Садржај фенолних једињења и генетски диверзитет на нивоу популације широм природног подручја распрострањености медвеђе бобице (Арцтостапхилос Ува-урси, Ерицацеае) на Иберијском полуострву

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Апстрактан:Медведка бобица (Арцтостапхилос ува-урси) је лековита биљка која се традиционално користи за лечење инфекција уринарног тракта због високог садржајаарбутин(хидрокинон -Д-глукозид), који се сада углавном користи као природни агенс за избељивање коже у козметици. Медведка бобица је такође предложена као природнаантиоксидансадитива због високог садржаја фенолних једињења у листовима. Проучавали смо варијацију фенолних једињења у 42 дивље популације медвеђе бобице, са циљем да разјаснимо да ли унутрашњи биолошки, климатски и/или географски фактори утичу на садржај фенола у његовој природној дистрибуцији на Иберијском полуострву. Листови медвјеђе бобице сакупљени су током јесени током трогодишњег периода (2014–2016) у популацијама на различитим ширинама и висинским градијентом. Екстракти метанолице су показали широк спектар варијација у садржају укупних фенола, и различите профиле фенола у погледуарбутин(нивои овог главног састојка варирали су од 87 до 232 мг/г др вт), али и садржаја катехина и мирицетина, на које су утицали географски и климатски фактори. Међу популацијама су такође откривени умерени нивои варијације величине генома—процењене проточном цитометријом—и на два региона пластидне ДНК. Генетска и цитогенетска диференцијација популација била је слаба, али значајно повезана са фитокемијском разноврсношћу. Елитни генотипови медвјеђег бобица са вишимантиоксидансcapacity were subsequently identified.

Кључне речи: арбутин; генетска и фитокемијска варијабилност; величина генома; хаплотипови;природниантиоксиданси

цистанцхе су природни антиоксиданси

1. Представљање

Синтеза биљних специјализованих метаболита варира у времену (тј. онтогенези, фенологији и индукованим одбрамбеним снагама) и простору, јер игра кључну улогу у адаптацији биљака на услове животне средине, док генетске варијације утичу на хемодиверзитет [1]. Међу овим једињењима, феноли имају разноврстан низ моно- и полимерних структура које испуњавају широк спектар физиолошких улога [2]. На биосинтезу специјализованих метаболита у великој мери утичу фактори средине као што су температура, падавине или сунчево зрачење, који су заузврат често изложени ширинским, уздужним или висинским градијентима. Конкретно, акумулација фенолних једињења је општи одговор на повећане нивое УВ-Б (280–315 нм) зрачења. Пријављене су специфичне варијације једињења у биљкама које расту у медитеранском региону током лета и на великим надморским висинама, где се јавља већа инциденца УВ-Б, а циметне киселине и флавоноиди показују највећу стопу УВ апсорпције [3].

Арбутин(хидрокинон -Д-глукозид) је једноставно једињење фенола са ограниченом појавом у листовима неких врста које припадају родовима као што су Арбутус, Арцтостапхилос, Пирус или Вацциниум. Главни природни извор арбутина, медвеђа бобица (Арцтостапхилос ува-урси ( Л.) Спренг.) се вековима користи за лечење инфекција уринарног тракта и других бубрежних обољења [4], а биљне формулације се припремају и данас [5]. Током последњих година, спектар примене одарбутинсе проширио, углавном као природно средство за избељивање коже у козметичкој индустрији [6] и у клиничким терапијама због свогантиоксиданс, антибиотска, антиинфламаторна и антитуморска својства [7]. Сходно томе, постоји све већи интерес за проналажење додатних природних извораарбутин, као и биотехнолошки процеси који могу заменити хемијску синтезу [8,9]. У том контексту, ин витро производња арбутина коришћењем култура ћелија Датура инокиа достигла је пилот скалу [10].

Додатноарбутин, друга фенолна једињења доприносе активним својствима А. ува-урси, као што су флавоноиди и танини [11,12], од којих су катехин и корилагин најрелевантнији додаци, респективно [13]. У прехрамбеној индустрији природна једињења као биљни феноли замењују синтетичкеантиоксидансконзерванси [14]. А. ува-урси је коришћен као адитив, посебно у месним производима [15–19] али иу активном паковању [20]. Коначно, недавно је предложен потенцијал А. ува-урси као извора штављења за индустрију коже [21].

Монографија „лист медвјеђег бобица” Европске агенције за лекове [5] предложила је најмање 7 одстоарбутинсадржај у осушеном лишћу као захтев за биљне препарате. Студије спроведене током последњих деценија описале су садржај арбутина у листовима медвјеђег бобица који варира од 0 процената до 18 процената, објашњено аналитичким процедурама, природном варијабилности, условима раста и датумом бербе [4]. Садржај арбутина се обично одређује течном хроматографијом високих перформанси [4,12,22–24], а претходне студије су откриле вишеарбутинсадржаји у биљкама медвека сакупљених у јесен него у онима сакупљеним у пролеће [4]. Описани су различити хемотипови медвеке, повезани са географском дистрибуцијом и интраспецифичном диференцијацијом у подврстама А. ува-урси. Најупечатљивија пријављена фитокемијска варијација је одсуство арбутина у А. ува-урси субсп. стипитата Пацкер и Денфорд, али су наведене и разлике у садржају метил-арбутина, елагичне киселине или мирицетина. Кверцетин је такође присутан у листовима медвјеђе бобице, у којима су оба агликона, као и њихови 3-О-гликозиди, најчешће пронађени флавоноиди [4]. Међутим, већина ових истраживања спроведена је пре неколико деценија, а данас се сматра да су интраспецифичне варијације у медвеђим плодовима континуиране. Описаних 14 подврста, укључујући једну из Шпаније (А. ува-урси субсп. црассифолиус (Браун-Бланк.) Ривас Март. ек Торре, Алцараз и МБ Цреспо), тренутно су неприхваћена имена и синоним за А. ува-урси [ 25]. Због тога су потребна нова истраживања како бисмо побољшали наше знање о једињењима која су стварно присутна у сировини која је сакупљена са различитих локација у индустријске сврхе, пошто је описано да хемијски профил листова А. ува-урси укључује разноврстан низ фенола, танина, и флавоноиди у новијим студијама спроведеним да би се истражиле разлике на интерспецифичном нивоу [23,26,27].

Генетска (укључујући цитогенетску) разноврсност на нивоу популације промовише прилагођавање различитим условима животне средине [28]. Недавно су размотрени ефекти полиплоидизације на производњу специјализованих метаболита у лековитим и ароматичним биљкама [29]. У овом контексту, величина генома је у великој мери коришћен параметар у проценама варијабилности биљака, пошто се интраспецифичне варијације често детектују ([30] и референце у њима), у корелацији са многим другим биолошким особинама и игра релевантну улогу у еволуционим процесима [31–35 ]. Међутим, студије које се баве повезаностом количине нуклеарне ДНК (тј. величине генома) и фитокемијске разноврсности су веома ретке [36,37]. Однос између фитокемијске и генетске разноврсности је процењен коришћењем нуклеарних, али посебно пластидних ДНК маркера [38], посебно у лековитим [39] и култивисаним [40] биљним врстама.

Медведка бобица је широко распрострањена у циркумбореалном подручју, али већина сакупљених дивљих популација у Европи се налази у источним земљама, Аустрији, Швајцарској, Италији и Шпанији. Арцтостапхилос ува-урси расте у источном средњем делу Шпаније, у планинама, у надморске висине од 550 до 2350 м надморске висине. Чешће је на северу јер су популације које се налазе на нижим географским ширинама ређе и обично имају мање јединки. Постојеће студије о варијабилности садржаја арбутина у Шпанији су се односиле на вредности које се крећу од 8 процената у североисточним популацијама [41] и 19 процената у шпанском биљном материјалу процењене у студији спроведеној у Немачкој [42]. Наша студија има за циљ да разјасни факторе, укључујући величину генома и генетску разноликост, објашњавајући фитокемијске варијације у природној дистрибуцији медвјеђег бобица у Шпанији. Наши резултати би могли да допринесу избору биљног материјала за фармацеутску, козметичку и прехрамбену индустрију.

храна за избељивање коже: ЦИСАТНЦХЕ

2. Резултати и дискусија

2.1. Анализа хемијског диверзитета

Листови медвјеђе бобице узорковани са укупно 249 биљака које расту на 42 шпанске локације, и током трогодишњег периода, 2014–2016 (Слика 1, Табела С1), показали су различите проценте суве тежине (др вт), у распону од 46,7 (ЛО) до 55,1 процената (ЦП), са просеком од 50,1 ± 2,7 процената (подаци нису приказани). Екстракти метанолице припремљени из узорака прикупљених 2014. и 2015. године коришћени су за одређивање садржаја укупних фенола и арбутина. Приметили смо широк спектар континуираних варијација за оба параметра са значајним разликама (п < 0,001)="" међу="" биљкама.="" екстракти="" листова="" 80="" биљака="" узоркованих="" у="" јесен="" 2014.="" (слика="" 2а)="" показали="" су="" укупан="" садржај="" фенола="" у="" распону="" од="" 103,3="" ±="" 4,8="" мг="" гае/г="" др="" вт="" (узорак="" ли-4)="" до="" 206,4="" ±="" 6,5="" мг="" гае/г="" др="" вт="" (ср="" -2),="">арбутинсадржај је флуктуирао од 92.0 ± 3.0 мг/г др вт (АН-6) до 194,2 ± 5,6 мг/г др вт (СЕ-8). Анализа екстраката припремљених од листова сакупљених у 2015 од 94 биљке (слика 2б) такође је показала широку фитокемијску варијацију, од 110,5 ± 3,6 мг ГАЕ/г др вт(ПИ-4) до 200,9 ± 9,8 мг ГАЕ/г др вт (ЛО-4) у укупном садржају фенола, док се садржај арбутина кретао између 87,1 ± 0,4 мг/г др вт (ЕТ-2) и 211,5 ± 5,9 мг/г др вт (ЛИ -2). Штавише, без обзира на годину сакупљања, значајне разлике у укупним фенолима иарбутинсадржај је откривен међу биљкама медвјеђег бобица које расту на истој локацији за већину популација (подаци нису приказани). Нивои арбутина су у значајној корелацији са укупним садржајем фенола у екстрактима листова медвјетке јер смо процијенили значајне Пирсонове коефицијенте од {{0}} .332 (п=0.003) за 2014. и 0.289 за податке из 2015. (п=0.005). Садржај арбутина у 48 биљака узоркованих у обе године није значајно варирао (п=0.380).

Упркос варијабилности уоченој унутар популација, и без обзира на годину жетве, анализа варијансе је показала да садржај арбутина у екстрактима листова медвјеђе бобице такође зависи (п < {{0}}.00="" 1)="" на="" локацији="" популације="" (слика="" 3а,б),="" као="" што="" се="" десило="" за="" укупан="" садржај="" фенола="" у="" листовима="" медвјеђег="" бобица="" анализиран="" у="" 2015="" (п="">< 0.001,="" слика="" 3б).="" насупрот="" томе,="" значајне="" разлике="" у="" садржају="" укупних="" фенола="" нису="" уочене="" (п="0.080)" међу="" 10="" популација="" узоркованих="" 2014.="" године,="" које="" су="" се="" налазиле="" на="" релативно="" малом="" подручју,="" али="" распоређене="" у="" широком="" распону="" надморске="" висине,="" од="" 424="" (ба="" популација)="" до="" 1410="" м="" нм="" (популација="" па).="" ова="" варијација="" у="" надморској="" висини="" је="" повезана="" са="" разликама="" у="" климатским="" условима="" (табела="" с1),="" пошто="" су="" локације="" на="" већим="" надморским="" висинама="" карактерисале="" ниже="" средње="" температуре="" (пеарсонов="" коефицијент="" корелације,="" р="-0,666," п="">< 0,001)="" и="" веће="" годишње="" падавине="" (="" р="0.485," п="">< 0,001),="" што="" је="" заузврат="" довело="" до="" нижих="" глобалних="" нивоа="" радијације="" (р="-0,390," п="">< 0,001).="" штавише,="" из="" овог="" скупа="" података="" је="" процењена="" ниска,="" али="" значајна="" позитивна="" корелација="" између="" годишњих="" падавина="" и="" укупног="" садржаја="" фенола="" у="" биљкама="" медвјеђег="" бобица="" (спеарманов="" коефицијент="" рхо="0.256," п="0.022)," док="" из="" скупа="" података="" из="" 2015.="" када="" смо="" узорковали="" популације="" на="" већем="" подручју,="" открили="" смо="" значајну="" позитивну="" корелацију="" између="" годишњих="" падавина="" и="" садржаја="" арбутина="" (рхо="0.246," п="0.017)." ова="" значајна="" корелација="" указује="" да="" су="" биљке="" медвјеђег="" бобица="" које="" расту="" на="" сјеверним="" локацијама="" и="" на="" релативно="" већим="" надморским="" висинама="" показале="" често="">арбутинсадржај (рхо=0.217, п=0.035 и рхо=0.269, п=0.009, респективно). Као што је поменуто, ови виши садржаји арбутина су у значајној корелацији са вишим садржајем укупних фенола у листовима медвјеђе бобице, који су били слични (у просеку 154,4 ± 19,6 мг ГАЕ/г др вт) онима пронађеним у воденим екстрактима других биљних врста коришћених каоантиоксидансадитиви у прехрамбеној индустрији [43], као што су рузмарин (185.0 мг ГАЕ/г др. вт), чај (149,3 мг ГАЕ/г др вт) или гуава (154,4 мг ГАЕ/г др вт). Ови резултати су у складу са претходним референцама и потврђени су у студији коју су спровели Врона ет ал. [20] користећи неке од узорака листова шпанске медвјеђе бобице прикупљене 2015. године, за које је вишеантиоксиданскапацитет је био повезан са вишимарбутинсадржаја. Елитни генотипови медвјеђег бобица се такође могу идентификовати за ову сврху, као што су јединке 1, 4, 7 и 8 из ЛО популације, које су акумулирале у просеку 183,3 ± 16,4 мг ГАЕ/г др вт током две године истраживања.

Да бисмо додатно разјаснили климатске и географске факторе који утичу на обрасце фенолваријације, извршили смо исцрпније прикупљање узорака у јесен 2016:140 биљака медвјеђег бобица које су расле на 29 локација, и квантификовали смо пет фенолних једињења (Слика С1а) који су идентификовани ко-елуирањем са стандардима у градијенту ацетонитрил/вода (Слика С1б). Анализа је показала широк распон континуираних варијација за садржај арбутина, кафеинске киселине, катехина, мирицетина и кверцетин глукозида, са значајним разликама међу биљкама које су такође генерално примећене унутар популација (подаци нису приказани). За главне фенолне састојке, открили смо да се садржај арбутина кретао од 91,1 ± 5.0 (ЛБ{{10}}) до 232,4 ± 2,8 мг/г тежине (ПТ{{15 }}), док се садржај катехина кретао од 4,1 ± 0,1 (АФ{{20}}) до 45,5 ± 1,4 мг/г др вт (ЛБ-5). Што се тиче друга два утврђена флавоноида, мирицетин није детектован у неким биљкама из неколико популација, док је достигао 21,2 ± 1,2 мг/г др. вт у ПО{{30}}, а кверцетин глукозид је варирао од 3,8 ± 0,1 (ЦО -3) до 22,8 ± 0,8 мг/г тежине (БТ-3). Нижи садржаји кафеинске киселине утврђени су у екстрактима листова медвјеђе бобице, који су варирали од 1,8 ± 0,0 (ИЗ-1) до 7,1 ± 0,3 мг биљке/г др вт (СИ-4).

Упркос варијацијама уоченим међу појединцима, значајне разлике међу популацијама су такође процењене за ових пет једињења (Крускал-Волисов тест, п < {{0}}.001="" и="" п="0." 009="" садржај="" форкафеинске="" киселине).="" већи="" садржаји="" арбутина="" су="" у="" просеку="" утврђени="" у="" биљкама="" из="" природних="" популација="" аб,гу,="" лн="" и="" ло="" (слика="" 4а),="" које="" су="" се="" значајно="" разликовале="" (након="" корекције="" бонфероника)="" од="" ниских="" садржаја="" пронађених="" у="" биљкама="" из="" популације="" лб="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,169,5="" ±="" 10,0="" и="" 169,2="" ±="" 5,2="" мг/г="" др.="" вт="" напред="" до="" 111,8="" ±="" 16,0="" мг/г="" др="" вт,="" респективно).="">арбутинсадржај биљака које су такође узорковане у 2015 није значајно варирао између година (п=0.821). Популација ЛБ је заузврат показала виши средњи ниво катехина (Слика 4б), који се значајно разликовао од ниског средњег садржаја овог флавоноида откривеног у популацијама АФ и ЛЦ (32,8 ± 9,8 фронта до 5,7 ± 1,9 и 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 мг/г др вт, респективно). Средњи садржај глукозида мирицетина и кверцетина је приказан на слици 4ц, са значајним разликама међу популацијама АБ, ЦГ, ЛБ и ПО, са већим садржајем мирицетина (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 .7 ± 2.8, односно 17.2 ± 3.9 мг/г др вт, у поређењу са ниским нивоима који су акумулирани на просечним биљкама из популација ЦО и ОД (1.2 ± 1.5 и 2.4 ± 3.6 мг/г др вт, респективно) , а такође значи и садржај кверцетин глукозида одређен у популацијама АА, БТ, ЦП, ИЗ и ЛБ (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 и 13,1 ± 4,6 т, значајно се разликују у односу на др. од оног у популацији ЦО (4.0 ± 0,1 мг/г др вт). Насупрот томе, средњи садржај кофеинске киселине осцилирао је од 2,1 ± 0,2 мг/г др вт у популацијама АБ, ЦЕ, ПТ и СА, до 3,5 ± 1,2 мг/г др вт у популацији АФ или 3,4 ± 2,2 мг/г др вт у становништво СИ; према томе, значајне разлике нису примећене због варијације унутар популације (просечан садржај 2,7 ± 0,8 мг/г др вт). Ови резултати допуњују варијацију фенолних метаболита коју су приметили Врона ет ал. [20], за осам локација медвјеђег бобица узоркованих 2015. године које су анализиране коришћењем УПЛЦ®-ЕСИ-К-ТОФ са МСЕ технологијом.

За разлику од резултата добијених у анализи спроведеној на узорцима медвјеђег воћа из 2014. и 2015. године,арбутинсадржаји утврђени у 2{{10}}16 узорака показали су ниску, али значајну позитивну корелацију са зрачењем (рхо=0.256, п=0.002), и максималне средње температуре (рхо{ {5}}.183, п=0.030), и стога су били у обрнутој корелацији са годишњим вредностима падавина (рхо=−0.265, п=0.002). Ове разлике су такође биле повезане са варијацијама у надморској висини (рхо=−0,192, п=0,023), али је ова негативна корелација објашњена поменутим нискимарбутинсадржај биљака из популације ЛБ које се налазе на 1720м. Сличан образац варијације примећен је за садржај мирицетина пошто су виши нивои овог једињења били значајно повезани са биљкама медвјеђег бобица које расту на локацијама под вишим нивоима зрачења (рхо=0.226, п=0.{{1{{ 12}}}07). За катехин је уочен супротан образац од арбутина, пошто је процењена позитивна корелација између овог флавоноида и годишњих падавина (рхо=0.398,п < 0.0{{23="" }}1),="" а="" негативне="" корелације="" су="" сходно="" томе="" детектоване="" са="" зрачењем="" и="" са="" максималном="" средњом="" температуром="" (рхо="−0.307," п="">< 0.001="" и="" рхо="−0.470," п="">< 0.001,="" редом).="" ова="" варијација="" у="" климатским="" факторима="" објаснила="" је="" да="" су="" и="" надморска="" висина="" и="" географска="" ширина="" утицале="" на="" садржај="" катехина="" у="" листовима="" медвјеђе="" бобице="" (рхо="0.410" и="" 0.490,="" респективно,="" п="">< 0.001).="" анализа="" главних="" компоненти="" обављена="" са="" фитокемијским,="" климатским="" и="" географским="" подацима="" који="" одговарају="" 29="" локација="" узоркованих="" 2016.="" године,="" у="" којој="" су="" две="" прве="" компоненте="" објасниле="" 60="" процената="" уочених="" варијација,="" потврдила="" је="" ове="" резултате="" (слика="" 5).="" нисмо="" открили="" никакву="" значајну="" корелацију="" између="" садржаја="" кофеинске="" киселине="" или="" кверцетин="" глукозида="" у="" биљкама="" медвјеђег="" бобица="" и="" климатских="" или="" географских="" фактора,="" иако="" смо="" проценили="" благе,="" али="" значајне="" корелације="" између="" садржаја="" мирицетина="" и="" кверцетин="" глукозида="" (рхо="0.184," п="" {{31}="" }.030)и="" између="" садржаја="" мирицетина="" и="" кафеинске="" киселине="" (рхо="−0.176," п="0.037)" биљака="" медвјеђег="">

Уочени контрастни климатски обрасци варирања уарбутинСадржај биљака медвјеђе бобице сугерише да, иако је биосинтеза овог метаболита вероватно повећана у условима веће радијације и температуре, вероватно је недостатак воде ограничавајући фактор за А. ува-урси у Медитерану и јужним регионима. Дел Валле и др. [44] је известио о географској ширини акумулације флавоноида Силене литтореа (Цариопхиллацеае) у Шпанији, где је већи садржај флавоноида утврђен у јужним популацијама, пошто је географска ширина негативно корелирала са УВ-Б зрачењем и температуром, а позитивна са падавинама. Глобално зрачење показује јасан градијент ширине са већом инциденцом на југу и истоку Иберијског полуострва, а постоји и значајан орографски ефекат пошто постојаност облака модулира инциденцу овог зрачења на већим висинама. Мапа УВ зрачења Шпаније [45] наведена висока корелација (р > 0.9) између УВ-Б и података о глобалном зрачењу. Према овој референци, популације медвједића које су показале већи просјекарбутинсадржаји у нашој студији углавном се налазе у подручјима под нивоима УВ-Б зрачења од 2403–2451 Ј/м2.

Наши резултати за варијацију катехина у медвјеђим бобицама показали су географски образац (Слика 5) и слажу се са студијама спроведеним на другим биљним врстама из северних земаља Европе. Већи садржаји специјализованих метаболита, као што су флавоноиди и антоцијанини, забележени су у биљкама које расту на вишим географским ширинама, вероватно због дужих дневних периода и нижих ноћних температура [46]. Због тога се садржај растворљивих фенола у иглицама Јуниперус цоммунис повећавао са географском ширином и висином у популацијама Финске [47], а такође је пронађен 10–19 процената већи садржај фенола на вишој географској ширини у плодовима три врсте Рибес спп. сорте анализиране на две финске локације [48]. Ови аутори повезују нижи садржај фенола са вишим нивоима зрачења и температуре. Садржај флавоноида у плодовима две врсте Вацциниум (такође из породице Ерицацеае) показао је географски градијент, са већим количинама оффлавоноида у северним географским ширинама [49,50].

У односу на висинске варијације, виши нивои флавоноида су утврђени у популацијама других врста Ерицацеае, Цаллуна вулгарис, које расту на већим надморским висинама [51]. Висински градијенти су такође утицали на специјализовани метаболизам шпанских популација Арница монтана [52] и Куерцус робур [53]. Потоњи рад је указао на значајну позитивну повезаност између концентрације укупних фенола у лишћу и надморске висине, будући да градијент зависи само од флавоноида, што сугерише да ови једињења су изазвала однос за укупне феноле. Ови резултати се слажу са нашим проценама за образац садржаја катехина. Коначно, градијент падавина је био повезан са значајним разликама у саставу полифенола у афричком лековитом жбуњу (Миротхамнус флабеллифолиа) за које су метаболомске разлике биле у складу са генетском структуром популација [54].

ЦИСТАНЦХЕ МОЖЕ ПРОТИВ СТАРЕЊА

2.2. Анализа података о величини и секвенци генома

Вредности величине генома 2Ц биљака медвјеђе бобице кретале су се од 2,50 до 3,15 пг (Табела 1). Мале разлике у количини нуклеарне ДНК пронађене су међу популацијама (Крускал–Волис χ2=87.639, дф=36,п=3.39 × 10−6). Дун-ов тест са Бонферонијевом корекцијом открио је статистички значајне разлике између: АЛ и СИ популације (З=−3,972, п=0.024), ЛЕ и СИ (З=−4,196, п {{ 21}}.009), и СЕ и СИ (З=−4.236, п=0.008). Популација Понтилса (ПО) је типски локалитет А. ува-урси вар.црассифолиус, који је накнадно комбинован као А. ува-урси субсп. црассифолиус, и тренутно се не разматра таксономски (видети увод), има средњу вредност (2,88 пг), унутар опсега вредности добијених у другим популацијама врсте. Ово је прва опсежна популациона студија количине нуклеарне ДНК у врсти и читавом роду пошто једине доступне информације до данас потичу од једне балканске популације истог таксона [55]. Тамо пријављена 2Ц вредност, 2,49 пг, налази се на доњој граници опсега варијације овде истраживаног скупа података. Није пронађена корелација између вредности величине генома и надморске висине популације. Количина ДНК појединаца је показала слабу позитивну значајну корелацију саарбутинсадржај када су упоређени подаци за 158 биљака медвјеђе бобице (рхо=0.187, п=0.018), док није пронађена друга значајна корелација између величине геномезе и других варијабли. Овај резултат је у сагласности са пријављеним повећањем производње специјализованих метаболита који се генерално примећују у лековитим и ароматичним биљкама након полиплоидизације [29].

Новопроизведене секвенце за рпл{{0}}трнЛ и псбЕ-петН интергенске размакнице су поређане у две матрице (односно које садрже 566 и 874 бп) које су спојене у једну матрицу од 1440 бп. Умерено откривени су нивои варијације у овим пластидним регионима (шест нуклеотидних супституција и четири индела). Пронађено је десет различитих хаплотипова са укупном разноврсношћу хаплотипова (Хд) од 0.468 (Табела 1). Већина популација (21) је садржала само један хаплотип, док је пет њих испољило одређену разноликост међу појединцима. Најзаступљенији хаплотип 1 показао је највећу учесталост (71,4 одсто), затим хаплотип 2 (15,2 одсто), док су остали показали много ниже фреквенције (0,04–0,01 одсто). Географска дистрибуција хаплотипова приказана је на Слици 6. Хаплотип 1 је пронађен у 32 популације — фиксиран је у њих 18 — распоређених у свим узоркованим регионима осим у најјужнијим локалитетима. Хаплотип 2 је пронађен у десет популација и био је искључиви хаплотип у две најјужније популације (ХУ и ЛВ), као и у ПР. Хаплотип 4 је био приватан из три популације са Пиринеја, док се хаплотип 8 појавио у две популације са источног Иберијског полуострва. Што се тиче еволуционих односа приказаних у мрежи штедљивости (Слика 6), већина хаплотипова је повезана једним или два корака мутације. Хаплотип 1 заузима централну позицију, са седам хаплотипова повезаних са њим.

Мантелов тест између пДНК генетичке и хемијске матрице парних удаљености показао је слабу, али значајну корелацију (р=0.301; п=0.048) између генетске диференцијације и концентрације пет хемијских компоненти измерених за Скуп података за 2016. Мантелов тест није открио никакву значајну корелацију између генетске и географске удаљености између 25 популација узоркованих 2016. (р=0.103, п=0.207) или између хемијске и географске удаљености у паровима између ових 25 популација (р=0.191, п=0.050). Фитокемијска варијабилност која је овде пријављена за дивље популације медвеђе бобице широм Шпаније је стога допуњена умереним нивоима варијације хаплотипа пДНК, што је генетска диференцијација север-југ пронађена у популацијама медвеђег бобица упоредива са филогеографским обрасцима пронађеним у другим биљкама (нпр. [56–58). Сва ова хомогеност се очекује код биљака са ниским репродуктивним капацитетом [59], као што је А. ува-урси, која показује слабу клијавост и високу стопу морталитета младих садница [4].Ипак, скромна генетска диференцијација коју показује пДНК корелира са биохемијском раздаљине у паровима процењене на основу профила пет фенолних Слика 6. Географска дистрибуција пДНК хаплотипова у иберијским популацијама Арцтостапхилос ува-урси. Популациони кодови одговарају онима у Табели С1, а кружни графикони представљају проценат појединаца који показују сваки хаплотип у свакој популацији. правоугаоник, статистичка мрежа штедљивости која показује еволуционе односе те Заступљени су н пластидни хаплотипови пронађени у популацији А. ува-урси. Свака пруга дуж линија које повезују хаплотипове указује на један корак мутације у пДНК регионима секвенцираним у овој студији. Мантелов тест између пДНК генетичке и хемијске матрице удаљености у пару показао је слабу, али значајну корелацију (р=0.301; п {{28 }}.048) између генетске диференцијације и концентрације пет хемијских компоненти измерених за скуп података из 2016. године. Мантелов тест није открио никакву значајну корелацију између генетске и географске удаљености између 25 популација узоркованих 2016. (р=0.103, п=0.207) или између хемијске и географске удаљености између ових 25 популација ( р=0.191, п=0.050). Фитокемијска варијабилност која је овде пријављена за популације дивљих медвеђих бобица широм Шпаније је стога допуњена умереним нивоима варијације хаплотипа пДНК, што је генетска диференцијација север-југ пронађена у популацијама медвеђих бобица упоредива са филогеографским обрасцима пронађеним у другим биљкама (нпр. [56–58]. Сва ова хомогеност очекује се засада са ниским репродуктивним капацитетом [59], као што је А. ува-урси, која показује слабу клијавост и високу стопу морталитета младих садница [4].Ипак, скромна генетска диференцијација коју показује пДНК корелира са биохемијским растојањима парова процењеним из профила Овај образац генетске и фитокемијске варијације (који, као што је поменуто, није био повезан са географским растојањима), као и слаба, али значајна корелација између величине геномезе и садржаја арбутина, може указивати да природна геномска варијабилност утиче на принос фенолних једињења у А. ува-урси Међутим, хиперваријабилни молекуларни м аркери у опсежнијем узорковању популације су неопходни да би се потврдили ови филогеографски обрасци и повезаност између генетске и биохемијске варијабилности.

ЦИСТАНЦХЕ ИМА АНТИ-ОКСИДАЦИЈСКИ ЕФЕКТ

3. Материјали и методе

3.1. Садни материјал

За фитохемијску анализу узорковано је укупно 249 биљака медвјеђег бобица које расту у 42 популације у јесен 2014, 2015. и 2016. године, што је репрезентативно за природну распрострањеност ове биљне врсте на Иберијском полуострву (Слика 1 и Табела С1). Прво, у јесен 2014. сакупили смо терминалне изданке са 80 биљака у десет шпанских популација (АГ, АН, БА, ЛИ, ЛО, ПЕ, ПА, СР, СЦ и СЕ) које се налазе на релативно малом подручју (приближно 80 × 50 км) у северној Шпанији, али у широком распону надморске висине (424–1410 мнв). Друго, у јесен 2015. сакупили смо 48 биљака из шест од ових популација (АГ, ЛИ, ЛО, ПА, СЕ и СР) и 46 биљака медвјеђег бобица из шест популација које се налазе на нижим географским ширинама (АЛ, ЦХ, ЕТ, ХУ, ЛВ и ПИ). За сваку популацију узорковали смо осам биљака удаљених најмање 5 м, осим у ХУ, где смо пронашли само шест јединки. Треће, у јесен 2016. узорковано је укупно 140 биљака на 29 различитих локација (1–6 појединаца са сваке) ​​укључујући 26 нових шпанских локалитета (ИЗ, ЦЕ, БТ, МО, АА, ГУ, СИ, АФ, СА, ПТ, АБ, ЦГ, ОД, ПС, ЛБ, ЦО, ЛЕ, МА, ЦП, ПО, МЗ, АВ, ЛЦ, АИ, ЛН и ЗУ). Наше узорковање обухвата распон надморске висине од 534 до 1750 м. Свеукупно, 42 популације представљају широк спектар климатских услова (Табела С1): максимална средња температура је показала 2-струку варијацију (13–26 ◦Ц) и годишња количина падавина је осцилирала од 399 (ЗУ) до 1589 мм (ПТ). Глобално зрачење се кретало од 4,2 до 5,1 кВх/м2д. Сакупљено је шест до десет завршних изданака (дужине 15–20 цм) за сваку биљку да би се добило 6–15 г здравих листова, који су потом изрезани и осушени на 60 ◦Ц до константне тежине (3–4 дана). Након одређивања суве тежине, листови су ручно хомогенизовани у малтеру и чувани на 4 ◦Ц до анализе. Овај биљни материјал је коришћен за одређивање укупних фенола и ХПЛЦ.

Материјал листа за проточну цитометрију добијен је од свежих листова 178 јединки које припадају укупно 37 популација (Табела 1). Узорци су добијени из 33 горе поменуте популације и из четири нове популације (БЕ, ЈО, и ПР у Шпанији и ЕН у Андори) где су листови сакупљени у пролеће 2017. и стога нису укључени у фитохемијску анализу (Слика 1 и Табела С1). Измерено је од једне до шест јединки по популацији. Материјали листова за екстракцију ДНК су сушени у силика гелу и чувани на собној температури. Анализе диверзитета ДНК урађене су на укупно 105 биљака са 35 локација (Табела 1).

Биљни ваучери 46 проучаваних популација медвјеђег бобица депоновани су у хербаријуму БЦ, Института за ботанику Барселоне, у хербаријуму БЦН, Центра за документацију биодиверзитета Вегетал, Университат де Барцелона или у хербаријуму ЈАЦА Института Пиренаицо де Ецо ( ЦСИЦ).

3.2. Припрема екстракта листова и одређивање укупних фенола

Припремљена су три реплика екстракта листова медвеђе бобице коришћењем 50 мг осушеног узорка и 10 мЛ 80 процената метанола. Епрувете су инкубиране 30 мин у ултразвучном купатилу, а затим су екстракти филтрирани (0,45 мм) и чувани на 4 ◦Ц до анализе. Укупни садржај фенола је одређен у екстрактима припремљеним од узорака прикупљених 2014. и 2015. године. Пратили смо Фолин-Циоцалтеуметход [60,61] са малим модификацијама: на 0,1 мЛ екстракта, 0,4 мЛ метанола (80 процената), 0,5 мЛ Фолин-а Додат је Циоцалтеу реагенс и 8 мЛ ултра чисте воде. После 5 минута у ултразвучној кади, додат је 1 мЛ На2ЦО3 20 процената (в/в). Узорци су остављени у мраку 30 минута пре мерења апсорбанције на 760 нм помоћу УВ-видљивог спектрофотометра (ЦАРИ 50 БИО, Вариан, АгилентТецхнологиес). Резултати су изражени у еквивалентима галне киселине (ГАЕ); односно мг галне киселине/г др вт, користећи стандардну криву галне киселине (40–340 µг/г).

3.3. Одређивање арбутина и других фенолних метаболита

Фенолни садржај метанолних екстраката листова медвјеђе бобице квантификован је помоћу РП-ХПЛЦ помоћу ХПЛЦ-УВ/Вис система (ЛаЦхром Мерцк Хитацхи Л-7400) са Кинетек 5 µм-ЕВО Ц18 (250 мм × 4,6 мм ) колона и апсорбанца одређена на 280 нм. Екстракти из узорака прикупљених 2014. и 2015. су разблажени 1:10 (в/в) и убризгани су мобилном фазом метанола и ацетонитрила. Програм градијента се састојао од 0–5 мин, 25 процената метанола; 5–6 мин, 100 посто; 6–10 мин, 100 процената; и 10–20 мин, поново 25 процената метанола. Брзина протока је била 1 мЛ/мин, а запремина ињекције је била 20 µЛ. У овим условима, време задржавања одарбутинбио 2,6 мин, што нам је омогућило да одредимо концентрацију овог једињења коришћењем калибрационе криве успостављене са 6 разблажења стандарда, од 40 до 340 µг/г, са коефицијентом корелације р=0. 9997. Екстракти из узорака прикупљених 2016. године анализирани су употребом мобилне фазе метанола и воде са следећим градијентским програмом: 0–5 мин, 10 процената метанола; 5–6 мин, 20 процената; 6–10 мин, 20 процената; 10–11 мин, 30 процената; 11–15 мин, 30 процената; 15–16 мин, 40 процената; 16–20 мин, 40 процената; 20–21 мин, 50 процената; 21–25 мин, 50 процената; 25–26 мин, 60 процената; 26–30 мин, 60 процената; 30–31 мин, 10 процената; и 31-36 мин, поново 10 процената метанола. У овим условима смо утврдилиарбутин идруга 4 фенолна једињења: кафеинска киселина, катехин, мирицетин и кверцетин-3-О-глукопиранозид користећи одговарајуће калибрационе криве утврђене са 5 разблажења стандарда (25–500 µг/мЛ) ,који је показао коефицијенте корелације од {{10}}.9992 за катехин (време задржавања 12.0 мин), 0,9924 за кафеинску киселину (време задржавања 13,4 мин), 0,9981 за кверцетин{16} }О-глукозид (време задржавања 23,4 мин), и 0,9997 за мирицетин (време задржавања 25,1 мин).

Метанол и ацетонитрил су били ХПЛЦ квалитета и купљени од Панреац-а (Барселона, Шпанија). Стандарди (чистоћа већа или једнака 98 процената)арбутин, кафеинска киселина и гална киселина, као и Фолин-Циоцалтеу реагенс купљени су од Сигма-Алдрицх (Барселона, Шпанија). Катехин и кверцетин-3-О-глукопиранозид стандарди су набављени од Ектрасинтхесе (Генаи Цедек, Француска), док је мирицетин купљен од Алфа Аесар (Карлсрухе, Немачка).

Резултати хемијских одређивања анализирани су коришћењем софтвера СПСС в. 25 и Р 3.5.2. Након тестирања података на нормалност и хомоскедастичност, извршили смо анализу варијансе различитих скупова података и тестова раздвајања средстава (Тукеи и Тамхане) или непараметарских тестова као Крускал-Валлис и Дунн тест вишеструког поређења са Бонферонијевом корекцијом. Такође смо проценили коефицијенте корелације (Пеарсон или Спеарман у зависности од тога да ли су подаци пратили нормалну дистрибуцију) између варијабли, укључујући величину генома.

ЦИСТАНЦХЕ ИМА АНТИ-ОКСИДАЦИЈСКИ ЕФЕКТ

3.4. Процене величине генома и секвенцирање ДНК

Величина генома биљака медвјеђег бобица процењена је проточном цитометријом у Центрима Циентифицси Тецнологицс, Университат де Барцелона (ЦЦиТУБ) према процедурама објашњеним у Пеллицер ет ал. [62].Петуниа хибрида Вилм. 'ПкПц6' (2Ц=2.85 пг) је коришћен као интерни стандард. Семе стандарда је обезбедио Платеформе де цитометрие д'Имагерие-Гиф, ЦНРС—И2БЦ (Гиф-сур-Иветте, Француска). Садржај нуклеарне ДНК (2Ц) је израчунат множењем познатог садржаја ДНК у стандарду са количником између позиције пикова (мод) циљне врсте и стандарда у хистограму интензитета флуоресценције, уз претпоставку линеарне корелације између флуоресцентних сигнала из обојених језгара непознатог узорка, познатог интерног стандарда и количине ДНК [63].

Приближно 20 мг лисног ткива осушеног силицијумом коришћено је за екстракцију ДНК коришћењем ЦТАБ протокола [64] са мањим модификацијама. Квалитет укупне ДНК проверен је спектрофотометром НаноДроп 1000 (ТхермоСциентифиц, Вилмингтон, ДЕ, УСА). Интергени региони пластида рпл32-трнЛанд псбЕ-петН, као и регион нуклеарне рибозомалне ДНК ИТС, су амплификовани и секвенционирани за три јединке по популацији. Секвенце ИТС-а нису представљале варијабилност унутар 105 анализираних појединаца, изузев неколико позиција које показују интрагеномске нуклеотидне полиморфизме. Стога је овај нуклеарни рибозомални ДНК регион искључен из даље анализе. Други региони пластидне ДНК (тј. ндхФ; ндхФ-рпл32; псбА-трнХ; псбД-трнТ; рпс16; и трнЛ-трнФ) су такође тестирани, али су одбачени због мале варијабилности или проблема са секвенцирањем. Поступак амплификације је изведен како је описано у Виталес ет ал. [65]. Директно секвенцирање амплификованих сегмената ДНК је изведено помоћу Биг Дие Терминатор Цицле Секуенцинг в 3.1 (ПЕ Биосистемс, Фостер Цити, Калифорнија, САД) у Унитатде Геномица, ЦЦиТУБ, на АБИ ПРИСМ 3700 ДНК анализатору (ПЕ Биосистемс). Секвенце рпл32-трнЛ и псбЕ-петН састављене су помоћу БиоЕдит верзије 7.1.3.0 [66], усклађене са ЦлусталВ МултиплеАлигнмент в1.4 [67] и ручно подешене. Приступни бројеви ГенБанк-а дати су у табели С2.

3.5. Величина генома и генетска анализа

Урађен је непараметарски Крускал-Волисов тест да би се провериле статистички значајне разлике у вредностима 2Ц међу популацијама. Дунн тестови вишеструког поређења су такође спроведени да би се утврдило које популације су показале значајне разлике између њих. Бонферонијева корекција је примењена да би се минимизирала грешка типа И (лажно позитивна).

Параметри генетског диверзитета (полиморфна места, информативна места о штедљивости, број хаплотипова и укупна разноврсност хаплотипова) процењени су коришћењем ДнаСП в6 [68]. Пластидни хаплотипови су одређени у комбинованом скупу података који је укључивао и рпл32-трнЛ и псбЕ-петН регионе. Индели су кодификовани са ФастГап в.1.2 [69] и третирани као догађаји са једном мутацијом. Еволуциони односи међу хаплотиповима су закључени на основу мреже штедње конструисане коришћењем ТЦС-а [70] како је имплементирано у ПопАрт-у [71]. Максималан број разлика које су резултат појединачних замена међу хаплотиповима израчунат је са 95 процената граница поверења.

Да би се анализирао однос између генетских и хемијских података, извршен је Мантел тест. Прво, процијенили смо фенотипску удаљеност између 25 популација користећи податке из биљака медвјеђег бобица прикупљене 2016. године, који су мјерени за пет фенолних компоненти (тј.арбутин, катехин, кафеинска киселина, кверцетин и мирицетин). Користили смо Р Цоммандер за стандардизацију ових података [72], а затим и за израчунавање хемијске удаљености изведене из стандардизоване матрице са функцијом „Дист“ на Р на основу Еуклидских растојања. Друго, матрица генетичке парне удаљености Неи популације израчуната је између 25 популација користећи ДнаСП в6. Коначно, израчунали смо географске удаљености у пару међу овим популацијама користећи пакет „геодист“ у Р. Парне корелације између матрица удаљености су израчунате коришћењем Мантеловог теста са 10,000 пермутација са функцијом мантел која је доступна у Р пакету „веган“ [ 73].

4. Закључци

Показале су се све анализиране биљке медвјеткеарбутинсадржај већи од 7 процената; стога је овај биљни материјал погодан за биљне препарате. Наша анализа је открила већи садржај арбутина од оних (до 9 процената) које наводе Парејо ет ал. [40], који је анализирао четири популације лоциране у североисточним Пиринејима на 1580–2030 м и открио ниске разлике у садржају арбутина међу популацијама. Штавише, већина овде утврђених вредности је у опсегу биљног материјала одабраног за култивацију у Пољској [74] иу складу са високимарбутинсадржај узорака листова шпанске медвјеђе бобице који су пријавили Сонненсцхеин и Тегтмеиер [42] приликом одабира биљака за узгој у Немачкој. Елитни генотипови А. ува-урси могли су се вегетативно размножавати, али већина добијених клонова није успела током успостављања на терену, што је ограничавало експлоатацију ових ресурса. Такође смо описали постојеће варијације у садржају три флавоноида (катехин, мирицетин и кверцетинглукозид), као и кафеинске киселине, међу шпанским популацијама медвеђег бобица, и како климатске факторе (углавном глобално зрачење и падавине), који су у корелацији са географском ширином и висином градијенти, утичу на ту варијацију. У исто време, упркос ниским нивоима варијабилности хаплотипа и величине генома утврђених код иберијске А. ува-урси, генетска и цитогенетска диференцијација популација је била слабо, али значајно повезана са фитокемијском разноврсношћу. Све у свему, ови резултати наглашавају да се ефекат и генетских и абиотских фактора мора узети у обзир да би се објаснила интраспецифична фитокемијска варијабилност која се налази у биљкама из дивљих популација.

ЦИСТАНЦХЕ ЕФЕКТИ

Референце

1. Мооре, БД; Андрев, РЛ; Кулхеим, Ц.; Фолеи, ВЈ Објашњавање интраспецифичне разноврсности у секундарним метаболитима биљака у еколошком контексту. Нев Пхитол. 2014, 201, 733–750. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Цхеиниер, В.; Цомте, Г.; Давиес, КМ; Латтанзио, В. Биљни феноли: недавна достигнућа у њиховој биосинтези, генетици и екофизиологији. Плант Пхисиол. Биоцхем. 2013, 72, 1–20. [ЦроссРеф]

3. Бернал, М.; Ллоренс, Л.; Јулкунен-Тиитто, Р.; Бадоса, Ј.; Вердагуер, Д. Висинске и сезонске промене фенолних једињења у листовима и кутикулама Букус семпервиренс. Плант Пхисиол. Биоцхем. 2013, 70, 471–482.[ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Уптон, Р. (ур.) Ува-урси Леаф. Арцтостапхилос ува-урси (Л.) Спренг. Стандард анализе, контроле квалитета и терапије; Америцан Хербал Пхармацопеиа: Сцоттс Валлеи, ЦА, УСА, 2008; 30п.

5. Европска агенција за лекове. Извештај о процени Арцтостапхилос ува-урси (Л.) Спренг. Фолија. ЕМА/ХМПЦ/750266/2016; Европска агенција за лекове: Амстердам, Холандија, 6. 2018. Канлаиаваттанакул, М.; Лоуритх, Н. Биљке и природни производи за лечење хиперпигментације коже—преглед. Планта Мед. 2018, 84, 988–1006. [ЦроссРеф]

7. Мигас, П.; Краузе-Барановска, М. Значај арбутина и његових деривата у терапији и козметици. Пхитоцхем. Летт. 2015, 13, 35–40. [ЦроссРеф]

8. Сео, ДХ; Јунг, ЈХ; Лее, ЈЕ; Јеон, ЕЈ; Ким, В.; Парк, ЦС Биотехнолошка производња арбутина (- и -арбутина), средстава за осветљавање коже и њихових деривата. Аппл. Мицробиол. Биотецхнол. 2012, 95, 1417–1425.[ЦроссРеф]

9. Зху, Кс.; Тиан, И.; Зханг, В.; Зханг, Т.; Гуанг, Ц.; Му, В. Недавни напредак у биолошкој производњи -арбутина. Аппл. Мицробиол. Биотецхнол. 2018, 102, 8145–8152. [ЦроссРеф] [ПубМед]

10. Давеи, М. Секундарни метаболизам у културама биљних ћелија. У Енцицлопедиа оф Апплиед Плант Сциенцес, 2нд ед.; Тхомас, Б., Мурпхи, ДЈ, Мурраи, БГ, Едс.; Елсевиер: Лондон, УК, 2017; Том 2, стр. 462–467. [ЦроссРеф]

11. Куркин, ВА; Риазанова, ТК; Даева, ЕД; Кадентсев, ВИ Конституенти листова Арцтостапхилос ува-урси.Цхем. Нат. Цомпд. 2018, 54, 278–280. [ЦроссРеф]

12. Панда, А.; Петруцци, Р.; Марросу, Г.; Мултари, Г.; Романа-Галло, Ф. ХПЛЦ-ПДАЕСИ-ТОФ/МС метаболичко профилисање Арцтостапхилос пунгенс и Арцтостапхилос ува-урси: Компаративна студија фенолних једињења из метаболичког екстракта листа. Фитохемија 2015, 115, 79–88. [ЦроссРеф]

13. Оленников, ДН; Цхекхирова, ГВ 60-Галлоилпицеин и друга фенолна једињења из Арцтостапхилос ува-урси.Цхем. Нат. Цомпд. 2013, 49, 1–7. [ЦроссРеф]

14. Бревер, МС Природни антиоксиданси: извори, једињења, механизми деловања и потенцијалне примене.Цомпр. Рев. Фоод Сци. Фоод Саф. 2011, 10, 221–247. [ЦроссРеф]

15. Амаровицз, Р.; Пегг, РБ; Рахими-Могхаддам, П.; Баре, Б.; Веил, ЈА Капацитет уклањања слободних радикала и антиоксидативна активност одабраних биљних врста из канадских прерија. Фоод Цхем. 2004, 84, 551–562.[ЦроссРеф]

16. Царпентер, Р.; О'Гради, МН; О'Цаллагхан, ИЦ; О'Бриен, НМ; Керри, ЈП Процена антиоксидативног потенцијала екстракта семена грожђа и медвјеђег бобица у сировом и куваном свињском месу. Меат Сци. 2007, 76, 604–610. [ЦроссРеф][ПубМед]

17. Мекинић, ИГ; Скроза, Д.; Љубенков, И.; Каталинић, В.; Шимат, В. Антиоксидативни и антимикробни потенцијал фенолних метаболита из традиционално коришћених медитеранских биљака и зачина. Фоодс 2019, 8, 579. [ЦроссРеф]

18. Мохд Азман, НА; Галлего, МГ; Сеговиа, Ф.; Абдулах, С.; Схаарани, СМ; Алмајано, МП Проучавање својстава екстракта листова медвјеђе бобице као природног антиоксиданса у моделној храни. Антиоксиданси 2016, 5, 11.[ЦроссРеф] [ПубМед]

19. Пегг, РБ; Амаровицз, Р.; Нацзк, М. Антиоксидативна активност полифенола из екстракта листа медвјеђег бобица (Арцтостапхилос ува-урси Л. Спренгел) у месним системима. У фенолним једињењима у храни и природним здравственим производима; Схахиди, Ф., Хо, ЦТ, Едс.; Америчко хемијско друштво: Вашингтон, ДЦ, САД, 2005; стр. 67–82.[ЦроссРеф]

20. Врона, М.; Бласцо, С.; Бецеррил, Р.; Нерин, Ц.; Салес, Е.; Асенсио, Е. Антиоксидативни и антимикробни маркери биУПЛЦ®–ЕСИ-К-ТОФ-МСЕ новог вишеслојног активног паковања заснованог на Арцтостапхилос ува-урси. Таланта2019, 196, 498–509. [ЦроссРеф]

21. Маиер, М.; Олберманн, АЛ; Реннер, М.; Веиднер, Е. Провера европског лековитог биља на њихов садржај танина—Нова потенцијална средства за штављење за индустрију коже. Инд. Цроп. Прод. 2017, 99, 19–26. [ЦроссРеф]

22. Борос, Б.; Јакабова, С.; Мадарасз, Т.; Молнар, Р.; Галамбос, Б.; Килар, Ф.; Фелингер, А.; Фаркас, А. Валидатед ХПЛЦ метода за симултану квантификацију бергенина, арбутина и галне киселине у листовима различитих врста Бергениа. Хроматографија 2014, 77, 1129–1135. [ЦроссРеф]

23. Миав-Линг, Ц.; Цхур-Мин, Ц. Симултано ХПЛЦ одређивање хидрофилног средства за избељивање у козметичком производу. Ј. Пхарм. Биомед. Анал. 2003, 33, 617–626. [ЦроссРеф]

24. Парејо, И.; Виладомат, Ф.; Бастида, Ј.; Цодина, Ц. Један корак екстракције у квантитативној анализи листова арбутинина медвјеђег бобица (Арцтостапхилос ува-урси) течном хроматографијом високих перформанси. Пхитоцхем. Анал.2001, 12, 336–339. [ЦроссРеф]

25. ПОВЕР. Плантс оф тхе Ворлд Онлине. Доступно на мрежи: хттп://ввв.плантсофтхеворлдонлине.орг/ (приступљено 29. априла 2020.).

26. Салеем, А.; Харрис, ЦС; Асим, М.; Цуерриер, А.; Мартинеау, Л.; Хаддад, ПС; Арнасон, ЈТРП-ХПЛЦ-ДАД-АПЦИ/МСД метода за карактеризацију медицинских Ерицацеае коју су користиле прве нације Ееиоу ИстцхееЦрее. Пхитоцхем. Анал. 2010, 21, 328–339. [ЦроссРеф] [ПубМед]

27. Стефанесцу, БЕ; Сзабо, К.; Моцан, А.; Црисан, Г. Фенолна једињења из листова пет врста Ерицацеае и њихова сродна биорасположивост и здравствене предности. Молецулес 2019, 24, 2046. [ЦроссРеф] [ПубМед]

28. Онда, И.; Моцхида, К. Истраживање генетског диверзитета биљака коришћењем техника секвенционирања високе пропусности. Цурр. Геном. 2016, 17, 358–367. [ЦроссРеф] [ПубМед]

29. Ианницели, Ј.; Гуариниелло, Ј.; Тоссиб, ВЕ; Регаладо, ЈЈ; Ди Циацциоа, Л.; ван Барене, ЦМ; Питта Алварез, СИ; Есцандон, АС "Полиплоидни ефекат" у узгоју ароматичних и медицинских врста. Сци. Хортиц. 2020,260, 108854. [ЦроссРеф]

30. Леитцх, ИЈ; Леитцх, АР Разноврсност величине генома и еволуција у копненим биљкама. Разноврсност биљног генома, том 2, Физичка структура, понашање и еволуција биљних генома; Леитцх, ИЈ, Греилхубер, Ј., Долежел, Ј., Вендел, ЈФ, Едс.; Спрингер: Беч, Аустрија, 2013; стр. 307–322. [ЦроссРеф]

31. Беннетт, МД; Леитцх, ИЈ Количине нуклеарне ДНК у ангиоспермима — напредак, проблеми и изгледи. Анн. Бот. 2005, 95, 45–90. [ЦроссРеф]

32. Грегори, ТР (ур.) Еволуција генома; Елсевиер: Сан Дијего, Калифорнија, САД, 2005.

33. Хоанг, ПН; Сцхуберт, В.; Меистер, А.; Фуцхс, Ј.; Схуберт, И. Варијације у величини генома, запремини ћелије и језгра, броју хромозома и локусима рДНК међу паткицама. Сци. Реп. 2019, 9, 3234. [ЦроссРеф]

34. Книгхт, ЦА; Молинари, Н.; Петров, ДА Хипотеза ограничења великог генома: еволуција, екологија и фенотип. Анн. Бот. 2005, 95, 177–190. [ЦроссРеф]

35. Пеллицер, Ј.; Хидалго, О.; Додсвортх, С.; Леитцх, ИЈ Разноврсност величине генома и њен утицај на еволуцију копнених биљака. Генес 2018, 9, 88. [ЦроссРеф]

36. Царев, И.; Рушˇци´ц, М.; Скоˇцибуши´ц, М.; Марави´ц, А.; Сиљак-Јаковлев, С.; Политицо, О. Фитокемијска и цитогенетска карактеризација Центауреа солститиалис (Астерацеае) из Хрватске. Цхем. Биодиверс. 2017, 14, е1600213.[ЦроссРеф]

37. Цоле, ИБ; Цао, Ј.; Алан, РА; Сакена, ПК; Мурцх, СЈ Поређење Сцутеллариа баицаленсис, Сцутеллариалатерифлора и Сцутеллариа рацемоса: величина генома, антиоксидативни потенцијал и фитохемија. Планта Мед. 2008, 74, 474–481. [ЦроссРеф]

38. Царвалхо, ИГС; Виторино, ЛЦ; де Соуза, УЈБ; Бесса, ЛА Недавни трендови у истраживању генетске разноврсности биљака: Импликације за очување. Диверсити 2019, 11, 62. [ЦроссРеф]

39. Веи, С.; Ианг, В.; Ванг, Кс.; Хоу, И. Висок генетски диверзитет у угроженој лековитој биљци, Сауссуреаинволуцрата (Сауссуреа, Астерацеае), у западним планинама Тјаншан, Кина. Цонсерв. Генет. 2017, 18, 1435–1447. [ЦроссРеф]

40. Цханг, ИЈ; Цао, ИФ; Зханг, ЈМ; Тиан, ЛМ; Донг, КСГ; Зханг, И.; Ки, Д.; Зханг, КСС ​​Студија о разноврсности хлоропластне ДНК култивисане и дивље крушке (Пирус Л.) у северној Кини. Трее Генет. Геноми 2017, 13, 44.[ЦроссРеф]

42. Парејо, И.; Виладомат, Ф.; Бастида, Ј.; Цодина, Ц. Варијација садржаја арбутина у различитим дивљим популацијама Арцтостапхилос ува-урси у Каталонији, Шпанија. Ј. Хербс Спицес Мед. Плантс 2002, 9, 329–333. [ЦроссРеф]

42. Сонненсцхеин, М.; Тегтмеиер, М. Експерименти припитомљавања медвеђе бобице (Арцтостапхилос ува-урси (Л.)Спренг.). Ј. Мед. Зачинске биљке 2012, 17, 124–128.

43. Цхен, ХИ; Лин, ИЦ; Хсиех, ЦЛ Евалуација антиоксидативне активности воденог екстракта неких одабраних нутриционистичких биљака. Фоод Цхем. 2008, 104, 1418–1424. [ЦроссРеф]

44. Дел Валле, ЈЦ; Буиде, МЛ; Казимиро-Соригер, И.; Вхитталл, ЈБ; Нарбона, Е. О акумулацији флавоноида у различитим биљним деловима: Обрасци варијација међу појединцима и популацијама у приобалном кампиону (Силене литтореа). Фронт. Плант Сци. 2015, 6, 939. [ЦроссРеф]

45. Мартинез-Цаденас, Ц.; Лопез, С.; Рибас, Г.; Флорес, Ц.; Гарциа, О.; Севилла, А.; Смитх-Зубиага, И.; Ибаррола-Виллаба, М.; Пино-Јанес, ММ; Гардеазабал, Ј.; ет ал. Симултана селекција пречишћавања на алелу МЦ1Р предака и позитивна селекција на алелу ризика од меланома в60л код јужних Европљана. Мол. Биол. Евол. 2013, 30, 2654–2665. [ЦроссРеф]

46. ​​Јакааола, Л.; Хохтола, А. Ефекат географске ширине на биосинтезу флавоноида у биљкама. Окружење биљних ћелија. 2010, 33, 1239–1247. [ЦроссРеф]47. Мартз, Ф.; Пелтола, Р.; Фонтана, С.; Дувал, РЕ; Јулкунен-Тиитто, Р.; Старк, С. Утицај географске ширине и надморске висине на терпеноидни и растворљиви фенолни састав иглица клеке (Јуниперус цоммунис) и процена њихове антибактеријске активности у бореалној зони. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2009, 57, 9575–9584. [ЦроссРеф]

48. Ианг, Б.; Зхенг, Ј.; Лааксонен, О.; Тахвонен, Р.; Каллио, Х. Ефекти географске ширине и временских услова на фенолна једињења у сортама рибизле (Рибес спп.). Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2013, 61, 3517–3532. [ЦроссРеф][ПубМед]

49. Латти, АК; Јаакола, Л.; Риихинен, КР; Каинулаинен, ПС Варијације антоцијанина и флавонола у боббил бобицама (Вацциниум улигиносум Л.) у Финској. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2010, 58, 427–433. [ЦроссРеф] [ПубМед]

50. Латти, АК; Риихинен, КР; Каинулаинен, ПС Анализа варијације антоцијана у дивљим популацијама боровнице (Вацциниум миртиллус Л.) у Финској. Ј. Агриц. Фоод Цхем. 2008, 56, 190–196. [ЦроссРеф]

51. Монсцхеин, М.; Иглесиас, Ј.; Кунерт, О.; Буцар, Ф. Фитохемија вријеска (Цаллуна вулгарис (Л.) Хулл) и њена алтитудинална промена. Пхитоцхем. Рев. 2010, 9, 205–215. [ЦроссРеф]

52. Перри, НБ; Бургесс, ЕЈ; Родригуез Гуитиан, МА; Ромеро Франко, Р.; Лопез Москуера, Е.; Смаллфиелд, БМ; Јоице, НИ; Литтлејохн, РП Сесквитерпенски лактони у Арница монтана: Хеленалин и дихидрохеленалинхемотипови у Шпанији. Планта Мед. 2009, 75, 660–666. [ЦроссРеф] [ПубМед]

53. Абдала-Робертс, Л.; Ассманн, С.; Берни-Миер, И.; Теран, ЈЦ; Цовело, Ф.; Глаусер, Г.; Мореира, Кс. Биотички андабиотички фактори повезани са висинским варијацијама у биљним особинама и биљоједи код доминантне врсте храста.Ам. Ј. Бот. 2016, 103, 2070–2078. [ЦроссРеф] [ПубМед]

54. Бентлеи, Ј.; Мооре, ЈП; Фаррант, ЈМ Метаболомика као допуна филогенетици за процену интраспецифичних граница у лековитом грмљу који је толерантан на исушивање Миротхамнус флабеллифолиа (Миротхамнацеае). Пхитоцхемистри 2019, 159, 127–136. [ЦроссРеф] [ПубМед]

55. Сиљак-Јаковлев, С.; Пустахија, Ф.; Шоли´ц, ЕМ; Богунић, Ф.; Муратовић, Е.; Башић, Н.; Цатрице, О.; Бровн, Ц. Товардс база података величине генома и броја хромозома балканске флоре: Ц-вредности у 343 таксона са новим вредностима за 252. Адв. Сци. Летт. 2010, 3, 190–213. [ЦроссРеф]

56. Гарридо, ЈЛ; Алцантара, ЈМ; Реи, ПЈ; Медрано, М.; Гуитиан, Ј.; Цастелланос, МЦ; Бастида, ЈМ; Јаиме, Р.; Херрера, ЦМ Географска генетичка структура иберијских колумбина (ген. Акуилегиа). Плант Сист. Евол. 2017, 303, 1145–1160. [ЦроссРеф

57. Листл, Д.; Посцхлод, П.; Реисцх, Ц. Пхилогеограпхи оф а хард роцк сурвивор ин Еуропеан дри пассландс.ПЛоС ОНЕ 2017, 12, е0179961. [ЦроссРеф]

58. Олалде, М.; Херран, А.; Еспинел, С.; Гоицоецхеа, П. Филогеографија белог храста на Иберијском полуострву.Ецол. Манаг. 2002, 156, 89–102. [ЦроссРеф]

59. Барретт, СЦХ Утицаји клоналности на сексуалну репродукцију биљака. Проц. Натл. Акад. Сци. САД 2015, 112,8859–8866. [ЦроссРеф] [ПубМед]

60. Сковира, М.; Фалгуера, В.; Галлего, Г.; Пеиро, С.; Алмајано, МП Ефекат екстраката Перилла фрутесценс на оксидативну стабилност моделних емулзија хране. Антиоксиданси 2014, 3, 38–54. [ЦроссРеф] [ПубМед]

61. Пасцоал, А.; Куирантес-Пине, Р.; Фернандо, АЛ; Алекопоулоу, Е.; Сегура-Царретеро, А. Фенолни састав и антиоксидативна активност листова кенафа. Инд. Цроп. Прод. 2015, 78, 116–123. [ЦроссРеф]

62. Пеллицер, Ј.; Гарнатје, Т.; Молеро, Ј.; Пустахија, Ф.; Сиљак-Јаковлев, С.; Валлес, Ј. Порекло и еволуција јужноамеричких врста Артемисиа (Астерацеае); докази из молекуларне филогеније, рибозомске ДНК и података о величини геномезе. Ауст. Ј. Бот. 2010, 58, 605–616. [ЦроссРеф]

63. Долежел, Ј. Проточна цитометријска анализа садржаја нуклеарне ДНК у вишим биљкама. Пхитоцхем. Анал. 1991, 2,143–154. [ЦроссРеф]

64. Доиле, ЈЈ; Доиле, ЈЛ Брза процедура изолације ДНК за мале количине свежег ткива листа. Пхитоцхем. Булл.Бот. Соц. Сам. 1987, 19, 11–15.

65. Виталес, Д.; Фелинер, ГН; Валлес, Ј.; Гарнатје, Т.; Фират, М.; Алварез, И. Нев цирцумсцриптион оф тхеМедитерранеан генус Анацицлус (Антхемидеае, Астерацеае) на основу пластидних и нуклеарних ДНК маркера. Пхитотака 2018, 349, 1–17. [ЦроссРеф]

66. Халл, ТА БиоЕдит: Уређивач и програм за анализу биолошких секвенци прилагођен кориснику за Виндовс95/98/НТ. Нуклеинске киселине Симп. Сер. 1999, 41, 95–98.

67. Тхомпсон, ЈД; Хиггинс, ДГ; Гибсон, ТЈ ЦЛУСТАЛ В: Побољшање осетљивости прогресивног поравнања вишеструких секвенци кроз пондерисање секвенце, казне за размаке специфичне за позицију и избор матрице тежине. Нуклеинске киселине Рес. 1994, 22, 4673–4680. [ЦроссРеф]

68. Розас, Ј.; Феррер-Мата, А.; Санцхез-ДелБаррио, ЈЦ; Гуирао-Рицо, С.; Либрадо, П.; Рамос-Онсинс, СЕ; Санцхез-Грациа, А. ДнаСП 6: Анализа полиморфизма секвенце ДНК великих скупова података. Мол. Биол. Евол.2017, 34, 3299–3302. [ЦроссРеф] [ПубМед]

69. Борцхсениус, Ф. ФастГап, верзија 1.2; Одељење за бионауке, Универзитет Архус: Архус, Данска, 2009; Доступно на мрежи: хттп://ввв.аубот.дк/ФастГап_хоме.хтм (приступљено 1. јула 2019.).

70. Цлемент, М.; Посада, ДЦКА; Црандалл, КА ТЦС: Компјутерски програм за процену генеалогија гена. Мол. Ецол. 2000, 9, 1657–1659. [ЦроссРеф] [ПубМед]

71. Леигх, ЈВ; Брајант, Д. Попарт: Софтвер са свим функцијама за изградњу мреже хаплотипова. Методе Ецол. Евол.2015, 6, 1110–1116. [ЦроссРеф]

72. Фок, Ј. Почетак рада са Р командантом: графички кориснички интерфејс основне статистике за РЈ Стат. Софтв.2005, 14, 1–42. [ЦроссРеф]

73. Оксанен, Ј.; Бланцхет, ФГ; Киндт, Р.; Легендре, П.; О'Хара, РБ; Симпсон, ГЛ; Солимос, П.; Стивенс, М.; Вагнер, Х. Веган: Пакет екологије заједнице. Р пакет верзија 1.17-4. 2010. Доступно на мрежи: хттп://ЦРАН.Р-пројецт.орг/пацкаге=веган (приступљено 19. септембра 2010).74. Малиновска, Х. Селекције медвеђе бобице (Арцтостапхилос ува-урси (Л.) Спренг.) из природних популација у Пољској. Ацта Соц. Бот. Пол. 1995, 64, 91–96. [ЦроссРеф]