Високо осетљива и еколошки одржива ХПТЛЦ метода реверзне фазе за одређивање хидрокинона у комерцијалним кремама за избељивање

Контакт:ali.ma@wecistanche.com

Мохамед Х. Алкарни 1, Правез Алам 1, Фаииаз Схакеел 2, Ахмед И. Фоудах 1 и Султан Алсхехри 2,*

Апстрактан: Хидрохинон(ХДК) је природно средство за депигментацију, које се обично користи у препаратима за тонирање коже. Сигурност и зеленост аналитичких метода ХДК квантификације нису разматрани у претходној литератури. Због тога је веома осетљив и еколошки зеленији тест танкослојне хроматографије високих перформанси реверзне фазе (РП-ХПТЛЦ) заснован за ХДК процену у четири различите комерцијалнеизбељивањекреме (ЦВЦ). Бинарна мешавина етанол-вода (60:40, в·в−1) је коришћена као систем зеленог растварача. Процена ХДК је извршена на 291 нм. Садашњи тест заснован на РП-ХПТЛЦ био је линеаран у опсегу 20–2400 нг опсега-1. Садашња аналитичка метода је била веома осетљива на основу података детекције и квантификације. Остали параметри валидације, као што су тачност, прецизност и робусност, такође су били погодни за одређивање ХДК-а. Максималне ХДК количине су добијене у ЦВЦ А (1,23 процента в·в−1), затим ЦВЦ Ц (0,81 проценат в·в−1), ЦВЦ Д (0,43 процената в·в−1) и ЦВЦ Б (0,37 процената в·в-1) в−1). Скор аналитичког ГРЕЕннесса (АГРЕЕ) за садашњу аналитичку методу процењен је на 0,91, што указује на одличне еколошке карактеристике садашњег РП-ХПТЛЦ теста. Ови резултати сугеришу да је садашња аналитичка метода веома осетљива и еколошки одржива за квантификацију ХДК у својим комерцијалним формулацијама.

Кључне речи:договорити се;хидрохинон; еколошки одржив РП-ХПТЛЦ; валидација

Екстракт Цистанцхеможе уклонити слободне радикале и спречити накупљање тирозиназе.

Кликните да бистеЦистанцхе ефекти за избељивање

1. Представљање

Хидрохинон(ХДК) је природно једињење, које је присутно у неколико комерцијалних формулација за тонирање коже за лечење мелазме (болести узроковане прекомерном акумулацијом меланина у људској кожи) [1,2]. То је снажно средство за депигментацију и користи се као алтернатива тирозинази [3]. Један је од најчешће коришћених агенаса у лечењу хиперпигментације људске коже [4,5]. Ефективна концентрација ХДК у комерцијалним формулацијама за тонирање коже варира од 1,5 до 2{11}} процента в·в−1[6]. Висока концентрација ХДК (изнад 5 процената в·в−1) изазива локалну иритацију и леукодерму на људској кожи [5,6]. Због његових контроверзних нежељених ефеката, многе земље су забраниле ХДК као аизбељивањеагенс у локалним формулацијама [7]. Ипак, неколико клиничких истраживања сугерисало је различите заштитне ефектеХДКу лечењу различитих кожних хиперпигментарних поремећаја као што су мелазма, пеге, лентигине итд. [8,9]. Узимајући у обзир и предности и ризике ХДК-а, неопходна је његова квантитативна анализа у различитим комерцијалним формулацијама за тонирање коже.

За квантификацију ХДК-а користе се различити фармацеутски тестови, било сам или у комбинацији са другимизбељивањеагенси у кремама за избељивање на тржишту (ЦВЦ). Различити тестови засновани на ултраљубичастој (УВ) спектрометрији су документовани за квантитативну анализу ХДК у комерцијалним производима за избељивање (ЦВП) и фармацеутским препаратима [10–13]. Документован је широк спектар тестова заснованих на течној хроматографији (ХПЛЦ) високих перформанси за одређивање ХДК заједно са његовим етрима у различитим ЦВЦ и ЦВП [14–23]. Такође су успостављене различите волтаметријске методе за истовремено одређивање ХДК и његових етарских деривата у ЦВП [24–29]. ЗаХДКанализа уз његове етарске деривате и другоизбељивањеагенти у ЦВП. Неки електрохемијски базирани наносензори су такође пријављени за ХДК анализу [34,35]. Једна метода заснована на танкослојној хроматографији високих перформанси нормалне фазе (ХПТЛЦ) такође је примењена за квалитативну и квантитативну анализу ХДК у ЦВЦ од стране наше истраживачке групе [1].

Након исцрпне анализе пријављених есеја о ХДК анализи, уочено је да безбедност и еколошка одрживост фармацеутских метода у литератури нису процењене нити разматране за евалуацију. Поред тога, тестови засновани на ХПТЛЦ (РП-ХПТЛЦ) зелене/еколошки одрживе реверзне фазе још увек нису коришћени за проценуХДКу својим ЦВЦ. Еколошки одрживи/зелени тестови засновани на ХПТЛЦ-у нуде многе предности као што су једноставност, економичност, ниски оперативни трошкови, кратко време анализе, паралелна анализа више узорака, јасноћа детекције и смањење токсичности по животну средину у односу на ХПЛЦ и друге аналитичке методе [36–39]. Сходно томе, за ову студију је одабрана РП-ХПТЛЦ метода за одређивање ХДК. За процену профила зелености фармацеутских тестова користе се различити приступи [38–43]. Ипак, само аналитички ГРЕЕннесс (АГРЕЕ) метрички приступ примењује свих 12 принципа зелене аналитичке хемије (ГАЦ) за процену зелености [42].

АГРЕЕ метрички приступ је примењен за процену зелености методе пресентРП-ХПТЛЦ [42]. Стога је овај рад спроведен да би се развила високоосетљива и зелена/еколошки одржива РП-ХПТЛЦ метода за проценуХДКу четири различита ЦВЦ. Зелени профил садашње РП-ХПТЛЦ методе добијен је помоћу АГРЕЕ: Аналитичког калкулатора зелености. Садашњи аналитички тест за ХДК анализу је валидиран у складу са смерницама Међународног савета за хармонизацију (ИЦХ) К2 (Р1) [44].

2. Материјал и методе

2.1. Материјали

Референтни стандард ХДК (чистоћа: 99 процената) је набављен од Флука Цхемица (Дармстадт, Немачка). ХПЛЦ метанол (МеОХ) и етанол (ЕтОХ) набављени су од Алфа Аесар (Тевксбури, МА, САД). ХПЛЦ вода (Х2О) је сакупљена из Милли-К система за пречишћавање воде (Е-Мерцк, Дармстадт, Немачка). Остали коришћени растварачи и реагенси били су аналитичке чистоће. Четири различита ЦВЦ ХДК добијена су са фармацеутског тржишта у Ал-Кхарју, Саудијска Арабија, у јуну 2021. ЦВЦХДКје чуван на хладном и тамном месту на 22 ◦Ц пре почетка експеримената. ЦВЦ су чувани око месец дана пре почетка експеримената.

2.2. хроматографија

РП-ХПТЛЦ дензитометријска квантификација ХДК-а у његовом референтном стандарду и четири различита ЦВЦ-а је спроведена коришћењем ХПТЛЦ инструмента (ЦАМАГ, Муттенз, Швајцарска). Квантитативна анализа ХДК је спроведена на 10 × 20 цм2 стакленим плочама претходно обложеним са РП силика гелом 60 Ф254С плоча (Е-Мерцк, Дармстадт, Немачка). Узорци на ТЛЦ плочама су примећени као траке од 6 мм коришћењем аутоматског апликатора за узорковање 4 (АТС4) (ЦАМАГ, Женева, Швајцарска). Апликатор узорка је опремљен ЦАМАГ микролитарским шприцем (Хамилтон, Бонадуз, Швајцарска). Стопа пријаве за квантитативну анализуХДКодржавана је константна на 150 нЛ с−1. Плоче су развијене у аутоматској комори за развијање 2 (ЦАМАГ, Муттенз, Швајцарска) на удаљености од 80 мм. Систем зеленог растварача за ХДК анализу био је ЕтОХХ2О (60:40, в·в-1). Комора за развијање је претходно засићена парама мобилне фазе 30 мин на 22 ◦Ц. ХДК је детектован на 291 нм. Димензије прореза биле су 4 × 0,45 мм2, а брзина скенирања 20 мм с−1. Сваки експеримент је изведен у три примерка. Софтвер коришћен за обраду података је ВинЦАТс (в. 1.4.3.6336, ЦАМАГ, Муттенз, Швајцарска).

2.3. ХДК калибрациона крива и припрема узорака за контролу квалитета

Одређена количина ХДК (10 мг) је стављена у 100 мЛ ЕтОХ-Х2О (60:40, в·в-1) система зелених растварача да би се постигао основни раствор са концентрацијом од 100 µг мЛ-1. Различите запремине основних раствора су даље разблажене коришћењем ЕтОХ-Х2О (60:40, в·в-1) система да би се постигле концентрације ХДК у опсегу од 20–2400 нг-1. Добијена решења одХДКкоји садрже различите концентрације су уочени на ХПТЛЦ плочама. ХПТЛЦ површина пика за ХДК је добијена за сваки ХДК раствор коришћењем овог фармацеутског теста. Калибрациона крива ХДК је генерисана цртањем ХДК концентрација у односу на његову ХПТЛЦ област. Поред тога, три различита узорка за контролу квалитета (КЦ), као што су узорци ниске контроле квалитета (ЛКЦ; 20 нг опсег−1), средњег квалитета (МКЦ; 600 нг опсег−1) и високог квалитета (ХКЦ; 2400 нг опсег−1) , добијени су одвојено да би се одредили различити параметри валидације за овај фармацеутски тест.

2.4. Обрада узорка за одређивање ХДК у ЦВЦ

ХДК је екстрахован из четири различита ЦВЦ-а усвајањем процедуре објављене у литератури [1]. Прецизно измерене (50 г) количине четири различите ЦВЦ, укључујући А, Б, Ц и Д, пренете су у левак за одвајање одвојено. Сваки ЦВЦ је мућкан у леву за одвајање са МеОХ (3 × 70 мЛ) током периода од 30 мин на 22 °Ц. МеОХ екстракти из сваке ЦВЦ су комбиновани и упарени одвојено до сува под сниженим притиском коришћењем ротационог вакуумског испаривача. Добијени остаци су реконституисани са 10 мЛ МеОХ и чувани у фрижидеру до даље процене. Добијени узорци су подвргнути ХДК анализи коришћењем садашње аналитичке методе на 291 нм.

2.5. Валидатион Параметерс

Садашњи РП-ХПТЛЦ тест за ХДК анализу је валидиран за различите параметре валидације пратећи ИЦХ-К2 (Р1) смернице [44]. ТхеХДКлинеарност је процењена цртањем ХДК концентрација у односу на измерену површину пика. ХДК линеарност је процењена на 11 различитих КЦ узорака од 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 и 2400 нг опсега-1 за овај фармацеутски тест. Параметри ефикасности система за ову аналитичку методу су процењени у смислу фактора ретардације (Рф), фактора асиметрије (Ас) и броја теоретских плоча по метру (Н м−1). Рф, Ас и Н м-1 су добијени на МЦК (600 нг опсег-1), као што је раније објављено у литератури [45].

Тачност за садашњу РП-ХПТЛЦ методу је одређена као проценат опоравка. Проценат опоравка је добијен на ЛКЦ (20 нг опсег-1), МКЦ (600 нг опсег-1) и ХКЦ (2400 нг опсег-1) за садашња аналитичка метода.

Прецизност за садашњу аналитичку методу је оцењена као интра/међудневна прецизност. Прецизност унутар дана одређена је анализом ХДК на ЛКЦ, МКЦ и ХКЦ истог дана за овај аналитички тест. Међудневна прецизност је одређена анализом ХДК на ЛКЦ, МКЦ и ХКЦ три различита дана за садашњи аналитички тест [44]. Свака прецизност је мерена шест пута (н=6).

Робусност је процењена увођењем неких малих промена у системе зелених растварача за садашњу РП-ХПТЛЦ методу. За процену робусности, оригинални ЕтОХ Х2О (60:40, в·в−1) систем растварача је промењен у ЕтОХ-Х2О (62:38, в·в−1) и ЕтОХХ2О (58:42, в·в−1 ) системи растварача, а забележени су и интерпретирани специфични ХПТЛЦ одговор и Рф вредности [44].

Осетљивост за ову аналитичку методу је процењена као границе детекције (ЛОД) и квантификације (ЛОК) коришћењем методе стандардне девијације. ЛОД и ЛОК ХДК за ову аналитичку методу су израчунати, као што је објављено у литератури [44,45].

Максимална чистоћа/специфичност је процењена поређењем вредности Рф и УВ спектра ХДК у ЦВЦ А, Б, Ц и Д са оним стандардног ХДК за садашњи фармацеутски тест.

2.6. Квантитативна анализа ХДК у ЦВЦ

Добијени узорци ЦВЦ А, Б, Ц и Д су примећени на ХПТЛЦ плочама и забележени су њихови ТЛЦ одговори. Подручје врха заХДКу ЦВЦс је забележен. ХДК садржаји у ЦВЦ су израчунати коришћењем калибрационе криве ХДК за садашњу аналитичку методу.

2.7. Евалуација зелености

Карактеристике зелености за ову аналитичку методу су добијене коришћењем АГРЕЕ метричког приступа [42]. АГРЕЕ резултати (0.0–1.0) садашње аналитичке методе су забележени коришћењем АГРЕЕ: калкулатора аналитичке зелености (верзија0.5, Универзитет у Гдањску технологије, Гдањск, Пољска, 2020).

3. Резултати и дискусија

3.1. Развој метода

На основу аналитичких метода у литератури, утврђено је да недостаје еколошки одржива способна/зелена РП-ХПТЛЦ метода за анализу ХДК у комерцијалној козметици. Стога је ова студија спроведена у циљу развоја брзе, високо осетљиве и еколошки одрживе РП-ХПТЛЦ метода за ХДК анализу у ЦВЦ.

За РП-ХПТЛЦ анализу ХДК, различите пропорције ЕтОХ и Х2О, укључујући ЕтОХ-Х2О (50:50, в·в−1), ЕтОХ-Х2О (60:40, в·в−1), ЕтОХ-Х2О (70:30, в·в−1), ЕтОХ Х2О (80:20, в·в−1) и ЕтОХ-Х2О (90:10, в·в−1), процењене су као комбинације зелених растварача за развој поузданог опсега за ХДК анализу. Мешавине растварача су развијене у условима засићења коморе. Из евидентираних података уочено је да ЕтОХ-Х2О (50:50, в·в−1), ЕтОХ-Х2О (70:30, в·в−1), ЕтОХ-Х2О (80:20, в·в− 1), и мешавине зелених растварача ЕтОХ-Х2О (90:10, в·в-1) дале су лош хроматограмХДКса неприхватљивом вредношћу Ас (Као {{0}}.29). Међутим, показало се да комбинација зеленог растварача ЕтОХ-Х2О (60:40, в·в-1) нуди добро разлучен хроматограм ХДК атРф=0.83 ± 0.02 са прихватљивом Ас вредношћу (Ас {{ 12}}.03) (слика 1). Због тога је ЕтОХ Х2О (60:40, в·в-1) оптимизован као мешавине зелених растварача за ХДК анализу у ЦВЦ. Опсези УВ спектра за садашњу РП-ХПТЛЦ методу су снимљени дензитометријски, а максимални ХПТЛЦ одговор је пронађен на 291 нм за садашњу РП-ХПТЛЦ методу. Стога је цела анализа ХДК-а изведена на 291 нм.

3.2. Валидатион Параметерс

Садашњи фармацеутски тест за ХДК квантитацију је валидиран за опсег линеарности, параметре ефикасности система, тачност, прецизност, робусност, осетљивост и вршну чистоћу/специфичност пратећи ИЦХ препоруке [44]. Резултати регресионе анализе најмањих квадрата калибрационе криве ХДК за садашњу РП-ХПТЛЦ методу су представљени у табели 1.ХДКкалибрациона крива је била линеарна у опсегу од 20-2400 нг опсега са коефицијентом детерминације од 0,9997 за ову аналитичку методу. ови подаци сугеришу добру линеарност између ХДК концентрације и њеног одговора.

Параметри системске ефикасности садашње фармацеутске методе су проучавани на МКЦ (600 нг опсег−1), а резултати су укључени у табелу 2. Рф, Ас и Н м−1 вредности за ова аналитичка метода је била предвиђена као 0.83 ± 0.02, 1.03 ± 0.03 и 4987 ± 2.87, респективно. Ови резултати су показали да је садашња аналитичка метода била поуздана за ХДК анализу у ЦВЦ.

Резултати анализе тачности за садашњу аналитичку методу су наведени у табели 3. Проценат опоравка ХДК за садашњу РП-ХПТЛЦ методу је одређен као 101,80 процената, 98,16 процената и 99,38 процената на ЛКЦ, МКЦ и ХКЦ, респективно. . Високе вредности процента опоравка указују на тачност садашње РП-ХПТЛЦ методе за ХДК анализу у ЦВЦ.

Прецизност је одређена као проценат коефицијента варијације (проценат ЦВ), а резултати су приказани у табели 4. Проценти ЦВ-а ХДК-а за садашњу аналитичку методу су предвиђени као 0.91, 0. 59 и 0.26 процената на ЛКЦ, МКЦ и ХКЦ, респективно, за прецизност унутар дана. Проценти ЦВ-а ХДК-а за садашњу РП-ХПТЛЦ методу били су предвиђени као 0.98,{{10}}.69 и 0.32 процента на ЛКЦ, МКЦ и ХКЦ, респективно, за међудневна прецизност. Ниске вредности процента ЦВ указују на прецизност садашње РП-ХПТЛЦ методе за ХДК анализу у ЦВЦ.

Резултати анализе робусности за садашњу аналитичку методу приказани су у табели 5. Проценти ЦВ-а за анализу робусности су предвиђени као 0.59–0,66 процената за садашњу аналитичку методу. Рф вредности ХДК су пронађене у опсегу 0.82–0.84 за садашњу аналитичку методу. Уске промене у Рф вредностима ХДК и нижим процентима ЦВс показале су робусност садашње аналитичке методе за ХДК квантификацију у ЦВЦ.

Осетљивост за садашњу аналитичку методу је забележена као „ЛОД и ЛОК“, а њихове физичке вредности су приказане у табели 1. „ЛОД и ЛОК“ за садашњу аналитичку методу су предвиђене као 6,91 ± 0.23 и 2 0.73 ± 0,68 нг опсег-1, респективно, заХДКквантификацију. Ове физичке вредности "ЛОД и ЛОК" за садашњу аналитичку методу указују на осетљивост за ХДК анализу у ЦВЦ.

Максимална чистоћа/специфичност за ову аналитичку методу је процењена поређењем прекривених УВ спектра ХДК у четири различита ЦВЦ са онима стандардног ХДК. Прекривени УВ спектри стандардних ХДК и ХДК у четири различита ЦВЦ приказани су на Слици 2. Највећи хроматографски одговор за ХДК у стандардним ХДК и проучаваним ЦВЦ уочен је на 291 нм за ову аналитичку методу. Идентични УВ спектри, Рф вредности и таласна дужина ХДК у стандардним ХДК и ЦВЦс указују на вршну чистоћу/специфичност за ову аналитичку методу.

3.3. Анализа ХДК садржаја у ЦВЦ

Применљивост овог аналитичког теста је верификована у квантитативној процени ХДК у ЦВЦ. Хроматограм одХДКиз ЦВЦс је идентификован поређењем његове ТЛЦ тачке на Рф {{0}}.83 ± 0.02 са онима стандардног ХДК-а за садашњу аналитичку методу. Хроматограми ХДК у ЦВЦ А и Б за овај аналитички тест су сумирани на слици 3. ХПТЛЦ хроматограми ХДК у ЦВЦ су идентични онима за чисти ХДК. Неки додатни пикови су се такође појавили у хроматограмима ЦВЦ, који би могли бити повезани са различитим ексципијентима присутним у ЦВЦ. Еколошки одржива ХПТЛЦ метода је била селективна за ХДК анализу на Рф=0.83 без сметњи од других састојака ЦВЦ. Утврђено је да је Рф вредност (0.83) ХДК-а у ЦВЦ-има идентична оној стандардног ХДК-а ({{20}}}}.83), што указује да није било интеракције између ХДК-а и ЦВЦ састојци. Дакле, није било утицаја састојака формулације на квалитет ХДК хроматограма, ЛОД и ефикасност садашње ХПТЛЦ методе ХДК анализе. Присуство додатних пикова у хроматограмима ЦВЦ указује да је садашња метода РП-ХПТЛЦ поуздана за ХДК процену у присуству састојака формулације. Садржај ХДК у ЦВЦ је одређен из калибрационе криве ХДК, а резултати су укључени у табелу 6. Табела 6 такође сумира означену количину ХДК и састојака његове формулације. Садржај ХДК био је највећи у ЦВЦ А (1,23 процента в·в−1), а затим ЦВЦ Ц (0,81 проценат в·в−1), ЦВЦ Д (0,43 процента в·в −1), и ЦВЦ Б (0,37 процената в·в−1). Снимљени садржај ХДК био је много мањи од означене количине (2.00 процента в·в−1) ХДК у проучаваним ЦВЦ. Садржај ХДК у два различита ЦВЦ (А и Б) забележен је као 0,69 процената в·в−1 и 0,34 процената в·в−1, респективно, коришћењем ХПТЛЦ методе нормалне фазе у литератури [1]. Пријављени садржаји ХДК-а су такође били много мањи од означене количине (2.00 процента в·в−1) ХДК-а у литератури [1]. Неколико ЦВЦ или ЦВП се пласира на тржиште под тврдњом да су потпуно природни. Међутим, уобичајено је пронаћи неке синтетичке хемикалије као прељубне супстанце са истим ефектима који се налазе у таквим ЦВЦ или ЦВП као превара. Количина ХДК забележена у овом раду и она забележена у литератури указује на то да проучавани ЦВЦ имају малу количину ХДК и да се не поклапају са тврдњама етикета [1]. Стога се очекује да проучавани ЦВЦ садрже неке синтетичке хемикалије као прељубне супстанце. Све у свему, овај аналитички тест се може користити за ХДК анализу у козметичким и фармацеутским препаратима.

3.4. Процена зелености

За процену зелености фармацеутских тестова користе се различите методе [38–43]. Међутим, само приступ АГРЕЕ користи свих 12 принципа ГАЦ-а за процену зелености [42]. Због тога је профил зелености ове аналитичке методе добијен коришћењем АГРЕЕ калкулатора. Предвиђени АГРЕЕ резултат који користи 12 различитих принципа ГАЦ-а за овај аналитички тест је представљен на слици 4. АГРЕЕ резултат за различите принципе ГАЦ-а је забележен на следећи начин: Третман узорка: 0.61Позиционирање аналитичког уређаја: 1.{{ 9}}Кораци за припрему узорка: 1.00Степен аутоматизације: 0.80Дериватизација: 1.{15}}Количина отпада: 1.{17} }Проток анализе: 1.00Потрошња енергије: 1.00Обрада узорка: 0,51 Извор реагенса: 1.00Токсичност растварача: 1.{27}} Безбедност оператера: 1.00

Укупан резултат АГРЕЕ за садашњу аналитичку методу је забележен као 0.91, што указује на одличну зелену аналитичку методу заХДКквантификацију.

4. Закључак

Метода РП-ХПТЛЦ-дензитометрије развијена је за ХДК анализу у четири различита ЦВЦ ХДК. Садашњи РП-ХПТЛЦ тест је валидиран за различите параметре валидације. Садашња аналитичка метода била је веома осетљива, брза и еколошки одржива заХДКанализа. АГРЕЕ резултат за садашњу аналитичку методу сугерисао је одличан аналитички тест за ХДК квантификацију. Садашњи РП-ХПТЛЦ метода је била погодна за ХДК анализу у четири различита ЦВЦ. Ови резултати су показали да се овај аналитички тест може применити за ХДК анализу у различитим козметичким и фармацеутским препаратима.