целл Сци. 2003, 116, 1699–1706. [ЦроссРеф] [ПубМед]

51. Ксу, В.; Гонг, Л.; Хаддад, ММ; Бисцхоф, О.; Цамписи, Ј.; Иех, ЕТ; Медрано, ЕЕ Регулација нивоа протеина МИТФ фактора транскрипције повезаног са микрофталмијом асоцијацијом са ензимом који коњугира убиквитин хУБЦ9. Екп. Целл Рес. 2000, 255, 135–143. [ЦроссРеф] [ПубМед]

52. Беннетт, ДЦ; Цоопер, ПЈ; Харт, ИР Линија нетумогених мишјих меланоцита, сингених са меланомом Б16 и која захтева промотор тумора за раст. Инт. Ј. Цанцер 1987, 39, 414–418. [ЦроссРеф][ПубМед]

53. Меира, ВВ; Хеинрицх, ТА; Цадена, СМ; Мартинез, ГР Меланогенеза инхибира дисање у ћелијама меланома Б16-Ф10, док повећава садржај митохондријалних ћелија. Екп. Целл Рес. 2017, 350, 62–72. [ЦроссРеф][ПубМед]

54. Охгуцхи, К.; Танака, Т.; Илииа, И.; Ито, Т.; Иинума, М.; Матсумото, К.; Акао, И.; Нозава, И. Гнетол као моћни инхибитор тирозиназе из рода Гнетум. Биосци. Биотецхнол. Биоцхем. 2003, 67, 663–665. [ЦроссРеф] [ПубМед]

55. Уцхида, Р.; Исхикава, С.; Томода, Х. Инхибиција активности тирозиназе и пигментације меланина помоћу2-хидрокситирозола. Ацта Пхарм. Синица Б 2014, 4, 141–145. [ЦроссРеф] [ПубМед]