Интерференција фенилетаноидних гликозида из Цистанцхе Тубулоса са МТТ тестом

1. Представљање

Паразитска биљкаЦистанцхе тубулоса(Шренк) Р. Вајт (Оробанцхацеаепородица) је широко распрострањена у северноафричким, арапским и азијским земљама [1]. Проистиче изЦ. тубулосаиЦ. десертицолаважни су у традиционалној кинеској медицини, јер се користе за лечење импотенције, стерилитета, лумбага и затвора због инерције дебелог црева [2]. Поред тога, етанолни екстракт одЦ. тубулосапоказало се да има значајан заштитни ефекат против церебралне хипоксије код мишева [3].

Ендотелне ћелије играју кључну улогу у патогенези хипоксичне плућне хипертензије. Линија ендотелних ћелија ЕА.хи926 је значајно слична примарним ендотелним ћелијама. Током нашег проучавања антихипоксичног ефекта етанолног екстракта Ц. тубулоса на ендотелне ћелије ЕА.хи926, приметили смо да 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил){{7 }},5-тест дифенилтетразолијум бромида (МТТ), који се обично користи за процену виталности ћелија у студијама цитотоксичности и цитостатичке активности, дао је опречне резултате показујући повећану виталност ћелија ЕА.хи926 након третмана.

Тачна процена виталности ћелије је од суштинског значаја за идентификацију потенцијалних цитотоксичних или цитопротективних ефеката лека. Стога смо истражили које компоненте присутне у етанолном екстракту Ц. тубулоса могу бити одговорне за конфликтне резултате уочене са МТТ тестом. Изоловали смо две главнефенилетаноидни гликозиди (ПхГс)из етанолног екстракта Ц. тубулоса,ехинакозид (у даљем тексту једињење 1) и актеозид (у даљем тексту једињење 2). Утврдили смо њихов ефекат на виталност ћелија ЕА.хи926 користећи различите методе. Поред тога, да бисмо даље разјаснили који супституент једињења 1 и 2 може бити одговоран за контрадикторне резултате, тестирали смо њихове агликоне, кафеинску киселину (у даљем тексту једињење 3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (у даљем тексту једињење 4), на ЕА .хи926 виталност ћелија коришћењем истих метода.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ИНХИБИЦИЈУ АПОПТОЗЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

2. Резултати и дискусија

2.1. Идентификација једињења

Структуре два једињења изолована изЦ. тубулоса етанолни екстрактидентификовани су анализама нуклеарне магнетне резонанце (НМР) и масене спектрометрије (МС), као што је приказано на слици 1. Једињење 1 је идентификовано као ехинакозид у поређењу са претходно пријављеним НМР (Табела 1) и МС (м/з 785 [М−Х ]− ) подаци [4]. НМР спектри једињења 2 су били веома слични онима једињења 1, осим одсуства -Д-глукопиранозил групе (Табела 1). Једињење 2 (м/з 623 [М−Х]−) је идентификовано каоактеозид[5]. Важно је да оба једињења имају исти агликон, који укључује кафеинску киселину (једињење 3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (једињење 4).

2.2. Тестови виталности ћелија

МТТ и ЦЦК{{0}} тестови су коришћени да се анализира ефекат једињења 1–4 на виталност ћелија ЕА.хи926. МТТ тест је показао да се виталност ћелија ЕА.хи926 значајно повећала након третмана са 25 и 50 μМ једињења 1, 2 или 3 (166,3% и 174,1% за једињење 1, 205,8% и 224,3% за једињење 2, односно 164,8% и 189,6% за једињење 3, респективно, у поређењу са контролним ћелијама (Слика 2А); Надаље, морфолошким прегледом ћелија утврђено је да третман са 50 μМ једињења 1, 2 или 3 повећава формирање љубичастих кристала формазана, који су директна индикација удела живих ћелија (Слика 3). Супротно томе, ЦЦК-8 тест је сугерисао да се виталност ћелија значајно смањила након третмана са 12,5, 25 и 50 μМ једињењем 1, 2 или 3 (75,5%, 45,1% и 43,7% за једињење 1, 85,5%, 51,8% и 34,3% за једињење 2, и 64,5%, 48,2% и 36,4% за једињење 3, респективно, у поређењу са контролним ћелијама (Слика 2Б); Једињење 4 није утицало на виталност ћелија ни у МТТ ни у ЦЦК-8 тесту. Неслагање између резултата добијених са два теста сугерише да један од два теста можда неће тачно одражавати ефекте једињења 1 и 2 на виталност ћелија ЕА.хи926.

2.3. Процена апоптозе од Хоецхста

Бојење Хоецхст 33342 је ћелијски пропусна ДНК мрља која се побуђује ултраљубичастом светлошћу и емитује плаву флуоресценцију на 460 до 490 нм. Кондензовани хроматин апоптотичких ћелија боје се светлије од хроматина нормалних ћелија [6]. Док су контролне ћелије показале равномерно диспергован хроматин, нормалне органеле и интактне ћелијске мембране, ћелије инкубиране са 50 μМ једињења 1, 2 или 3 током 48 х показале су типично бојење апоптотичких ћелија (слика 4А). Насупрот томе, излагање ћелија 50 μМ једињења 4 није повећало број апоптотичких језгара у поређењу са контролним третманом.

2.4. Проточна цитометријска анализа апоптотичких ћелија

Анексин В-ФИТЦ/ПИ тест двоструког бојења идентификује апоптотичке ћелије путем везивања анексина В-ФИТЦ високог афинитета за фосфатидилсерин, који се екстернализује у ћелијама које пролазе кроз апоптозу [7]. У овом тесту, одрживе ћелије се не везују ни за анексин В ни за ПИ и стога нису обојене (доњи леви квадрант), ране апоптотичке ћелије су обојене зелено везивањем анексина В-ФИТЦ (доњи десни квадрант), а касне апоптотичке ћелије обојени су зелено и црвено везивањем анексина В-ФИТЦ за фосфатидилсерин и ПИ за некротичне ћелије, респективно (горњи десни квадрант). Као што је приказано на слици 4Б, ћелије инкубиране са 50 μМ једињења 1, 2 или 3 током 48 х, проценат апоптотичких ћелија порастао је са 3,74% (контролне ћелије) на 10,32%, 12,95% и 11,30%, респективно. У поређењу са контролним ћелијама, једињење 4 није повећало проценат апоптотичких ћелија ЕА.хи926.

У складу са резултатима добијеним ЦЦК-8 тестом и Хоецхст 33342 бојењем, тест проточне цитометрије је показао да једињења 1, 2 и 3 изазивају апоптозу у ћелијама ЕА.хи926. Све у свему, ова запажања сугеришу да повећање виталности ћелија ЕА.хи926 примећено МТТ тестом након третмана једињењима 1–3 представља лажно позитиван резултат.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЈАЧАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦT 12%

2.5. Дискусија

Године 1983, Мосманн је развио колориметријски МТТ тест микроплоче за мерење ћелијске пролиферације и цитотоксичности [8]. Овај једноставан тест и његове модификације сада се увелико користе у лабораторијама за ћелијску биологију широм света. Студије фракционисања у ћелијама сисара су показале да је смањени кофактор пиридин нуклеотида, НАДХ, одговоран за већину смањења МТТ. Ово је потврђено студијама које су користиле целе ћелије [9]. Смањење МТТ је стога повезано са метаболички активним ћелијама и није само повезано са митохондријалним дисањем, већ и са цитоплазмом и не-митохондријалним мембранама укључујући ендосомски/лизозомски одељак и плазма мембрану [10]. Нето позитивно наелектрисање МТТ молекула је примарни фактор за његово ћелијско преузимање преко потенцијала плазма мембране.

Значајно је да МТТ тест повремено можда не одражава тачно стварни ефекат који тестирано једињење има на одређене ћелије. Међутим, хемијске структуре или групе које могу изазвати конфликтне резултате у МТТ тесту нису идентификоване. Недавне студије су показале да би МТТ тест могао потценити антипролиферативни ефекат (-)-епигалокатехин-3-галата, најзаступљенијег полифенола у зеленом чају [11]. У студијама које су користиле МТТ тест за откривање хемоосетљивости тумора, хемотерапијски агенси против рака, као што су епирубицин, паклитаксел, доцетаксел и иматиниб мезилат (Глеевец), показали су повећану виталност ћелија [12,13]. Штавише, неколико студија је известило да одређени биљни екстракти и редокс активни полифеноли могу да ометају МТТ тест јер директно смањују МТТ тетразолијумову со у одсуству ћелија [14].

Потреба да се кристали МТТ формазана растворе пре спектрофотометријске анализе у читачу микроплоче и инхерентна природа реакције крајње тачке ограничавају употребу МТТ теста на одређене примене. Ово је довело до развоја аналога тетразолијума у ​​којима су фенилни делови били украшени негативно наелектрисаним сулфонатним групама, као што је 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро- 5- сулфофенил)-2Х-тетразолијум-5-карбоксанилид (КСТТ), негативно наелектрисана унутрашња со [15] и 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сулфофенил)-2Х-тетразолијум (МТС), слабо кисела унутрашња со блиско повезана са МТТ [16] . Ове модификације су резултирале производњом формазанских производа растворљивих у медијуму културе који су елиминисали захтев за кораком солубилизације пре квантификације. Сходно томе, како је повећано негативно наелектрисање ових молекула смањило њихову способност да се крећу кроз ћелијске мембране [17], средњи акцептори електрона (ИЕА), као што је 1-метокси-5-метил феназин метил сулфат ({{25 }}метокси ПМС) били су потребни да би се олакшала редукција тетразолне боје или да би се повећала брзина редукције.

Недавно је развијена нова генерација тетразолијумових соли растворљивих у води, чији је ВСТ{1}} прототип [18]. ВСТ-1, негативно наелектрисана дисулфонирана унутрашња со која садржи остатак јода, стабилнија је од КСТТ и МТС у присуству 1-метокси ПМС-а, обавезна је ИЕА. Ово је довело до маркетинга ВСТ-1/1-метокси ПМС-а као практичног комплета за пролиферацију ћелија са једним реагенсом. Развијено је неколико других тетразолијумових соли из серије ВСТ, од којих је можда најкориснија ВСТ-8 [19]. Изгледа да ВСТ-8 има веома слична својства ћелијске редукције као ВСТ-1 и продаје се независно као ЦЦК-8 тест. ВСТ-8 је ћелијски непропустан и стога се редукује ванћелијско, путем транспорта електрона од интрацелуларног НАДХ до ВСТ-8 преко плазма мембране посредованог 1-метокси ПМС-ом. Иако су редукција МТТ и ВСТ-8/1-метокси ПМС-а вођена интрацелуларним НАДХ, чини се да се извор НАДХ разликује у оквиру ове две методе. Смањење ВСТ-8/1-метокси ПМС-а у већој мери зависи од малат/аспартатног шатла који повезује циклус митохондријске трикарбоксилне киселине-НАДХ са екстрамитохондријалним простором [20].

У прелиминарним експериментима, потврдили смо да једињења 1, 2, 3 и 4 не могу директно да редукују МТТ тетразолијумову со (није приказано). У овој студији, директан утицај самих једињења на реагенс је елиминисан пажљивим прањем микроплоча са фосфатним пуфером (ПБС) пре додавања МТТ или ЦЦК-8 раствора, као што је назначено у протоколима произвођача. Ипак, резултати добијени коришћењем ове две методе су и даље контрадикторни (слика 2). Као што се очекивало, инкубација ћелија са једињењима 1, 2 и 3 повећала је редукцију тетразолијумове соли у љубичасти формазан, у поређењу са контролном групом (Слика 3), што сугерише да само смањење тетразолијумове соли у присуству специфичног једињења није довољно да се процени способност једињења да омета МТТ тест.

Да би се утврдило да ли једињења 1, 2, 3 и 4 могу да индукују апоптозу у ћелијама ЕА.хи926, процењене су ћелијске морфолошке промене и екстернализација фосфатидилсерина. У складу са смањењем ћелијске виталности примећеним ЦЦК-8 тестом, резултати Хоецхст-овог бојења и анализе проточне цитометрије коришћењем анексина В-ФИТЦ/ПИ сугеришу да је инхибиција раста примећена након третмана једињењем 1, 2 и 3 била због, барем делимично, апоптозе ћелија ЕА.хи926. Наши резултати такође подржавају идеју да је кафеил група присутна у оба једињења 1 и 2 одговорна за контрадикторне резултате добијене МТТ тестом.

Слично нашим налазима, Роттлерин, моћан отварач калијумских канала велике проводљивости, није показао реактивност према МТТ ин витро. Међутим, снажно је појачао формирање кристала формазана унутар ћелија, што је резултат који је био у очигледном сукобу са Ротлерин инхибицијом НФ-κБ и ћелијском пролиферацијом уоченом анализом инкорпорације [3 Х]-тимидина у ДНК [21]. Механизам којим је Роттлерин појачао смањење МТТ-а приписан је његовом ефекту раздвајања митохондрија [22]. Роттлерин има супституентску групу цинамоилне киселине. У поређењу са цинамоил киселином, једињење 3 поседује два додатна хидроксилна остатка, који се налазе на Ц-3 и Ц-4. Стога, ми спекулишемо да механизам којим једињења 1 и 2 изазивају конфликтне резултате у МТТ тесту такође може бити повезан са њиховим ефектима раздвајања митохондрија. Да би се тестирала ова хипотеза, потребне су упоредне студије између једињења 1 и 2 и хемијског растављача, као што је трифлуорокарбонилцијанид фенилхидразон (ФЦЦП).

 ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

3. Експериментална секција

3.1. Реагенси и хемикалије

Једињење 3 (кафеинска киселина у праху, чистоћа=98.6%) је купљено од Цхенгду Пусх Био-Тецхнологи Цо., Лтд. (Ченгду, Кина). Једињење 4 (3,4-дихидроксилфенилетанол–уље, чистоћа=98.5%) је добијено од Цхенгду Муст Био-Тецхнологи Цо., Лтд. (Цхенгду, Кина). МТТ и диметил сулфоксид (ДМСО) су добијени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). ЦЦК-8 тест је купљен од Дојин Лабораториес (Кумамото, Јапан). Комплети за детекцију апоптозе Хоецхст 33342 и анексин В-ФИТЦ/ПИ купљени су од Беиотиме института за биотехнологију (Хаимен, Кина).

3.2. Садни материјал

Ц. тубулосастабљике су сакупљене из префектуре Иутиан, Ксинђанг Ујгурски аутономни регион, Кина. Узорци ваучера су депоновани у Кључну лабораторију за медицину на великим надморским висинама, Трећи војно-медицински универзитет (Чонгкинг, Кина) и оверио их је Ји Зханг са Универзитета традиционалне кинеске медицине у Ченгдуу (Ченгду, Кина).

3.3. Екстракција и изолација биљног материјала

На ваздуху осушене стабљике Ц. тубулоса (0.6 кг) су уситњене у прах и екстраховане са 50% етанолом током 2 х на 70 степени. После уклањања растварача под сниженим притиском, етанолни екстракт (212,5 г) је растворен и суспендован у води (2 Л) и екстрахован са н-бутанолом (2 Л × 3). Екстракт н-бутанола (110 г) је хроматографисан на полиамидној колони и елуиран са етанол/вода (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) дајући пет фракција (А-Е) . Фракција Б (65 г) је фракционисана на ОДС колони; елуирање са етанолом: вода (1:9) одвојено једињење 1 (3 г). Фракција Д (10,5 г) је фракционисана на ОДС колони; елуирање са етанол/вода (1:4) одвојено једињење 2 (1 г).

НМР спектри су снимљени на Брукер Аванце 600 спектрометру у ЦД3ОД са тетраметилсиланом (ТМС) као интерним стандардом. Масени спектри су рађени на БиоТОФ-К масеном спектрометру.

3.4. Ћелијска култура

Ћелијске линије ЕА.хи926 су добијене из Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (Манассас, ВА, УСА). Ћелије су култивисане у медијуму РПМИ 1640, са додатком 10% (в/в) феталног говеђег серума и 1% (в/в) пеницилин-стрептомицина у влажној средини са 5% ЦО2 на 37 степени.

3.5. Виталност ћелија

Вијабилност ћелија је процењена коришћењем МТТ и ЦЦК{{0}} тестова. Једињења 1 и 2, и њихови агликони, кафеинска киселина (3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (4) растворени су у ДМСО до коначне концентрације ДМСО < 0,1% (в/в) у медијуму за културу.

Ћелије ЕА.хи926 су засејане на 96- плоче са бунарима при 4 × 103 ћелија/бунарићу. После инкубације од 24 сата, ћелије су третиране са 6,25-50 μМ једињењем 1, 2, 3 или 4 током 24 сата. Медијум за културу је уклоњен и ћелије су испране два пута физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС). Аликвоти (10 μЛ) основног МТТ раствора (5 мг·мЛ-1) су додати у сваки бунар који садржи 100 μЛ медијума и инкубирани са ћелијама 4 х. После инкубације, медијум је уклоњен и 150 μЛ аликвота ДМСО су додати у сваки бунар да би се кристали формазана растворили. Апсорпција је мерена на 490 нм помоћу читача микроплоче (Био-Тек Синерги ХТ, Винооски, ВТ, САД). Вијабилност ћелија је изражена као проценат смањења МТТ-а, при чему је вредност од 100% додељена апсорбанцији контролних ћелија. Сви експерименти су изведени три пута и представљени као средња вредност ± стандардна девијација (СД).

ЦЦК-8 тест је изведен према литератури са малим модификацијама [23]. Конкретно, ћелије су третиране са 6,25–50 μМ једињења 1, 2, 3 или 4 током 24 х и испране два пута са ПБС пре додавања 10 μЛ ЦЦК-8 раствора и 100 μЛ медија за културу. Након инкубације микроплоче на 37 степени током 2 х, мерена је апсорпција на 450 нм помоћу читача микроплоче. Вијабилност ћелија је изражена као проценат живих ћелија у односу на контролне ћелије (100%). Сви експерименти су спроведени три пута и изражени као средња вредност ± СД.

3.6. Апоптосис Ассессмент би Хоецхст 33342 Бојење

Апоптотичне морфолошке промене примећене су Хоецхст 33342 бојењем. Укратко, ћелије ЕА.хи926 су засејане на 48- плоче са бунарима (2 × 104 ћелије/бунарићу) и третиране са 50 μМ једињења 1, 2, 3 или 4 током 48 х на 37 степени, испране два пута са ПБС, и фиксиран са 4% (в/в) параформалдехида 15 мин на собној температури. После два пута испирања са ПБС, ћелије су обојене са Хоецхст 33342 (10 уг·мЛ-1) током 5 минута на собној температури и два пута испране са ПБС. Језгра обојена Хоецхстом су визуелизована помоћу флуоресцентног микроскопа (Олимп, Токио, Јапан).

3.7. Анализа апоптозе помоћу проточне цитометрије

Апоптотичне ћелије су откривене двоструким бојењем анексина В-ФИТЦ/ПИ и анализом проточне цитометрије. Укратко, након третмана са 50 μМ једињења 1, 2, 3 или 4 током 48 х, ћелије су сакупљене и ресуспендоване у ПБС-у при 1 × 105 ћелија · мЛ-1. После центрифугирања на 500 × г током 5 минута на 25 степени, додато је 195 μЛ анексин В-ФИТЦ пуфера за везивање и 5 μЛ анексина В-ФИТЦ. После лаганог мешања вортексом, смеша је инкубирана 10 минута на собној температури у мраку. После центрифугирања на 500 × г током 5 минута на 25 степени, додато је 190 μЛ ФИТЦ-коњугованог пуфера за везивање анексина В и 10 μЛ ПИ. Након благог мешања вортексом, узорци су анализирани коришћењем ФАЦСЦалибур Флов Цитометра (Бецтон Дицкинсон, Сан Јосе, ЦА, УСА) у року од 30 минута.

3.8. Статистичка анализа

Сви експериментални подаци су изражени као средња вредност ± СД. Значајност разлика између експерименталних узорака и одговарајуће контроле процењена је једносмерном анализом варијансе (АНОВА) коришћењем софтвера СПСС (верзија 11.5). Статистички значај је постављен на п < 0.05.

4. Закључци

Наши резултати сугеришу да би прецењивање броја живих ћелија уочених у МТТ тесту могло прикрити цитотоксичност одређених једињења. Због тога, током процеса скрининга лекова, препоручујемо коришћење различитих метода за одређивање ефекта специфичног једињења на виталност ћелија (као што су ЦЦК-8 и 3 Х-ТдР тестови) како би се избегли генерисање обмањујућих резултата.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПРОМОВИСАЊЕ СЕКРЕТЦИЈЕ ТЕСТОСТЕРОН ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%