Екстракт Херба Цистанцхе побољшава статус митохондријалног глутатиона и дисање у срцима пацова, са могућом индукцијом раздвајања протеина

Увод

Реперфузија претходно исхемијског миокарда изазива низ митохондријалних промена, укључујући повећану производњу реактивних врста кисеоника (РОС), Ца2+преоптерећење и смањење производње аденозин трифосфата (АТП), што све може довести до некрозе и/или смрти ћелије посредоване апоптозом (Редегелд ет ал., 1992; Лемастерс ет ал., 1998). Пошто митохондрије играју кључну улогу у одређивањуУ вези са судбином кардиомиоцита након изазова исхемијом/реперфузијом (И/Р), заштита од И/Р повреде миокарда стога треба да буде усмерена ка очувању структурног и функционалног интегритета митохондрија. Одржавање митохондријалног енергетског метаболизма након И/Р изазова је посебно важно јер контрактилна функција срца скоро у потпуности зависи од АТП-а генерисаног митохондријама. Кардиомиоцити који су живи, али се не контрахују, од врло су мале користи.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЈАЧАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Херба Цистанцхе, цела осушена биљкаЦистанцхе десертицолаИЦ Ма (Оробанцхацеае), је паразитска биљка која расте углавном у пустињским областима северне и североисточне Кине. Херба Цистанцхе, класификована као биљка која „окрепљује Јанг“ у кинеској медицини, преписује се за недостатак бубрега, женски стерилитет и затвор који настаје услед сувоће црева код сенилних пацијената (Цхен, 1998). Досадашње студије у нашој лабораторији су показале да метанолекстракт Херба Цистанцхеповећава капацитет генерисања АТП миокарда (Леунг & Ко, 2008) и штити од И/Р повреде миокарда код пацова (Леунг, 2006). Док је стимулација капацитета за генерисање АТП-а била упоредна са повећањем митохондријалног транспорта електрона (Леунг & Ко, 2008), кардиопротекција против И/Р повреде коју је пружио третман Херба Цистанцхе била је повезана са смањењем смањења АТП-а у миокарду (Леунг, 2006). У овој студији, да бисмо дефинисали улогу митохондрија у кардиопротективном деловању Херба Цистанцхе, истражили смо ефекат третмана Херба Цистанцхе на статус митохондријалног глутатиона, садржај Ца2+, мембрански потенцијал и брзину дисања у срцима пацова. .

материјали и методе

Биљни материјал

Херба Цистанцхе је купљена од локалног (са седиштем у Хонг Конгу) трговца травама (Лее Хоонг Кее). Добављач је потврдио аутентичност биљке, а узорак ваучера (ХКУСТ00301) депонован је на Одељењу за биохемију Универзитета науке и технологије у Хонг Конгу (ХКУСТ). Екстракција биљке метанолом је спроведена на основу претходних студија које су показале да је такав екстракт побољшао стварање митохондријалног АТП-а и заштитио од И/Р повреде у срцима пацова (Леунг, 2006; Леунг & Ко, 2008). Укратко, Херба Цистанцхе (400 г) је исечена на мале комаде и екстрахована загревањем под рефлуксом у 300 мЛ метанола на 60 степени током 2 сата, као што је претходно описано (Леунг & Ко, 2008). Поступак је поновљен два пута. Сакупљени екстракт је осушен упаравањем растварача под сниженим притиском; принос је био 42% (в/в) у односу на количину сировог биља. Екстракт је чуван на 4 степена до употребе. Иако се кинеско биље традиционално екстрахује водом за оралну конзумацију, метанол је коришћен у нашој ранијој студији због погодности у обради и складиштењу узорака (Иим & Ко, 2002), а ми смо открили да је екстракција метанола задовољавајућа у свим аспектима.

Брига о животињама и лечење лековима

Одрасле женке Спрагуе-Давлеи пацова (8–10 недеља старости; 200–230 г) биле су смештене у просторији са контролисаном влажношћу, са циклусом тамно/светло од 12 сати, на приближно 22 степена, и дозвољена им је храна и вода ад либитум. Животиње су насумично распоређене у различите групе, са пет животиња у свакој групи. Пацови су примилиЕкстракт Херба Цистанцхеинтрагастрично ({{0}}.2 г/мЛ у води) на 0.5г/кг или 1.0 г/кг током 3 узастопна дана. Контролне (нетретиране) животиње добијале су само воду. Двадесет четири сата након последње дозе, ткиво срчаних комора је добијено од анестезираних животиња за биохемијску анализу. Све експерименталне протоколе одобрио је Одбор за истраживачку праксу, ХКУСТ.

Припрема митохондријалних фракција

Млевено срчано вентрикуларно ткиво (~{{0}}}.6г) је хомогенизовано у 10- пута (в/в) вишку ледено хладног пуфера сахарозе [0,32М сахарозе, 1мМ етилен диамин тетрасирћетне киселине (ЕДТА), 50 мМ Трис/ХЦл; пХ 7,4] помоћу тефлон-стакленог хомогенизатора, на 4000 о/мин, са 25-30 потеза. Митохондријалне пелете су припремљене од хомогената ткива центрифугирањем на 800×г на 4 степена током 30 минута, а чистоћа је одређена мерењем релативне специфичне активности сукцинат дехидрогеназе и лактат дехидрогеназе у супернатанту, односно пелету, као што је претходно описано (Еванс, 1992). Митохондријалне пелете су суспендоване у 1 мЛ пуфера за хомогенизацију.

Мерење нивоа митохондријалног редукованог глутатиона и оксидованог глутатиона

Нивои митохондријалног редукованог глутатиона (ГСХ) одређени су ензимски коришћењем 5,59-дитиобис(2- нитробензојеве киселине) (ДТНБ) и глутатион редуктазе (ГР), у протоколу модификованом од Гриффитх-а (198{{17} }). Аликвот (210 µЛ) митохондријалне фракције је помешан са 90 µЛ 10% (в/в) 5-сулфосалицилне киселине (ССА) и смеша је центрифугирана на 600 × г током 10 минута. Да би се измерили нивои оксидованог глутатиона (ГССГ), количине од 100 µЛ ССА супернатанта су помешане са 10 µЛ 20% (в/в) 2-винилпиридина и 10 µЛ 60% (в/в) триетаноламина у епруветама за микрофуге. Свака епрувета је остављена да стоји на собној температури најмање 1 х. Реакциона смеша која садржи 0,63 мМ ДТНБ и 0,053 мМ НАДПХ (редукованог никотинамид аденин динуклеотид фосфата) у фосфатном пуферу (0,1 М, са 5 мМ На2 ЕДТА; пХ 7,5) је претходно инкубирана на 30 степени у трајању од 2 минута. Аликвот (30 µЛ) супернатанта узорка ССА (укупни глутатион) или ГССГ узорка је додат у бунар микротитарске плоче 96- бунара и 180 µЛ претходно загрејане реакционе смеше, која садржи 0,525 У/ мЛ ГР, је следеће додат. Промене апсорпције на 412 нм су праћене спектрофотометријски током 5 минута. Концентрације ГСХ и ГССГ су процењене на основу калибрационих кривуља коришћењем ГСХ и ГССГ [растворених у 3% (в/в) ССА] као стандарда и изражене као нмол/мг протеина. Нивои ГСХ су процењени одузимањем двоструке количине ГССГ од укупног ГСХ.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Мерење митохондријалног садржаја Ца2+

Садржај митохондријалног Ца{{0}} је мерен коришћењем Ца2+-осетљиве флуоресцентне сонде, Флуо{2}}Н АМ естра (Молецулар Пробес, Еугене, ОР) коришћењем Вицтор2 Мулти-Лабел Цоунтер (Модел 1420; ПеркинЕлмер, Турку, Финска), како је описано у Мензе ет ал. (2005). Константе дисоцијације Ца2+ (вредности Кд) су одређене коришћењем комплета за калибрацију Ца2+ важећег у опсегу концентрација 1–1000 µМ; процењене вредности Кд биле су 90–100 µМ, са високом поузданошћу, према подацима произвођача комплета. Аликвот (25 µЛ) митохондријалне фракције (0,5 мг протеина/мЛ коначна концентрација) је помешан са 25 µЛ инкубационог пуфера {100 мМ КЦл и 30 мМ МОПС [3-(Н-морфолино)пропансулфонске киселине]; пХ7,2} у 96-црној микротитарској плочи са бунарима. Смеша је инкубирана на 25 степени 15 мин; Затим је додато 25 µЛ дигитонина (50 µг/мЛ) и 25 µЛ Флуо-5Н АМ естра (1 µМ у 0,005% (в/в) Плурониц Ф-127). Олакшавајући мембранску пермеацију, дигитонин је посредовао у митохондријском уласку флуоресцентне боје. Открили смо да су нивои Флуо{34}}Н у митохондријалним препаратима срца пацова повећани 20-путу у присуству дигитонина. Реакционе смеше су инкубиране на 25 степени током 30 минута, а очитавања флуоресценције су мерена на таласној дужини ексцитације од 488 нм и таласној дужини емисије од 532 нм. Садржај митохондријалног Ца2+ је процењен коришћењем калибрационе криве и изражен као µмол/мг протеина.

Мерење потенцијала митохондријалне мембране

Потенцијал мембране (ΔΨм) је процењен методом модификованом у односу на Бонавита ет ал. (2003), користећи флуоресцентну боју, липофилну катјонску сонду 5,596,69- тетрахлоро-1,193,39-тетраетилбензимидазолилкарбоцијанин јодид, који се обично назива ЈЦ-1. Аликвоти (50 µЛ) митохондријалних фракција (подешених на 1 мг протеина/мЛ) су инкубирани на 37 степени са 50 µЛ раствора супстрата (који садржи 6 мМ пирувата и 6 мМ малата), 25 µЛ претходно третираног раствора аденозин дифосфатенозин 0МА (3) и 25 µЛ 3 µМ ЈЦ-1, у мраку. Вредности ΔΨм су добијене мерењем флуоресценције на 535 нм (ФЛ1) наспрам 580 нм (ФЛ2), користећи Вицтор2 МултиЛабел Цоунтер. ЈЦ-1 формира агрегате у митохондријама, што доводи до високих вредности флуоресценције ФЛ2 и указује на нормалан митохондријски потенцијал. Губитак ΔΨм доводи до смањења флуоресценције ФЛ2 (ЈЦ-1 агрегати у мањој мери) и истовременог повећања ФЛ1 флуоресценције (од ЈЦ-1 мономера). Подаци су изражени као односи вредности флуоресценције ФЛ1/ФЛ2. Карбонил цијанид м-хлорофенилхидразон (ЦЦЦП), ΔΨм-колапсирајући агенс, коришћен је за валидацију теста.

Мерење митохондријалног дисања

Брзина дисања митохондрија је мерена на 37 степени коришћењем Хансатецх Окиграпх-Плус инструмента опремљеног кисеоником типа Цларк (Сарасота, ФЛ, САД). Митохондријалне фракције (0.6мг протеина/мЛ) су суспендоване у пуферу за дисање који садржи 125мМ КЦл, 20мМ МОПС, 10мМ Трис, 0.5мМ етилен гликол тетрасирћетне киселине (ЕГТА) и 2мМ КХ2ПО4; пХ 7.2. После инкубације на 37 степени током 2 минута, сваки узорак је добио 50 µЛ раствора супстрата (5 мМ пирувата и 5 мМ малата). Брзине дисања су мерене у присуству (стање 3) 1 мМ АДП и након фосфорилације свих АДП у АТП (стање 4). Однос стопе респирације Стање 3: Стање 4 је индекс респираторне контроле, који указује на чврстоћу спреге између дисања и фосфорилације (Јавадов ет ал., 2005; Кувабара ет ал., 1997). Пре додавања раствора супстрата, мерена је брзина дисања стања 1 до почетка респирације стања 2, а брзина дисања стања 2 је процењена пре додавања АДП-а.

Статистичка анализа

Подаци су анализирани једносмерном анализом варијансе (АНОВА) за вишеструка поређења група. Вредности најмање значајне разлике (ЛСД) су коришћене да би се идентификовале значајне разлике између две групе када су п вредности биле < 0.05.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Резултати

Као што је приказано на сликама 1 и 2, третман са метаноломекстракт Херба Цистанцхе({{0}}.5 или 1.0г/кг/дан×3) значајно је побољшао статус митохондријалног глутатиона у срцима пацова, што је доказано повећањем нивоа ГСХ у зависности од дозе (11–30%) и смањењем у Нивои ГССГ (31%).

Третман Херба Цистанцхеом је у зависности од дозе смањио нивое митохондријалног Ца2+ у срцима пацова у поређењу са контролама; супресија је била 41% при дози од 1.0 г/кг (слика 3).

Третман Херба Цистанцхе повећао је митохондријални ΔΨм, о чему сведочи смањење (14–16%) у односу ФЛ1/ФЛ2. ЦЦЦП (100 µМ) је изазвао ΔΨм колапс, на шта указује повећање односа ФЛ1/ФЛ2 (Слика 4).

Третман Херба Цистанцхепобољшано митохондријално дисање, о чему сведочи значајно већа стопа дисања стања 3 (84%) код тест животиња у поређењу са контролама (Табела 1). Нивои респирације стања 2 и стања 4 су повећани за 47 и 80%, респективно, али је стимулација респирације стања 4 потпуно потиснута 1 мМ гванозин-5'-дифосфатом, инхибитором одвајајућег протеина 2/3. Третман Херба Цистанцхе није утицао на индекс респираторне контроле, како се процењује односом стопе дисања стања 3/стање 4.

Дискусија

Митохондрије изоловане из срца пацова третираних Херба Цистанцхе су показале побољшан статус глутатиона, на шта указују повећани нивои ГСХ и смањени нивои ГССГ. Одржавање редокс статуса митохондријалног глутатиона је критично за кардиопротекцију од И/Р повреде (Цхиу & Ко, 2003). Садржај цитосолног Ца2+ се повећава током исхемије миокарда, преко узимања Ца2+ унипортера унутрашње мембране (Атака ет ал., 1992; Гровер ет ал., 1990), што доводи до митохондријалног Ца{{6} } акумулација. Наши резултати показују да је третман са екстрактом Херба Цистанцхе побољшао редокс статус митохондријалног глутатиона и смањио ниво митохондријалног Ца2+, што може пружити заштиту од И/Р повреде миокарда (Леунг, 2006). Немогућност лечења Херба Цистанцхе, при вишој дози од 1,0 г/кг, да додатно смањи нивое ГССГ и Ца2+, може бити повезана са постојањем самоограничавајућих регулаторних механизама који утичу на редокс потенцијал глутатиона и статус калцијума у митохондријама.

Митохондрије стварају електрохемијски градијент протона преко унутрашње мембране, транспортом електрона. Овај градијент користи АТП синтаза да фосфорилише АДП у АТП. Смањен потенцијал митохондријалне мембране, као код хипоксије/реоксигенације након повреде култивисаних кардиомиоцита (Цхиу ет ал., 2008), резултира смањењем стварања АТП-а. Третман Херба Цистанцхе, који може повећати потенцијал митохондријалне мембране миокарда, вероватно повећава стварање АТП-а, посебно током постисхемичне реперфузије. Опет, постојање самоограничавајућег регулаторног механизма може објаснити зашто ефекти третмана Херба Цистанцхе на потенцијал митохондријалне мембране нису зависни од дозе.

Третман Херба Цистанцхе је у великој мери повећао стопу дисања државе 3 у митохондријама срца пацова, као што је процењено потрошњом кисеоника. Овај налаз је у складу са резултатима добијеним ин витро и ситу мерењима капацитета производње митохондријалног АТП (Леунг & Ко, 2008). Интригантно, иако је третман Херба Цистанцхе смањио стабилан ниво АТП-а у миокарду (подаци нису приказани), третман је побољшао стварање митохондријалног АТП-а. Укључивање неповезаног дисања може објаснити ова нескладна запажања. Неспрегнута оксидативна фосфорилација се дешава када се протони померају преко унутрашње мембране митохондрија назад у митохондријску матрицу, чиме се распршује мембрански потенцијал формиран у ланцу транспорта електрона. Ово резултира смањењем протонске покретачке силе која покреће формирање АТП-а (Гарвеи, 2003). Као последица тога, концентрација Ца2+ и производња РОС у митохондријима су драматично ослабљени (Тесхима ет ал., 2003). Ова сугестија је у складу са резултатима ове студије, која је показала смањење нивоа митохондријалног Ца2+ у срцима третираним Херба Цистанцхе. Што се тиче неспрегнутог дисања, синтеза отцепљених протеина (УЦПс) може бити индукована третманом Херба Цистанцхе. Познато је да УЦП раздвајају оксидативну фосфорилацију и експресију УЦП1 у срцима трансгених мишева заштићених од оштећења миокарда изазваног И/Р (Хоертер ет ал., 2004). Ефекат раздвајања УЦП-а био је инхибиран пурин нуклеотид дифосфатима и трифосфатима (као што су АДП, АТП, гванозин дифосфат (ГДП) и ГТП) (Ецхтаи ет ал., 2002). У овој студији, митохондријски параметри као што су мембрански потенцијал и брзина дисања мерени су у присуству АДП (као супстрата); ефекат раздвајања УЦП-а је стога инхибиран. Међутим, када је измерена брзина дисања митохондријалног стања 4 у одсуству АДП-а, ова стопа је била виша у митохондријама припремљеним од срца третираних Херба Цистанцхе него у срцима нетретираних контрола. Стопа дисања у стању 4 одражава потрошњу кисеоника у митохондријама када протони цуре назад у матрикс митохондрија преко механизма који не укључује Ф1 Ф0 -АТПазу (Гарвеи, 2003). Могуће учешће УЦП-а у повећању респирације стања 4 изазвано Херба Цистанцхе подржано је налазом да је ово побољшање потиснуто БДП-ом (Бенто ет ал., 2007).

У закључку, третман са Херба Цистанцхе може побољшати статус митохондријалног глутатиона, смањити ниво митохондријалног Ца2+ и повећати потенцијал митохондријалне мембране и брзину дисања у срцима пацова. Побољшање статуса митохондријалног глутатиона и функционалне способности, као и претпостављена индукција УЦП, могу бити повезани са кардиопротекцијом коју пружаТретман Херба Цистанцхенакон И/Р повреде.

ПРИРОДНА БИЉКА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%