Зелена синтеза и карактеризација наночестица гвожђа синтетизованих из воденог екстракта листова витекс леукоксилона и његове биомедицинске примене

Апстрактан:Метода хладне екстракције је коришћена за добијање воденог екстрактаВитек леуцокилонлистови у омјеру 1:10. Наночестице гвожђа (ФеНП) су синтетизоване коришћењем воденог екстракта листаВ. леуцокилонкао редукционо средство. Фитомедицински приступ је коришћен за прављење ФеНП мешањем 1 мЛ биљног екстракта са 1 мМ гвожђе сулфата. За испитивање синтетизованих ФеНП коришћени су скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ), инфрацрвена спектроскопија са Фуријеовом трансформацијом (ФТИР), ултраљубичасто-видљива спектроскопија (УВ-Вис) и енергетски дисперзивна рендгенска спектроскопија. Реакција редукције се показала променом боје раствора, а формирање црне боје потврђује да су формирани ФеНП. Највећи пик апсорпције (мак) пронађен је на 395 нм у УВ-Вис спектралној анализи. ФТИР спектриВ. леуцокилонводени екстракт листа показао је померање неких пикова, односно 923,96 цм−1 и 1709,89 цм−1, са функционалним групама карбоксилних киселина, незасићених алдехида и кетона, који су недостајали у ФТИР спектрима ФеНП-а и одговорни су за формирање ФеНП-а. ФеНП-ови пречника између 45 и 100 нм примећени су на СЕМ сликама. Стварање ФеНП-а је потврђено ЕДКС-ом, који показује јак сигнал у области металног гвожђа на 6–8 Кев. КСРД је открио кристалну природу и просечан пречник од 136,43 нм.Антиоксиданс,антиинфламаторно, цитотоксични изарастање ранаин витро тестови су показали значајну активност ФеНП. Кумулативни налази ове студије указују на то да зелена синтеза ФеНП-аповећава његову биолошку активности може послужити каомогуће средство за зарастање дермалних ранаицитотоксични агенс против рака. Потребна је будућа студија о идентификацији механизама укључених у синтезу ФеНП-аВ. леуцокилони његове биомедицинске примене.

Кључне речи:Витек леуцокилон; наночестице гвожђа; СЕМ; зарастање рана; цитотоксични

ЦИСТАНЦХЕ БЕНЕФИТС ЗААНТИОКСИДАНТ,АНТИ-ИНФЛАМАТОР, ЦИТОТОКСИЧНО, ИЗАРАСТАЊЕ РАНА

1. Представљање

Примена нанотехнологије у науци и технологији за производњу нових материјала на нивоу наноразмера је област која се брзо развија [1]. Нанотехнологија се бави производњом материјала на атомском нивоу како би добила карактеристична својства, којима се може манипулисати за жељене примене. Ова област брзо расте са својим применама у науци и технологији за производњу нових материјала на нивоу наноразмера [2]. Различити индустријски сектори су прихватили нанотехнологију последњих година због њене примене у области електронских система за складиштење [3], биотехнологије [4], магнетне сепарације и предконцентрације циљних аналита, циљане испоруке лекова [5] и транспортних средстава за гене и лекове. испорука [3,5,6]. Сходно томе, ове честице имају потенцијал да остваре значајан утицај на друштво као резултат широког спектра примена за које се могу користити. Наночестице (НП) су масе честица које имају величину мању од сто нанометара и сматрају се кључним структурним масама у области нанотехнологије. Већа активност НП-а је и њихова дефинишућа карактеристика и квалитет по којем су најистакнутији [7]. Органски и неоргански НП су две примарне класификације које се могу применити на наночестице. Неорганске наночестице могу укључивати магнетне НП, НП племенитих метала (као што су злато и сребро) и полупроводничке НП (као што су титанијум диоксид и цинк оксид). Органске наночестице могу укључивати НП угљеника. Неорганске наночестице привлаче огромну пажњу јер нуде врхунска својства материјала заједно са функционалном свестраношћу. Истраживани су као могући алати за медицинско снимање, као и за лечење болести због карактеристика величине које поседују [8]. Различите хемијске, физичке и биолошке особине НП-а су под великим утицајем различитих параметара, укључујући величину и морфологију наночестица, као и површински премаз, који се обично одређују током синтезе наночестица. Губитак предвиђене биолошке активности узрокован је смањењем колоидне стабилности. пХ, јонска снага и низ протеина који ступају у интеракцију са АгНП под релевантним околностима имају утицај на колоидну стабилност. Као резултат, одабир одговарајуће технике синтезе је критичан за добијање жељених карактеристика честица за специфичне примене [9].

Тренутно постоји велики избор НП-а који се могу синтетизовати коришћењем различитих физичких, хемијских, биолошких и хибридних процеса. Према налазима великог броја истраживачких студија, физички и хемијски процеси за производњу наночестица обухватају употребу органских растварача, опасних једињења, значајних количина енергије и стабилизатора који нису биоразградиви [10]. Стога, у области зелене нанотехнологије, синтеза НП коришћењем природно доступних материјала као што су биљни екстракти, различити микроорганизми, њихови метаболити и неколико природних хуминских супстанци [11,12] као редукционих и затварајућих агенаса постаје све популарнија. Методе синтезе које су пријатељске за околину коришћене су за производњу широког спектра металних наночестица, укључујући сребро, злато, гвожђе, бакар и цинк. Развој лаких и еколошки прихватљивих метода за синтезу НП је један од кључних фокуса нанотехнологије. Биоматеријали као што су микроорганизми и биљни екстракти могу се користити у процесу припреме широког спектра НП [13,14]. Међутим, пошто су неки организми патогени, опасно је руковати њима. Да би напредовали, микроорганизми се морају одржавати у култури и подвргнути пажљиво контролисаним условима, укључујући температуру, пХ и друге параметре. Пошто елиминише напоран процес одржавања микробне културе, синтеза НП-ова коришћењем биљних делова може се понекад показати као кориснија од других биолошких процеса [15]. Као резултат тога, привукао је велику пажњу због својих инхерентних карактеристика, које укључују коришћење природних ресурса, брзину, еколошку прихватљивост и доброћудност. Ове привлачне карактеристике су апсолутно неопходне за употребу у медицинским апликацијама. Наночестице произведене зеленом синтезом имају величину која је добро дефинисана и под контролом, не садрже загађиваче, а метода је једноставна за повећање. Ово су неке од додатних предности зелене синтезе [16]. Биолошка активност синтетизованих наночестица је у великој мери одређена и фино подешена зеленим материјалима који се користе за стабилност и редукцију металних јона. Једно од идеалних својстава НП би требало да буде да мора имати изузетан капацитет да разликује потенцијалне мете (патогене) и ћелије сисара (домаћина) [17].

Због тога је водени екстракт листова В. леуцокилон истраживан на његов потенцијал да олакша формирање наночестица гвожђа (ФеНПс) у актуелном истраживању. Гвожђе је један од елемената који се може наћи у највећем изобиљу на Земљи. Недавно је постао препознат као нова класа важних НП-а због чињенице да поседује низ јединствених својстава, укључујући високу коерцитивност и суперпарамагнетизам. Катализа, електронски уређаји, складиштење информација, сензори, технологија испоруке лекова, биомедицина, уређаји за магнетно снимање и чишћење животне средине су само неке од многих интригантних апликација које су користиле ФеНП [18]. Штавише, према бројним студијама, ФеНП се могу створити из различитих биљних екстраката. Ови биљни екстракти укључују лист Еуцалиптус глобулус [19], лист нара [20] и пепео од коре банане [21]. Биљка В. леуцокилон, која је коришћена у овој студији, је члан породице Вербенацеае. Такође је познато као чедно дрво са пет листова (канада: Сенгени, Холенекки, Холлалакки) и може се наћи у региону дуж обала река у зимзеленим и полу-зимзеленим шумама и влажним листопадним шумама дуж потока. Може да достигне висину и до 20 м и сврстава се у скромно до велико листопадно дрво. Дуж индијских шума Западног Гата, може се наћи у великом броју. Пријављено је да инфузија екстракта листа В. леуцокилон поседује широк спектар фармаколошких активности као што су антиинфламаторна, антиоксидативна, антипсихотичка, антидепресивна, антипаркинсоничка и антихиперлипидемијска активност [22]. Природни производи су се кроз историју, а посебно у народној медицини, користили за лечење широког спектра тегоба и болести. Ова пракса датира још из античких времена. Методе хемије природних производа које постоје већ дуго времена омогућиле су проналажење великог броја биоактивних секундарних метаболита који потичу из копнених и морских извора. Значајан број ових природних супстанци се сада разматра за употребу као потенцијални фармацеутски производи [23].

Постоји велики број природних хемикалија и хранљивих материја које тек треба да буду откривене, а које су корисне човечанству. Као последица овога, постоји непосредна потражња за истраживањем и развојем иновативних терапијских опција које се могу успешно користити у терапијским интервенцијама уз стварање минималне количине штетних ефеката.

Тренутно предложени процес зелене синтезе за ФеНП је посебан и исплатив. У тренутној студији, направљен је покушај да се створе наночестице на собној температури без употребе било каквих хемикалија или физичких техника. Биљка Витек леуцокилон је изабрана у настојању да се синтетишу наночестице гвожђа, а спроведени су свеобухватни систематски ин витро модели да би се проценила моћ наночестица гвожђа. О овој биљци објављен је само ограничен број истраживачких студија о концепту наночестица и њиховој биомедицинској примени. Као последица тога, одлучили смо да би било корисно спровести ово истраживање имајући на уму следеће циљеве: скрининг на фитокемикалије и мерење броја секундарних метаболита у В. леуцокилон; зелена синтеза и карактеризација ФеНП из В. леуцокилон; компаративна студија антиоксидативних и антиинфламаторних ефеката В. леуцокилон и његових ФеНП ин витро; ин витро цитотоксична активност воденог екстракта листа В. леуцокилон и његових ФеНП против рака коже, рака плућа и оралног карцинома; ин витро активност зацељивања рана воденог екстракта листа В. леуцокилон и његових синтетичких ФеНП-а помоћу сцратцх теста.

2. Материјал и методе

2.1. Збирка биљног материјала

У марту 2022. године, свежи листови В. леуцокилон су убрани из шумског подручја Анши у западним Гатима у округу Утар Канада у држави Карнатака у Индији. Листове је идентификовао и потврдио Др. Котресха К., таксономиста, Одсек за ботанику, Карнатака Сциенце Цоллеге, Дхарвад; Карнатака, позивајући се на узорак ваучера депонован на Одељењу за ботанику, Карнатака Сциенце Цоллеге, Дхарвад, Карнатака. Након сакупљања, свеж биљни материјал је испран под текућом водом из чесме, осушен на сунцу, а затим млевен у груби прах помоћу механичке млевене машине. Прах је чуван у контејнерима који су били затворени на собној температури како би се касније користио у процесу екстракције сировим растварачем.

2.2. Припрема биљног екстракта

Користећи Сокхлет уређај, 25 г листова у праху је екстраховано 48 х са 250 мЛ дестиловане воде. Водени екстракт је даље концентрован помоћу рото-испаривача, а затим је осушен у ексикаторима пре него што је држан у затвореној боци на 4 ◦Ц до употребе. За синтезу ФеНП-а, водени екстракт је коришћен као средство за редукцију и стабилизацију.

2.3. Растварачи и реагенси

Све коришћене хемикалије и растварачи су били аналитичког квалитета и набављени су од Хи-медиа (Хубли, Индија).

2.4. Пхитоцхемицал Аналисис

Пратећи процедуру коју су описали Деепти ет ал. (2012), сирови водени екстракт листа В. леуцокилон је квалитативно испитан на присуство различитих фитокемијских састојака као што су флавоноиди, алкалоиди, феноли, гликозиди, стероли, лигнини, сапонини, антрахинони, танини и редукциони шећери [24].

2.5. Синтеза наночестица гвожђа

Прво, 1 мЛ воденог екстракта листа В. леуцокилон је додат у 10 мЛ 0,05 мМ ФеСО4 воденог раствора и смеша је протресена. На собној температури иу тамном окружењу, спроведен је комплетан процес реакционе смеше. Реакција оксидације/редукције је била јасно видљива након што је безбојна реакциона смеша инкубирана и реаговала је потребно време [25]. Да би се уклонили трагови воденог екстракта из свеже синтетизованих ФеНП, који су остављени да се осуше у праху након центрифугирања на 10,000 рпм током десет 10 мин током жељеног реакционог периода, водена смеша која садржи ФеНП је центрифугирана други пут и поново распршен у двоструко дестилованој води и осушен [26].

2.6. Карактеризација ФеНП-а

Неколико метода, као што су ултраљубичасто-видљива спектроскопија (УВ-Вис), инфрацрвена спектроскопија са Фоуриер-трансформацијом (ФТИР), скенирајућа електронска микроскопија и енергетска дисперзивна рендгенска спектроскопија, дифракција рендгенских зрака (КСРД), анализатор величине честица и зета потенцијал, коришћени су да би се окарактерисали ФеНП.

2.6.1. Анализа заснована на УВ–видљивој спектроскопији

Прво, 1 мЛ аликвот колоидног ФеНПс раствора у кварцним киветама је процењен коришћењем УВ-видљиве спектроскопије (У-3310, Хитацхи, Токио, Јапан), користећи дестиловану воду као референцу и 0.05 мМ ФеСО4 као бланко, да би се потврдила редукција фери јона у колоидном раствору [27].

2.6.2. Анализа заснована на ФТИР

Функционалне групе (групе) које су биле везане на површини гвожђа и које су биле укључене у синтезу ФеНП су идентификоване коришћењем ФТИР спектроскопије (С700, Ницолет, МА, САД), [28]. После 72 х инкубације, ФеНП-ови су изоловани поновљеним центрифугирањем (3-4 пута) реакционих смеша на 10,000 рпм током 15 мин. Супернатант је замењен дејонизованом водом и пелет је чуван као прах. Након сушења, ФеНП-ови су прошли кроз ФТИР анализу коришћењем процеса пелетирања калијум бромида у односу 1:100.

2.6.3. Анализа заснована на скенирању електронским микроскопом

Скенирајућа електронска микроскопија (ЈСМ-ИТ 500, Јеол, Бостон, МА, САД) коришћена је за испитивање наночестица и утврђивање њиховог површинског облика. Подлоге су припремљене на чистој Си супстрату од 5 мм × 5 мм исцепљеном од плочице пречника 100 мм. Супстрат је остављен да реагује 2 х до 6 х и узорак је припремљен центрифугирањем колоидног раствора на 10,000 рпм током 5 мин. Пелет је осушен након вишеструког центрифугирања, након чега је поново распршен у дејонизованој води и поступак је поновљен. На крају је добијен суви пелет, који је даље подвргнут структурној карактеризацији СЕМ анализом по процедури коју је описао Национални институт за стандарде и технологију, НИСТ-2007 [29].

2.6.4. Енергетски дисперзивни Кс-зраци

Након сушења на бакарној мрежи обложеној угљеником, редуковани ФеНП су анализирани коришћењем ЕДКС (ЈСМ-ИТ 500, Јеол, Бостон, МА, САД), што је такође омогућило да се одреди елементарни састав.

2.6.5. Зета Потенцијал

Запажања НП-а Зета потенцијал је користан алат за стицање додатних увида о стабилности колоидних НП-а. Амплитуда зета потенцијала даје наговештај о могућој стабилности колоида. Према Мелендрезу и др. (2010), сматра се да су честице стабилне ако су њихове вредности зета потенцијала или више позитивне од плус 30 мВ или негативне од 30 мВ [30]. Ову чињеницу треба узети у обзир. Ласерски зета метар је коришћен за добијање очитавања површинских зета потенцијала (Малверн зета сеизер 2000, Малверн, УК). Течни узорци наночестица, укупне запремине 5 милилитара, разблажени су са 50 милилитара двоструко дестиловане воде, а као раствор електролита за суспендовање коришћено је 2 мм по квадратном метру натријум хлорида. Након тога, пХ је модификован док није достигао жељени ниво. Узорци су мешани укупно 30 мин. Након протресања посуде, забележен је пХ у равнотежи и одређен је зета потенцијал металних честица. За потребе одређивања површинског потенцијала ФеНП-а коришћен је зета потенцијал. У сваком случају, наведена вредност је била просек резултата три појединачна мерења. Када су се вредности зета потенцијала кретале од више од плус 30 мВ до ниже од 30 мВ, одређивани су критеријуми стабилности НП [31].

2.6.6. Анализатор величине честица

Да би се одредила величина честица узорка, извршено је ПСА тестирање на њему након што је лиофилизован и затим диспергован помоћу ултразвучног апарата (СЗ-100, Хориба, Кјото, Јапан).

2.6.7. Анализа дифракције рендгенских зрака (КСРД) Анализа

Синтетизоване наночестице гвожђа из воденог екстракта листа В. леуцокилон подвргнуте су КСРД анализи (Смарт Лаб СЕ, Ригаку, Токио, Јапан) да би се одредила природа као и просечна величина наночестица.

2.7. Одређивање антиоксидативне активности применом ин витро метода

2.7.1. Тест снаге антиоксиданса који смањује ферик-јоне (ФРАП)

Према Оиаизу (1986), уз мању модификацију, процењена је редукциона моћ јона гвожђа [32]. Током 30 мин на 50 ◦Ц, 2,5 мЛ 20 мМ фосфатног пуфера и 2,5 мЛ 1 процента калијум-ферицијанида додато је у 2,5 мЛ екстракта листа В. леуцокилон и помешано са синтетизованим ФеНПс комбинација. Након периода инкубације, смеши је додато 2,5 мЛ 10% м/в трихлоросирћетне киселине и 0,5 мЛ 0,1% м/м гвожђе хлорида пре него што је инкубирана додатних 10 мин. Коначно, УВ-В спектрофотометар је коришћен за детекцију апсорбанције на 700 нм. Као стандард, коришћена је аскорбинска киселина. Сваки узорак је тестиран три пута.

2.7.2. Тест чишћења водоник пероксида

На основу способности воденог екстракта листа В. леуцокилон и његових синтетичких ФеНП-а да хватају водоник пероксид, процењена је антиоксидативна активност ових једињења. Прво, {{0}}.6 мЛ фосфатног пуфера (пХ—7,4) који садржи 4 мМ Х2О2 додато је у 0,5 мЛ стандардне аскорбинске киселине у познатој концентрацији, као и епрувете које садрже биљне екстракте у различитим концентрацијама у распону од 100 µЛ до 500 µЛ (пХ—7,4). Коришћењем фосфатног пуфера и слијепог раствора без водоник-пероксида, проценили смо апсорбанцију раствора на 230 нм након 10 мин. За креирање контроле уместо узорка или стандарда коришћен је фосфатни пуфер [33]. Сваки узорак је тестиран три пута. За израчунавање процента инхибиције коришћен је приступ формуле.

2.7.3. ДППХ чишћење слободних радикала

Тест В. леуцокилон екстракт листа и синтетизовани ФеНП су тестирани на њихову способност да уклоне слободне радикале коришћењем ДППХ радикала као реагенса [34]. Узорци су комбиновани са раствором ДППХ радикала (60 М) у етанолу (100 µЛ) у различитим концентрацијама (в/в). УВ-Вис спектрофотометар је коришћен за мерење апсорбанције смеше на 517 нм након 30 минута инкубације у мраку на собној температури. Као стандард за експеримент коришћена је аскорбинска киселина. Следећа једначина је коришћена за одређивање активности уклањања ДППХ сваког узорка:

где Ац представља апсорбанцију контролне реакције, која се изводи мешањем 100 Л етанола са 100 Л раствора ДППХ, а Ат представља апсорбанцију испитног узорка. Експерименти су спроведени у тројкама. Вредност ИЦ50 је израчуната за сваки узорак. На виши ниво активности слободних радикала указује реакциона смеша која има нижу апсорпцију.

2.7.4. Анализа фосфомолибдена (ПМ).

Укупна антиоксидативна активност је одређена применом Прието ет ал., 1999, стандардне технике. Свака епрувета која садржи 3 мЛ дестиловане воде и 1 мЛ раствора молибдатног реагенса добија водени екстракт листа В. леуцокилон и његових ФеНП-а у различитим концентрацијама у распону од 100 µЛ до 500 µЛ. Ове епрувете су инкубиране 90 мин на 95 ◦Ц. Апсорбанција реакционе смеше је мерена на 695 нм након што су ове епрувете подешене на собну температуру током 20-30 минута након инкубације. Референтни стандард је била аскорбинска киселина [35].

2.8. Евалуација ин витро антиинфламаторне активности

Анти-инфламаторни ефекат воденог екстракта листа В. леуцокилон и његових генерисаних ФеНП-а је процењен коришћењем методе денатурације протеина коју су описали Елиас ет ал., 1988, уз мале модификације [36]. Као стандардни лек, коришћен је диклофенак натријум. Реакциона смеша која се састоји од 2 мЛ познате концентрације произведених ФеНП (100 г/мЛ) са стандардним диклофенак натријумом (100 г/мЛ) и 2,8 мЛ физиолошког раствора пуферованог фосфатом (пХ 6,4) помешана је са 2 мЛ свежег кокошијег јајета. албумин (1 мМ) и инкубиран на 27 ± 1 ◦Ц током 15 мин. Денатурација је изазвана стављањем реакционе смеше у водено купатило на 70 ◦Ц током 10 мин. После хлађења, мерена је апсорпција на 660 нм коришћењем двоструко дестиловане воде као слепог узорка. Сваки тест је изведен три пута. За израчунавање процента инхибиције денатурације протеина коришћена је следећа формула:

где, Ат=апсорбанца тест узорка; Ац=апсорпција контроле.

2.9. Одређивање цитотоксичне и антиканцерогене активности наночестица гвожђа коришћењем МТТ теста

Процењен је ефекат В. леукоксилона и његових синтетизованих ФеНП-а на одрживост неканцерозних ћелија фибробласта Л292 и његову антиканцерогену активност на рак коже (А375), рак плућа (А549) и орални карцином (КБ-3-1) користећи стандардни МТТ тест, према Цармицхаел ет ал., (1987) [37]. Све ћелијске линије су добијене из Националног центра за науку о ћелијама (НЦЦС), Пуне, Индија. Вредности процента инхибиције раста ћелија (ИЦ50) су изведене коришћењем криве доза-одговор за сваку ћелијску линију, а следећа формула је коришћена за израчунавање процента инхибиције раста. Конверзија МТТ-а у љубичасти формазански производ помоћу митохондријалне дехидрогеназе здравих ћелија је основа овог експеримента [38].

2.10. Ин витро студија зарастања рана коришћењем теста огреботина

Способности ширења и миграције ћелија Л292 ћелијске линије изазване узорцима са познатим концентрацијама биљног екстракта и наночестица гвожђа испитане су у тренутном истраживању [39]. Плоче за културу животињских ћелија са ДМЕМ медијумом допуњеним 10 процентом ФБС и 2 процента Пен-Стреп антибиотика (Дармстадт, Немачка) коришћене су за почетак процеса ћелијске културе. Стерилни пластични врх пипете је коришћен за гребање једнослојног конфлуента ћелија након што су нарасле на отприлике 50,000 ћелија по мл. ПБС раствор је коришћен за уклањање нежељених остатака ћелија. Као негативна контрола коришћене су нетретиране ћелије, док је стандардна аскорбинска киселина коришћена као позитивна контрола за узорке полимера познате концентрације. У наредна 24 х ћелије су држане на 37 ◦Ц са 5 процената ЦО2. За испитивање релативне миграције ћелија и затварања ране, изгребани слојеви ћелија су инкубирани и снимљени у интервалима од 0 х до 6 х до 12 х и 24 х. Мерење МагВисион Софтваре-а (Кс64, 2016, Магнус, Њу Делхи, Индија) калибрација у резолуцији 4× коришћено је за квантификацију удаљености размака. Да би се одредило затварање ране и стопа миграције, коришћена је формула приказана у наставку:

у погледу следећег: А0х=површина ране мерена непосредно након гребања; АТх=површина ране мерена након х сати; Рм=брзина миграције (µм/х); Вф=почетна ширина ране (µм); и Т=време миграције (сат).

2.11. Статистичка анализа

Подаци су представљени као средња стандардна девијација и стандардна грешка, а сваки експеримент је изведен три пута. СПСС верзија софтвера 20 је коришћена да се изврши једносмерна анализа варијансе (АНОВА) на разлике у средњим резултатима које су постојале између група.

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел: плус 86 15292862950

ПРОДАВНИЦА:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп