Идентификација и функционална анализа бифавона као новог инхибитора потенцијалних пролазних рецептора ванилоидних 4-зависних атерогених процеса

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comда сазнам више

Мазен О.Алхарби, Бидисха Дутта, Рисхов Госвами, Схвета Схарма, Каие. Леи & Схаик О. Рахаман

Атеросклероза, прогресивна инфламаторна болест великих артерија, чини највећи допринос растућем терету смртности и морбидитета повезаних са кардиоваскуларним болестима на глобалном нивоу1. Кључни почетни догађај који доводи до атеросклерозе укључује задржавање модификованих честица липопротеина ниске густине (окЛДЛ) у субендотелним интималним просторима аорте првенствено у тачкама гранања артерија2. Током ране атерогенезе, након ендотелне дисфункције, циркулишући моноцити крви трансмигрирају у подручја интиме и диференцирају се у макрофаге ткива3. У интималним просторима аорте, везивање и узимање окЛДЛ-а од стране макрофага уз помоћ рецептора за чишћење као што су СРА и ЦД36 ствара напредну атеро-инфламаторну петљу која резултира развојем пенастих ћелија оптерећених липидима, критичног процеса у атеросклерози2–8. Каскаде инфламаторних догађаја изазваних пенастим ћелијама доводе до формирања раног масног трака и на крају до појаве узнапредовалих лезија атеросклерозе које карактерише присуство фиброзног поклопца, калцификованог ткива, имуних ћелија, матриксних протеина и липида2–10. Потенцијални пролазни рецептор Ванилоид 4 (ТРПВ4) из потфамилије ТРПВ, неселективни, полимодални катјонски канал пропустљив за Ца2 плус је свеприсутно експримиран у различитим типовима ћелија укључујући макрофаге11–24. Раније познат као осмосензор, сада је познато да ТРПВ4 реагује на различите биохемијске и биомеханичке стимулусе укључујући топлоту, крутост матрикса, осмоларност, факторе раста, пХ и 4 форбол естра11–24. Извештава се да ТРПВ4 посредује у неколико физиолошких функција као што су осећај бола код запаљења и неуропатија18,22,23, диференцијација и миграција миофибробласта 17,25,26 и диференцијација остеокласта у кости27. ТРПВ4 мутације су повезане са неколико каналопатија28–31. Недавне студије наше групе и других су имплицирале могућу улогу овог канала у безброј патолошких стања као што су повреде плућа22,32, формирање пенастих ћелија14,16, фброза ткива17,33, одговор страног тела13 и рак34,35. Раније је приказана атеропротективна улога ТРПВ4, у којој се показало да је функција ТРПВ4 изазвана хемијским агонистом у ендотелним ћелијама повезана са активацијом еНОС и инхибицијом адхезије моноцита на ендотелне ћелије36. Насупрот томе, недостаци у функцијама ТРПВ4 су повезани са бројним атероинфаматорним одговорима, укључујући ендотелну дисфункцију, смањено стварање пенастих ћелија макрофага и васкуларне болести14,16,37–39. Наша лабораторија је недавно идентификовала проатерогену улогу ТРПВ4 при чему он регулише формирање пенастих ћелија макрофага изазвано оксЛДЛ. Механички, показали смо да ТРПВ4 утиче на унос, али не и на везивање окЛДЛ-а у макрофагима на ЦД{55}}независан начин14. У другој студији, известили смо о ТРПВ4-зависној егзацербацији формирања пенастих ћелија изазваних окЛДЛ у присуству липополисахарида и повећању крутости матрикса, обезбеђујући тако везу између механосенсинга и ризика од атеросклерозе16. Узимајући у обзир све заједно, ови налази сугеришу ТРПВ4 као атрактивну мету код атеросклерозе и других болести, чиме се подстиче откриће малих молекулских инхибитора ТРПВ4 који се могу превести у клинички ефикасне терапеутике. Употреба природних једињења у терапији је добила на значају, првенствено вођена потребом за исплативим и биокомпатибилним једињењима у поређењу са тренутно постојећим синтетичким лековима. Природна једињења као што суфлавоноиди, алкалоиди,полифенолаи куркуминоиди утичу на кардиоваскуларне болести путем различитих механизама као што је инхибицијапроинфламаторнисигнале, сензибилизацију инсулина и побољшање профила липида у крви циљањем на АМПК, ЦОКС1/2, еНОС и Нрф2 путеве40–45. Недавне студије више група су идентификовале два флавоноида, берберин и апигенин, као потенцијалне модулаторе активности ТРПВ446,47. Развили смо и користили метод скрининга полу високе пропусности да идентификујемо потенцијалне антагонисте ТРПВ4 из библиотеке природних једињења користећи флуорометријски читач плоча за снимање (ФЛИПР) заснован на Ца2 плус тесту прилива. Овде извештавамо о идентификацији и функционалној анализи Линкедина, флавона, као новог инхибитора атерогених процеса зависних од ТРПВ4-у макрофагима, постављајући на тај начин основу за даља проучавања овог природног једињења као природног антиатеросклеротског малог молекулско једињење. Пријављено је да Линкедин показује неуропротективну,анти-канцероген, иантиинфламаторноулоге48,49. Извештавамо о механизму деловања Линкедина против ТРПВ4 у окружењу формирања пенастих ћелија макрофага користећи бројне биохемијске и ћелијске тестове.

Кликните овде да бисте сазнали више

Материјали и методе Култура животиња и ћелија

Купили смо конгене мишеве дивљег типа Ц57БЛ/6 (ВТ) од Цхарлес Ривер Лабораториес (Вилмингтон, Массацхусеттс, САД). Смернице Комитета за негу и употребу животиња Универзитета Мериленд су поштоване за све експерименте на животињама и аутори су се придржавали смерница АРРИВЕ. За изолацију мишјих резидентних макрофага (МРМ) изазваних тиогликолатом, перитонеална лаважа је сакупљена након 4 дана интраперитонеалне ињекције тиогликолата, а ћелије су одржаване у 10 посто феталног говеђег серума (ФБС) који садржи ДМЕМ7,14,16. Ћелијска линија мишјих макрофага (РАВ264.7) и хумани дермални фибробласти (ХДФ) купљени су од АТЦЦ (Манассас, ВА), и култивисани су, респективно, са ДМЕМ или МЕМ (Гибцо, Валтхам, МА). Макрофаги изведени из мишје коштане сржи (БМДМ) су сакупљени од 6- до 7-недеља старих мишева, као што је претходно описано14,50,51. Укратко, сакупљене су бедрене кости мишева ВТ и ТРПВ4 КО, а коштана срж фемура је испрана комплетним ДМЕМ медијумом са 10 процената ФБС. Те суспендоване ћелије коштане сржи су филтриране кроз цедиљку од 70 µм (БД биосциенце), центрифугиране и држане у медијуму ДМЕМ са додатком М-ЦСФ (25 нг/мЛ) током 7-8 дана на 37 степени да би се омогућила диференцијација у макрофаге.

Реагенси

Линкедин и ГСК1016790А (ГСК101) су купљени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО), а ФЛИПР комплет за анализу калцијума 6 је набављен од Молецулар Девице (Суннивале, ЦА). Људски природни ЛДЛ (ВЛДЛ) је купљен од Стемцелл Тецхнологиес (Ванкувер, Канада). Инкубирали смо ЛДЛ са 5 µМ ЦуСО4 током 12 х на 37 степени да бисмо припремили ЛДЛ оксидовани бакром (окЛДЛ)7,14,16. ДиИ-окЛДЛ, обележен флуоресцентном бојом, купљен је од Инвитроген-а (Карлсбад, Калифорнија), а МЦСФ од Р&Д-а (Миннеаполис, МН). Антитела за ФАЦС анализу су била: ТРПВ4 (Миллипоре; Бурлингтон, МА), ЦД36 (Р&Д; Минеаполис, МН), ТЛР4 и ТЛР6 (Новус Биологицалс; Центенниал, ЦО). ПЕ-коњугована секундарна антитела су из Р&Д (Миннеаполис, МН), а ПЕ-коњуговане контроле изотипа су из БД (Франклин Лаке, Њ). За квантитативну ланчану реакцију полимеразе (кРТ-ПЦР), користили смо комплет РНеаси из КИАГЕН-а (Редвоод Цити, ЦА). Сви прајмери ​​су купљени од Био-Рад (Херцулес, ЦА). Медији за ћелијске културе, производи који се односе на ћелијску културу и вестерн блот реагенси су добијени од Тхермо Фисцхер Сциентифиц (Валтхам, МА).

Цистанцхе против умора

Полу високопропусни скрининг

Извршили смо полу-високо пропусни скрининг за антагонисте Трпв4 из библиотеке од 2000 природних једињења (МССП-2000, Јохнс Хопкинс Цхемцоре) користећи флуорометријски читач плоча за снимање (ФЛИПР) заснован на тесту прилива калцијума14,17. Идентификовали смо гинкетин (ГГТ), као нови антагонист ТРПВ4. Примарни и секундарни скрининг је обављен са РАВ264.7, ХДФ и БМДМ-има да би се проценила способност Линкедина и других кандидата да инхибирају ТРПВ{10}}изазивају Ца2 плус инфукс14,17. Као контроле, користили смо А23187, калцијум јонофор, ТРПВ4 нулл БМДМ, и ГСК219, селективни антагонист ТРПВ417. После секундарног скрининга, идентификовали смо шест једињења која показују више од троструке инхибиције прилива Ца2 уз посредовање ТРПВ4-у поређењу са контролом носача. Линкедин је идентификован као најмоћнији инхибитор активности ТРПВ4. БМДМ (5 × 104 ћелије/бунарићу) су засејане у колагеном обложене (10 µг/мл) 96-јабринске црне плоче и инкубиране на 37 степени, 5 процената ЦО2. На дан експеримента, ћелије су напуњене калцијум 6 бојом у ХБСС, 20 мМ ХЕПЕС, 2,5 мМ пробенецидом и инкубиране 45 минута на 37 степени. После инкубације, библиотечка једињења су додата у сваки бунар до коначне концентрације од 2 уМ. Плоче су инкубиране још 45 минута на 37 степени. Прилив Ца2 плус је индукован додатком 10 нМ агониста ТРПВ4 ГСК1016790А у ћелије које су претходно третиране носачем или једињењем и забележено мерењем ΔФ/Ф (Мак-Мин), као што је претходно описано17. Подаци су приказани као релативне флуоресцентне јединице (РФУ).

Имуноблотови

Перитонеални макрофаги изазвани тиогликолатом засејани су у 10% ФБС који садржи ДМЕМ и инкубирани преко ноћи. Неадхероване ћелије су испране, а на плочу је додат 1 проценат говеђег серумског албумина (БСА) који садржи ДМЕМ и инкубиран 3 х пре третмана Линкедином. Да би се одредила експресија ЦД36, ТРПВ4, ТЛР2, ТЛР4, ТЛР6 и ГАПДХ протеина, лизати целих ћелија су припремљени од ћелија третираних преко ноћи са Линкедином (1 и 5 µМ) или носачем у присуству или одсуству окЛДЛ (25 µг/мл ). Да би се одредили нивои експресије п-ЈНК и ЈНК изазваних ЛПС-ом, ћелије су претходно третиране Линкедином (5 и 10 µМ) током 3 х, а затим стимулисане са Е. цоли ЛПС током 30 минута. Лизати целих ћелија су припремљени од два пута испраних ћелија (ледено хладан ПБС) коришћењем РИПА пуфера са додатком коктела инхибитора протеазе (Тхермо Сциентифиц, МА). Блотс су испитани са зечјим анти-ТРПВ4 (Аломоне Лаб, Јерусалим, Израел), анти-мишјим ЦД36 (Р&Д, Миннеаполис, МН), зечјим анти-ТЛР4, зечјим анти-ТЛР6, зечјим анти-ЈНК и зечјим анти-п- ЈНК примарна антитела (Целл Сигналинг, Данверс, МА) праћена секундарним антителима коњугованим против зеца и миша са ХРП (Р&Д, Миннеаполис, МН). Мрље су скинуте и поново испитане са анти-ГАПДХ ИгГ (1:2000; Санта Цруз, Даллас, ТКС) за контролу пуњења.

Формирање пенастих ћелија.МРМ изазван тиогликолатом је засејан на стакленим покровима у плочи са 12 бунарчића са ДМЕМ, 10 процената ФБС и инкубиран на 37 степени, 5 процената ЦО2 током 2 сата. ГГТ (1 или 10 µМ) је додат ћелијама, а после 3 х инкубације, додат је окЛДЛ (50 µг/мл) и културе су инкубиране преко ноћи на 37 степени. Нативни ЛДЛ (50 уг/мл) је додат у јажице контролне групе и инкубиран преко ноћи. Ћелије су фиксиране у 4 процента параформалдехида, након чега је уследило бојење Оил Ред О да би се квантификовало стварање пенастих ћелија.

Трансдукција вектора аденовируса.Прикупили смо аденовирусне конструкције за експресију Ад(РГД)-мишјег ТРПВ4 (Аде-ТРПВ4; ~1010 пфу/мл) и аденовирусног празног вектора, Ад(РГД)-ЦМВ-нулл (Аде-Вец; 1011 пфу/мл), од Вецтор Биолабс, Малверн, ПА. Користили смо 1 × 108 пфу/мл за све експерименте. За студије стварања пенастих ћелија, перитонеални макрофаги миша су инкубирани са Аде-ТРПВ4 или Аде-Вец у ДМЕМ медијуму током 72 х пре додавања окЛДЛ-а да би се створиле ћелије пене макрофага.

Везивање и унос воловског ЛДЛ.Да би се проценило везивање, перитонеални макрофаги су третирани са две дозе (1 или 10 µМ) Линкедина или вехикулума током 3 сата и инкубирани са ДиИ-окЛДЛ на 4 степена током једног сата. После претходног третмана са Линкедином или носачем, ћелије су инкубиране са ДиИ-окЛДЛ на 37 степени током 30 минута да би се проценило усвајање. Слике су снимљене флуоресцентном микроскопијом (63к), а Слика Ј је коришћена за квантификацију резултата.

Анализа проточне цитометрије.Перитонеални макрофаги изазвани тиогликолатом су култивисани у ДМЕМ, 10 процената ФБС током 24 х. Неадхероване ћелије су испране, додат је медијум без серума и ћелије су инкубиране 2 х, након чега је додат 5 µМ ГГТ или вехикулум, а инкубација је настављена 3 х. Третиране ћелије су састругане са плоче и ресуспендоване у ПБС, 2 процента БСА. Ћелије су инкубиране са примарним антителима 45 минута, након чега је уследила 30 мин инкубација са ПЕ-коњугованим секундарним антителом. За прикупљање података коришћен је ФАЦСЦантоИИ проточни цитометар (БД Биосциенце, Онтарио, Канада). Сви подаци су обрађени помоћу софтвера ФловЈо.

кРТ‑ПЦР.Макрофаги изазвани тиогликолатом су третирани са 5 µМ Линкедином или вехикулом током 3 х; 25 µг/мл окЛДЛ је додато у носач или ћелије третиране Линкедином, а инкубација је настављена преко ноћи. РНеаси Мицро Кит (#74,004) из КИАГЕН-а је коришћен за екстракцију укупне РНК, а Универзални СИБР Греен Оне-Степ Кит из Био-Рад-а је коришћен за реверзну транскрипцију РНК. За прикупљање података коришћен је Ц1000 Тоуцх Тхермал Цицлер (Био-Рад). Експресија гена је одређена као количина ген-специфичне мРНК у односу на ГАПДХ мРНК коришћењем компаративне ЦТ методе описане у билтену за кориснике Био-Рад кРТ-ПЦР система.

Статистичка анализа.Подаци су представљени као средња вредност ±СЕМ биолошких трипликата. Коришћен је софтвер ГрапхПад Присм 7.{1}}, а прорачуни су спроведени коришћењем Студентовог т-теста за две групе или једносмерне АНОВА за више група.

Етичко одобрење.Сви експерименти на мишевима спроведени су у складу са смерницама Одбора за институционалну негу и употребу животиња (ИАЦУЦ) и одобрио их је Одбор за преглед Парка Универзитета Мериленд-Колеџ.

Резултати in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>троструко; стр<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Слика 1. Идентификација Линкедина као новог инхибитора ТРПВ4 из библиотеке природних једињења заснована на полу-високом пропусном скринингу. (А) Дијаграм тока који показује ток посла који је резултирао идентификацијом гинкетина као потенцијалног инхибитора ТРПВ4 из библиотеке од 2000 природних једињења. (Б) Репрезентативни снимак ФлекСтатион 3 који показује инхибиторни ефекат 6 природних једињења на ТРПВ4 агонист (ГСК1016790А) индукованог Ца2 плус прилив у БМДМ напуњене калцијумом 6 бојама током секундарног скрининга. Предтретман са свих 6 једињења показао је инхибиторне ефекте на ТРПВ4-зависан Ца2 плус прилив у поређењу са ћелијама претходно третираним носачем (негативна контрола; вехикул плус ГСК1016790А (10 нМ)) или калцијум јонофором (А23187, 2 μМ). Користили смо селективни антагонист ТРПВ4, ГСК2193874 (10 нМ), као негативну контролу. Сви експерименти су поновљени три пута у четири примерка. РФУ: јединица релативне флуоресценције.

Инхибиција ТРПВ4 ГГТ поништава формирање пенастих ћелија макрофага изазвано оксЛДЛ.Наше претходне студије су показале да је ТРПВ4-изазвао прилив Ца2 плус укључен у формирање пенастих ћелија посредовано окЛДЛ 14,16. Стога смо проценили могућност да је формирање пенастих ћелија инхибирано антагонизацијом активности ТРПВ4 посредованом ГГТ. Мишји перитонеални макрофаги дивљег типа су инкубирани са окЛДЛ да би се изазвало формирање пенастих ћелија у присуству или одсуству ГГТ, и анализирани бојењем уљаном црвеном О. Као што се очекивало, открили смо да је стварање пенастих ћелија повећано за пет пута у макрофагима третираним окЛДЛ у поређењу са природним ЛДЛ (Слика 2А, Б). Међутим, третман макрофага са ГГТ (1 или 10 µМ) пре стимулације са окЛДЛ значајно је смањио проценат пенастих ћелија (Слика 2А, Б). Заједно, ови налази указују на инхибиторни ефекат ГГТ-а на формирање пенастих ћелија макрофага, који је вероватно усмерен на ТРПВ4-изазван прилив Ца2 плус. Штавише, прекомерно смо експримирали ТРПВ4 у ТРПВ4 нултим макрофагима коришћењем аденовирусног конструкта, а затим индуковали формирање пенастих ћелија коришћењем окЛДЛ у присуству ГГТ. Открили смо да је прекомерна експресија ТРПВ4 повећала формирање пенастих ћелија које је било блокирано када смо претходно третирали ћелију са ГГТ, што сугерише да инхибиција стварања проатерогених пенастих ћелија од стране ГГТ зависи од ТРПВ4 (Слика 2Ц, Д).

ГГТ не блокира базални ниво експресије ТРПВ4 и инфламаторних рецептора.Рецептор за чишћење ЦД36 игра главну улогу у преузимању и везивању окЛДЛ и формирању пенастих ћелија, критичним процесима у атеросклерози4–7,54,55. Недавно, све већи број доказа сугерише укључивање рецептора сличних путарини у атеросклерозу2,4,56. Да бисмо истражили да ли је ГГТ блокирао формирање пенастих ћелија утицајем на експресију ЦД36, ТЛР4, ТЛР6 и ТРПВ4, извршили смо имуноблот анализу на две концентрације ГГТ (1 или 5 µМ). Пронашли смо сличне нивое експресије ЦД36, ТРПВ4, ТЛР6 и ТЛР4 у поређењу са нетретираном контролом (Слика 3А-Д). Проточна цитометријска анализа такође није открила значајну разлику у експресији протеина на површини ћелије са или без ГГТ третмана (сл. 3Е–Х, И–Л). Узимајући све заједно, ови резултати сугеришу да ГГТ блокира формирање пенастих ћелија макрофага без инхибиције базалних нивоа површинске експресије ТРПВ4, ЦД36, ТЛР4 и ТЛР6.

Слика 2. Инхибиција ТРПВ4 Линкедином поништава формирање пенастих ћелија макрофага изазвано оксЛДЛ. (А) Мишји перитонеални макрофаги изазвани тиогликолатом третирани су преко ноћи са 50 µг/мл окЛДЛ, након чега је уследила 3 ​​х преинкубација са вехикулом или 1 или 10 µМ Линкедином. Ћелије су третиране са 50 µг/мЛ нативног ЛДЛ (ВЛДЛ) као контрола. Оригинално увећање: 40к. (Б) Квантификација резултата је приказана у (А). н=500 ћелија/услов. Студентов т-тест; ***п<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Уношење окЛДЛ, али не везивање од стране макрофага је потиснуто ГГТ. Пошто се раније показало да ТРПВ4 има улогу у преузимању окЛДЛ и формирању пенастих ћелија14,16, проценили смо да ли третман са ГГТ изазива оштећење везивања окЛДЛ на површини макрофага. ВТ перитонеални макрофаги су третирани ГГТ пре инкубације са ДиИ-окЛДЛ на 4 степена и процењено је везивање. Резултати показују да везивање окЛДЛ на површини макрофага није било значајно ометано третманом ГГТ (1 или 10 µМ) у поређењу са контролом носача (Слика 5А-Ц). Након што смо утврдили да ГГТ не инхибира везивање окЛДЛ, затим смо желели да утврдимо да ли је унос окЛДЛ у макрофагима поремећен третманом ГГТ. Интересантно, наши резултати су показали да постоји значајна инхибиција у преузимању окЛДЛ у макрофагима у ГГТ претходно третираним ћелијама у поређењу са групом која је третирана носачем (Слика 6А, Б). Узимајући све заједно, ови резултати сугеришу да ГГТ блокира унос окЛДЛ-а, али не и везујући се, у макрофагима.

ГГТ блокира експресију ТРПВ4 индуковану окЛДЛ у макрофагима.

Како су наше претходно објављене студије показале да ТРПВ4-изазива Ца2 плус игра улогу у формирању пенастих ћелија макрофага посредованим окЛДЛ14,16, покушали смо да утврдимо да ли ГГТ блокира формирање пенастих ћелија супресијом експресије ЦД36 изазване окЛДЛ, ТЛР2, ТЛР4, ТЛР6 или ТРПВ4. Открили смо да је стимулација макрофага преко ноћи са окЛДЛ резултирала значајном појачаном регулацијом експресије ТРПВ4 протеина у поређењу са ЛДЛ, док је експресија других рецептора (ЦД36, ТЛР2, ТЛР4 и ТЛР6) остала непромењена (слике 4А-Ф). Предтретман ћелија са ГГТ пре стимулације са окЛДЛ селективно је смањио ниво експресије ТРПВ4 протеина у поређењу са третманом носачем (Слика 4А-Ф). Заједно, ови налази сугеришу инхибиторни ефекат ГГТ на експресију протеина ТРПВ4, који може делимично бити укључен у супресију формирања пенастих ћелија помоћу ГГТ.

Слика 3. Третман Линкедином не мења укупни протеин или површинску експресију ТРПВ4, ЦД36 и ТЛР у макрофагима. (А-Д) Имуноблотови лизата целих ћелија макрофага након третмана преко ноћи са 1 или 5 µМ Линкедином или вехикулумом. Репрезентативни имуноблотови показују укупну експресију протеина ЦД36 (А), ТРПВ4 (Б), ТЛР6 (Ц) и ТЛР4 (Д) у ћелијама третираним и нетретираним Линкедином. Изведене су три независне биолошке реплике и 3 експериментална понављања за сваки скуп експеримената. (Е–Х) Проточна цитометријска анализа макрофага третираних преко ноћи са 5 µМ Линкедином или нетретираних показује површинску експресију ТРПВ4 (Е), ЦД36 (Ф), ТЛР4 (Г) и ТЛР6 (Г) у нетретираним ћелијама и ћелијама третираним Линкедином. Анализиране су три независне биолошке реплике и 30,000 ћелија по стању. (И–Л) Квантитативна анализа резултата из (Е–Х). Анализирано двостраним т-тестом са интервалом поверења од 99 процената. Број ћелија по експерименту, 30,000; два експериментална понављања.

ГГТ блокира проатерогену активацију ЈНК2 и упалу у макрофагима. Објављени извештаји из наше лабораторије и других показали су да активација ЈНК2 игра кључну улогу у формирању пенастих ћелија и атеросклерози7,57. Да би се утврдило да ли ГГТ може инхибирати активацију ЈНК1/2, макрофаги су третирани са ГГТ праћеном стимулацијом са ЛПС или окЛДЛ. Резултати имуноблот анализе су показали да третман са ГГТ значајно потискује фосфорилацију ЈНК1/2 изазвану окЛДЛ или ЛПС у поређењу са нетретираном или нативном контролом третираном ЛДЛ (Слика 7А–Д). Показало се да ЈНК активација у макрофагима индукује транскрипцију проинфламаторних медијатора повезаних са атеросклерозом58–60. Да би се утврдило да ли ГГТ може потенцијално да блокира експресију ових проинфламаторних регулатора у макрофагима, ћелије претходно третиране са ГГТ су стимулисане са окЛДЛ, а нивои експресије мРНА ТНФ, ИЛ 6, ИЛ12, ИЛ1 и МЦП1 су квантификовани кРТ-ПЦР анализом. Открили смо значајну смањење нивоа експресије ТНФ, ИЛ12, ИЛ1 и МЦП1 мРНА у ћелијама третираним ГГТ у поређењу са контролама које су третиране носачем (слика 7Е–И). Узети заједно, ови резултати сугеришу да ГГТ блокира проатерогену активацију ЈНК2 и експресију инфламаторног гена као одговор на стимулацију окЛДЛ у макрофагима. Дискусија Познато је да природна једињења као што су флавоноиди и полифеноли модулирају кардиоваскуларне одговоре путем различитих механизама, као што су инхибиција проинфламаторних сигнала, инсулинска сензибилизација, оксидативни статус и побољшање профила липида у крви40–45. Овде извештавамо о идентификацији и функционалној карактеризацији Линкедина, флавона, као новог инхибитора ТРПВ4-зависних протерогених/инфламаторних процеса у макрофагима, засновану на полу-високом пропусном скринингу. Посебно смо показали да и) гинкетин блокира ТРПВ4-посредован Ца2 плус прилив у макрофаге, ии) блокада функције ТРПВ4 гинкетином значајно смањује формирање пенастих ћелија изазвано окЛДЛ супресијом преузимања окЛДЛ у макрофагима, и итинге блокирају) ЛПС- и окЛДЛ-индукована фосфорилација ЈНК1/2, експресија ТРПВ4 протеина и експресија инфламаторних гена. Све у свему, резултати наше студије су показали да гинкетин инхибира проатерогену/инфламаторну функцију макрофага на начин који зависи од ТРПВ{42}}а. Атеросклероза, болест аорте, у почетку је подстакнута упалом и нагомилавањем макрофага оксЛДЛ, изазивајући стварање пенастих ћелија макрофага, које касније напредују у формирање атерома2–10. Пошто је формирање пенастих ћелија критичан процес у атерогенези, разумевање и манипулисање формирањем пенастих ћелија може имати терапеутски потенцијал. Познато је да макрофаги изражавају низ јонских канала и пумпи који продиру у мембрану, укључујући ТРПВ4, механосензитивни полимодални Ца2 плус пермеабилни јонски канал, који се активира и физичким и биохемијским стимулусима11–24. Објављене студије наше лабораторије и других идентификовале су улогу ТРПВ4 у упали макрофага и формирању пенастих ћелија изазваних окЛДЛ14–16,26. ТРПВ4 стога може послужити као одржива мета за слабљење проатерогених процеса.

Слика 5. Линкедин не потискује везивање ДиИ-окЛДЛ за макрофаге. Макрофаги су претходно третирани са носачем или Линкедином (1 или 10 µМ) током 3 х, након чега је уследила инкубација са окЛДЛ обележеним ДиИ (2,5 µг/мЛ) током 1 х на 4 степена. (А) Репрезентативне флуоресцентне микроскопске слике (оригинално увећање, 63×) везивања ДиИ-окЛДЛ на површини мембране макрофага (н=20 ћелија/стање). (Б) Резултати експеримента А приказани као профил дијаграма коришћењем НИХ ИмагеЈ софтвера. (Ц) Квантитативна анализа резултата из А. н=20 ћелија/стања. у побољшању атеросклерозе смањењем ММП-2 и ММП-9 и повећањем нивоа НО и НОС у торакалним аортама пацова52. У овој студији, показали смо да гинкетин блокира ТРПВ4-изазвао Ца2 плус прилив у макрофаге. Механички, показали смо да гинкетин блокира узимање окЛДЛ, али не и везивање, у макрофагима. Студије спроведене ин виво и ин витро сугерисале су критичну улогу ЦД36 као главног рецептора хватача у преузимању окЛДЛ и формирању пенастих ћелија макрофага2–7. Показало се да су ЦД36 нулти мишеви који немају АпоЕ или ЛДЛР мање склони развоју атеросклеротских лезија5,6. Претходне студије наше групе идентификовале су суштинску улогу ЦД36-ЈНК сигналне каскаде у формирању пенастих ћелија макрофага7. Толл-лике рецептори ТЛР2, ТЛР4 и ТЛР6 делују као корецептори у интеракцији са ЦД36 и показало се да су укључени у атерогенезу2,56,63. Испитали смо могућност да је недостатак формирања пенастих ћелија уочен у макрофагима третираним Линкедином био последица смањене експресије ЦД36, ТРПВ4, ТЛР2, ТЛР4 или ТЛР6 протеина. Занимљиво је да третман Линкедином није значајно смањио експресију ЦД36, ТЛР2, ТЛР4 или ТЛР6 протеина на базалним нивоима или под условима стимулисаним окЛДЛ. Међутим, Линкедин је специфично блокирао појачану регулацију експресије ТРПВ4 протеина изазвану окЛДЛ, док је његова експресија на базалним нивоима остала непромењена. Узимајући у обзир све заједно, ови резултати сугеришу да гинкетин блокира формирање пенастих ћелија изазвано окЛДЛ преко механизма независног од експресије ЦД36 и ТЛР, али зависи од ТРПВ4. Претходне студије наше групе и других показале су да је активација ЈНК2 укључена у формирање пенастих ћелија и развој атеросклеротских лезија7,57. Такође је пријављено да је ЈНК укључен у модулацију ММП-9 и ММП-13, који су прекомерно изражени у атеросклеротским лезијама64–68. С обзиром на препознату везу ЈНК у атерогеним процесима, желели смо да утврдимо да ли гинкетин може инхибирати активацију ЈНК. У складу са претходним извештајима, наши резултати су такође показали да гинкетин блокира фосфорилацију ЈНК2 изазвану упалним стимулансима у макрофагима. Овај резултат сугерише могући механизам којим Линкедин блокира стварање пенастих ћелија. Штавише, открили смо значајно смањење регулације у експресији ТНФ, ИЛ12, ИЛ1 и МЦП1 мРНК изазваној окЛДЛ у ћелијама третираним гинкетином у поређењу са контролом носача, наглашавајући потенцијалне антиинфламаторне улоге гинкетина као одговор на окЛДЛ. Укратко, наши резултати су показали да гинкетин инхибира проатерогену и инфламаторну функцију макрофага на ТРПВ4-зависан начин. Ови налази стога јачају образложење за употребу природних једињења у развоју потенцијалних терапеутика и/или хемопревентивних реагенса.

Референце
1. Баркуера, С. ет ал. Глобални преглед епидемиологије атеросклеротичне кардиоваскуларне болести. Арцх. Мед. Рес. 46, 328–338 (2015).
2. Мооре, КЈ & Табас, И. Ћелијска биологија макрофага у атеросклерози. Целл 145, 341–355 (2011).
3. Либби, П. Инфламација код атеросклерозе. Натуре 407, 233–241 (2002).
4. МцЛарен, ЈЕ, Мицхае, ДР, Асхлин, ТГ & Рамји, ДП Цитокини, метаболизам липида макрофага и пенасте ћелије: импликације на терапију кардиоваскуларних болести. Прог. Липид Рес. 50, 331–347 (2011).
5. Феббраио, М. ет ал. Циљано нарушавање ЦД36 рецептора чистача класе Б штити од развоја атеросклеротских лезија код мишева. Ј. Цлин. Инвест. 105, 1049–1056 (2000).
6. Куњатхоор, ВВ ет ал. Рецептори за чишћење класе АИ/ИИ и ЦД36 су главни рецептори одговорни за унос модификованог липопротеина ниске густине који доводи до оптерећења липида у макрофагима. Ј. Биол. Цхем. 277, 49982–49988 (2002).
7. Рахаман, СО ет ал. ЦД36-зависна сигнална каскада је неопходна за формирање пенастих ћелија макрофага. Целл Метаб. 4, 211–221 (2006).
8. Росс, Р. Атеросклероза-инфламаторна болест. Н Енгл Ј Мед. 340(2), 115–126 (1999).
9. Либби П. Молекуларни механизми тромботичких компликација атеросклерозе. Ј. Интерн. Мед. 517–527, 2008.
10. Лусис, АЈ Атеросклероза. Натуре 407, 233–241 (2000).
11. Маттхевс, БД ет ал. Ултра-брза активација ТРПВ4 јонских канала механичким силама примењеним на бета1 интегрине ћелијске површине. Интегер. Биол. (Цамб). 2(9), 435–442 (2010).
12. Схарма, С., Госвами, Р. & Рахаман, СО Те ТРПВ4-ТАЗ сигнална оса механотрансдукције у транзицији епитела и мезенхима изазване крутошћу матрикса и ТГФ 1-. Целл Мол. Биоинж.12, 139–152 (2019).
13. Госвами, Р., Ариа, РК, Бисвас, Д., Зху, Кс. & Рахаман, СО Пролазни рецепторски потенцијал ванилоид 4 је неопходан за одговор страног тела и формирање џиновских ћелија. Сам. Ј. Патхол. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Госвами, Р. ет ал. ТРПВ4 калцијум-пермеабилни канал је нови регулатор формирања оксидованих ЛДЛ-индукованих пенастих ћелија макрофага. Слободни Радиц. Биол. Мед. 110, 142–150 (2017).