Процена интестиналног транспорта екстракта богатог фенилетаноидним гликозидима из Цистанцхе Десертицола преко монослојног модела ћелије Цацо{1}}

Увод

Ћелијска линија Цацо{0}}, која је изведена из хуманих аденокарцинома дебелог црева, показује карактеристике сличне ентероцитима. У нормалним условима, Цацо-2 ћелије се спонтано разликују од зрелих ћелија и формирају нетакнуте монослојеве. Суседне ћелије се пријањају преко чврстих спојева формираних на апикалној страни монослоја, који могу да разликују пасивнои активно транспортовани лекови преко епителног слоја. Због морфолошке и биохемијске сличности са нормалним ентероцитима, монослојеви Цацо{0}} ћелија служе као добро прихваћен ин витро модел за проучавање потенцијала цревне апсорпције и транспортних карактеристика лекова.

За разлику од хемикалија, биљни екстракти (ПЕ) су мешавине чија биолошка активност и активни састојци често нису добро идентификовани. Штавише, својства ПЕ у цревном транспорту, за разлику од својстава његових састојака, уско су повезана са клиничком употребом. Мерење протока за пробни узорак у монослоју Цацо-2 ћелије обично укључује хемијске методе, као што су ХПЛЦ, ЛЦ/МС, итд. Иако су ове методе моћне алатке, оне су сложене, дуготрајне, скупе и повремено захтевају софистицирану опрему. Што је још важније, ни појединачна ни мањинска компонента не могу одражавати ПЕ у целини. Стога је потребно успоставити нови приступ независан од одређивања састојака да би се идентификовале и процениле транспортне карактеристике ПЕ.

Цистанцхе десертицола ИЦ Ма (ЦД), холопаразитска биљка, уобичајена је традиционална кинеска медицина која се углавном користи за лечење недостатка бубрега, телесне слабости и затвора, а ова употреба је званично забележена у кинеској фармакопеји.фенилетаноидни гликозиди (ПхГс), укључујући ехинакозид (ЕЦ), актеозид (АЦ) и изоактеозид (ИС), итд., су класа полифенолних једињења. Сматрају се једним од главних биоактивних састојака врсте Цистанцхе. Фармаколошке студије су показале да је биоактивност ПхГ разнолика и укључује антиоксидативне, анти-заморне, хепатопротективне, имуномодулаторне, антиинфламаторне и неуропротективне ефекте. Међутим, карактеристике цревног транспорта ПхГ нису истражене. У овој студији смо истражили цревну пермеабилност екстракта богатог ПхГ (ПРЕ) из ЦД-а као интегрисаног система и пермеабилност три главна ПхГ (АЦ, ИС и ЕЦ) у диференцираним Цацо-2 ћелијама. Наши резултати су показали да се ПРЕ првенствено транспортује путем слабо апсорбоване пасивне дифузије низ градијент концентрације без ефлукса, што представља фармакокинетичку основу за клиничку примену ПхГ у ЦД-у.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Материјали и методе

Материјали

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) је купљено од Муст Биотецхнологи Цо. (Ченгду, Кина). Дулбеков модификовани Орлов медијум (ДМЕМ), фетални говеђи серум (ФБС) и неесенцијалне аминокиселине (НЕАА) производи Гибцо БРЛ (Гранд Исланд, НИ, САД). 6-ТрансвеллТМ плоче (површина раста уметнуте мембране 4,67 цм2) су добијене од Цорнинг (Цостар) Инц. (Тевксбури, МА, САД). Колаген репа пацова је добијен од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД). Сви реагенси и хемикалије за ХПЛЦ анализу су биле аналитичке чистоће.

Припрема ПРЕ са ЦД-а

ЦД материјал осушен на ваздуху је уситњен у прах и екстрахован перколацијом са 70% етанолом. Фракција богата ПхГ је припремљена као што је претходно описано и екстрахована водом засићеним н-бутил алкохолом. Екстракт течности је концентрован и осушен под сниженим притиском. Макропорозна смола-УВ спектрофотометрија је измерила садржај ПхГ од 78,4%. Коначни узорак је представљао 1,75% приноса сировине према сувој тежини. Добијени узорак је чуван на -20 степени до даље употребе.

Одређивање АЦ, ИС и ЕЦ помоћу ХПЛЦ

Схимадзу ХПЛЦ систем опремљен софтвером за ЛЦ раствор је коришћен за анализу садржаја АЦ, ИС и ЕЦ у ПРЕ. Интерсил Ц18 колона реверзне фазе (4,6 мм × 250 мм, 5 μм) је коришћена и одржавана на собној температури. Мобилне фазе су биле ацетонитрил и вода која садржи 0.1% фосфорне киселине (в/в) са градијентом елуирања (Табела 1) при брзини протока од 1,0 мл/мин. Детектор УВ спектрофотометра је подешен на 334 нм. Да бисмо прецизно одредили флукс АЦ и ИС, развили смо нову методу ХПЛЦ-флуоресцентне детекције (ХПЛЦ-ФЛД). Након структурне анализе и скенирања таласне дужине флуоресценције (подаци нису приказани), добили смо оптималне услове детекције флуоресценције за АЦ (Ек: 338 нм, Ем: 448 нм) и ИС (Ек: 320 нм, Ем: 434 нм).

ХПЛЦ аналитичка метода је валидирана коришћењем следећих карактеристика перформанси: стабилност, линеарност, осетљивост, прецизност (интра- и међудневна варијабилност) и тачност. Аналити у транспортном пуферу су чувани на 25 степени у мраку 24 х и мерена је њихова стабилност. Аналити су били високо стабилни у присуству витамина Ц (0.4%) јер су вредности релативне стандардне девијације (РСД) у областима пикова биле < 3.5%. Једначина линеарне регресије, коефицијент корелације, опсег линеарности, ЛОД и ЛОК за АЦ, ИС и ЕЦ приказани су у табели 2. ЛОД (18–30 нМ) и ЛОК (60–100 нМ) вредности илуструју да су методе ХПЛЦ-ФЛД и ХПЛЦ-УВ веома осетљиве. РСД вредности које изражавају прецизност методе биле су < 2% за варијабилност унутар и између дана, што указује на добру прецизност. За процену опоравка, АЦ, ИС и ЕЦ су додати у транспортни пуфер да би се добила три (висока, средња и ниска) нивоа концентрације. Вредности поврата методе за аналите су сумиране у табели 3. Просечан опоравак се кретао од 90,0% до 96,4%, што указује на добру тачност. У закључку, утврђене ХПЛЦ методе су задовољавајуће у погледу линеарности, осетљивости, прецизности и тачности за квантификацију АЦ, ИС и ЕЦ у транспортном пуферу.

Одређивање ПРЕ биолошким системом

Биотест (укупни антиоксидативни капацитет) заснован је на тесту ФРАП (смањење гвожђа/антиоксидативна моћ) који смо претходно описали [16] и потврђен у смислу линеарности и прецизности (интра- и међудневна варијабилност). Линеарност методе биолошке анализе одређена је на основу калибрационих кривуља. Опсег концентрације линеарности је био 0.0625 − 40 уг/мл (и=0.0258к+0.0968, Р2=0.996). Прецизност утврђене методе биолошке анализе одређена је у смислу интра- и међудневне варијабилности за анализу ПРЕ (10,0 уг/мл). Поновљивост методе унутар дана је одређена на основу пет узастопних одређивања истог дана. Поновљивост између дана је мерена на основу пет узастопних одређивања у три различита дана. Вредности у РСД за прецизност методе биле су 1,014% и 4,72% за интра- и међудневну варијабилност, респективно, што указује на добру прецизност. Према томе, успостављена метода биолошке анализе је задовољавајућа у погледу линеарности, прецизности и тачности за квантификацију ПРЕ у транспортном пуферу.

Ћелијска култура

Цацо{{0}} ћелије су култивисане на 37 степени и 95% релативне влажности у атмосфери која садржи 5% ЦО2 и медијум који се састоји од ДМЕМ, 10% ФБС, 1% НЕАА, 1% Л-глутамина, пеницилина (100 У/мл), и стрептомицин (100 уг/мл). Медијум је мењан сваки други дан током раста и диференцијације ћелија. Ћелије су узгајане у пластичним боцама од 75-цм2 и сакупљене сваких 3-5 дана са 0,05% ЕДТА-трипсина. За експерименте транспорта, ћелије су засејане при густини од 1 × 105 ћелија/цм2 на Трансвелл уметке обложене колагеном. Отприлике 21 дан након сејања, монослојеви су коришћени за експерименте транспорта. Њихов интегритет је одређен мерењем трансепителног електричног отпора (ТЕЕР) преко монослојева помоћу ЕВОМ-а опремљеног ЕНДОХМ-СНАП-ом (Ворлд Прецисион Инструментс, Инц., САД). Вредности ТЕЕР монослоја ћелије Цацо{24}} треба да пређу 500 О∙цм2.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА УМИРАЊЕ И ЛАКСАТИВ ПХГС75% ЕЦХ 30% ДЈЕЛУЈЕ 12%

Транспортни експерименти

Монослој је испран транспортним пуфером (П-пуфер који садржи 10 мМ ХЕПЕС, 1 мМ натријум пируват, 10 мМ глукозе, 3 мМ ЦаЦл2 и 145 мМ НаЦл, пХ 7,4), а затим претходно инкубиран 20 мин. на 37 степени. Након уклањања транспортног пуфера, свеж транспортни пуфер који садржи узорке за тестирање је додат у апикалну (АП) комору (1,5 мл) у АП за базолатералне (БЛ) усмерене студије или БЛ комору (2,5 мл) у БЛ до АП усмерене студије. За АЦ, ИС и ЕЦ тестове користећи ХПЛЦ, аликвот (300 ул) је уклоњен из сваке пријемне коморе у различитим временским интервалима (30, 60, 90 и 120 мин). Комора пријемника је допуњена истом запремином свеже загрејаног (37 степени) транспортног пуфера након сваког узорковања. Сакупљени узорци су чувани на -20 степени за даљу употребу. За ПРЕ одређивање коришћењем биолошке анализе, узети су само узорци на 120 мин. Због нестабилности ПРЕ, АЦ, ИС и ЕЦ, додато је 0,4% (в/в) витамина Ц за стабилизацију узорака да би се одредио садржај АЦ, ИС и ЕЦ помоћу ХПЛЦ, а узорци за ПРЕ биотест су испитан одмах након узорковања. Израчуната је вредност коефицијента привидне пермеабилности (Папп или 'Папп) за сваки узорак.

Анализа података

Папп вредности у АП БЛ или БЛАП смеровима АЦ, ИС и ЕЦ су израчунате на основу следеће једначине: Папп {{0}} (4К/4т)/(АЦ0), где је Папп коефицијент привидне пермеабилности (цм/с) одређен ХПЛЦ. (4К/4т) је стопа појављивања тест једињења (АЦ, ИС или ЕЦ) на страни пријемника (μмол/с); А је површина уметка (цм2); Ц0 је почетна концентрација тестираног једињења на страни донора (μмол/мл). Конкретно, јединица масе „уг“ је коришћена уместо „μмол“ када су израчунате „Папп вредности“. Подаци су изражени као средње вредности ± СД.

Резултати

Композиција АЦ, ИС и ЕЦ у ПРЕ са ЦД-а

Зато што се АЦ, ИС и ЕЦ сматрају главним биоактивнимПхГс врсте Цистанцхе, анализирали смо њихов садржај у ПРЕ помоћу ХПЛЦ-УВ. Репрезентативни хроматограм је приказан на слици 1. Идентификација ових састојака је заснована на поређењу времена задржавања и УВ спектра са онима аутентичних стандарда на таласној дужини од 334 нм. Садржај АЦ, ИС и ЕЦ у ПРЕ износио је 26,60%, 1,84%, односно 32,83%. Дакле, ова три једињења чине 61,27% ПРЕ; надаље, горњи резултати показују да садржај ПхГ у ПРЕ износи 78,4%. Према томе, АЦ, ИС и ЕЦ чине приближно 80% ПхГ у ПРЕ.

Укупни антиоксидативни капацитети ПРЕ, АЦ, ИС и ЕЦ

Студије оантиоксидативна активност ПхГсиз ЦД-а су пријављени, а АЦ, ИС и ЕЦ чине приближно 80% ПхГ у ПРЕ. Дакле, укупни антиоксидативни капацитети ПРЕ, АЦ, ИС и ЕЦ су анализирани и изражени коришћењем ФРАП вредности (× 10–6 ммол). Као што је приказано на слици 2, када је вредност ФРАП била 8 × 10–6 ммол, коначне концентрације ПРЕ, АЦ, ИС и ЕЦ биле су 6,20 уг/мл, 3,14 уг/мл, 22,92 уг/мл и 4,89 уг /мл, респективно, што указује да је укупан антиоксидативни капацитет ова четири узорка рангиран на следећи начин: АЦ > ЕЦ > ПРЕ > ИС. Биоактивност ПРЕ се приписује његовим групама активних састојака (АИГ). За отприлике 60% ПРЕ, АЦ и ЕЦ су показали јачу укупну антиоксидативну активност од ПРЕ и ИС. Пошто ИС (1,84%) чини веома мали део ПРЕ, друге компоненте, као што је слабо антиоксидативни ИС, такође су јасно активне у ПРЕ. Изненађујуће, укупна антиоксидативна активност се скоро 7- пута разликовала између АЦ и његовог изомера ИС, што указује да не само број фенолних хидроксилних група већ и положај фенолних хидроксилних група у молекулу утиче на антиоксидативни ефекат .

Валидација Цацо-2 монослојева

Да би се потврдио систем монослојних ћелија Цацо{0}}, Папп вредности пропранолола (маркер који се добро преноси) и Луцифер жуте боје (лоше транспортован маркер) од АП до БЛ преко Цацо-2 монослоја су биле одређене као 1,51 × 10–5 цм/с и 2,8 × 10–7 цм/с, респективно, и ове вредности су се слагале са онима објављеним у претходним извештајима. Тест активности алкалне фосфатазе је такође потврдио да су монослојеви Цацо{11}} ћелија квалитативно упоредиви са епителијумом танког црева.

Пропустљивост АЦ, ИС и ЕЦ

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 цм/с), док су оне код слабо апсорбованих лекова биле ниске (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Пропустљивост ПРЕ

Горе наведени резултати показују да је укупан антиоксидативни капацитет ПРЕ најмање последица 61,27% АИГ из ПРЕ. Стога смо проценили ТР ПРЕ на основу његове криве концентрација-ефекат укупног антиоксидативног капацитета и израчунали 'Папп вредности да одражавају транспортне карактеристике ПРЕ. 'Папп вредности ПРЕ за АП!БЛ и БЛ!АП биле су (2,16 ± 0.26) × 10–7 цм/с и (3,13 ± 0,29) × 10–7 цм/ с, респективно, што указује да је ово једињење било слабо пропустљиво. Штавише, ефлукс или активни транспорт није био очигледан јер је однос 'Папп БЛ према АП / 'Папп АП према БЛ за ПРЕ био 1,45. Штавише, двосмерни ТР ПРЕ расте линеарно између приближно 300 и 900 уг/мл (слика 5). Недостатак преференције усмерености резултата сугерише да је пасивна дифузија главни транспортни механизам ПРЕ.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Дискусија

У поређењу са високо пречишћеним лековима, ПЕ је генерално мешавина која се састоји од стотина састојака са веома различитим физичкохемијским својствима. Због тога ПЕ испољава систематско, вишециљно и вишеканално синергијско дејство због свог комплексног АИГ-а [21], што отежава анализу транспортних карактеристика ПЕ. Да би научније проценили транспортна својства ПЕ, неки истраживачи су идентификовали више компоненти, а не једну компоненту, у ПЕ [22–24]. Ипак, ограничен број састојака не може одражавати ПЕ као целину. Међутим, одређивање свих компоненти у ПЕ је немогуће. Штавише, ако различите компоненте у ПЕ показују потпуно различите транспортне карактеристике, холистичке транспортне карактеристике ПЕ ће бити тешко идентификовати.

Током 1990-их, системи биолошке анализе су коришћени за процену ТР антимикробних агенаса [25]. До 2005. године, Егучи и његове колеге [26] су проценили антиоксидативну активност екстракта шаргарепе коришћењем БЛ медијума из диференцираних Цацо-2 ћелија; овај приступ је прикладнији за одражавање ин виво ситуација.

На основу претходног извештаја о активности ПхГс и наших резултата (слика 2), ТР АИГ у ПРЕ може се проценити одређивањем укупног антиоксидативног капацитета медијума у ​​пријемној комори. Након експеримената транспорта, открили смо да је ТР ПРЕ био сличан у оба смера, а овај транспорт је био незасићен и слабо апсорбован ('Папп < 1.0 × 10–6 цм/с), и није указују на ефлукс, сугеришући да је пасивна дифузија низ градијент концентрације главни транспортни механизам ПРЕ (слика 5). Штавише, транспортне карактеристике ПРЕ су у складу са онима АЦ, ИС и ЕЦ, ефикасних компоненти које показују антиоксидативну активност у ПРЕ (Слика 4 и Табела 4). Овај резултат је био очекиван и указао је да је садашњи систем биолошке анализе одговарајући и поуздан за процену транспортних карактеристика АИГ-а у ПРЕ у диференцираним Цацо-2 ћелијама.

За разлику од канонске Папп вредности, која се обично користи да одражава транспорт једног једињења, 'Папп вредност добијена из ТР на основу криве концентрације-ефекат не може само да одражава компоненте које продиру у монослојеве са нетакнутом структуром, већ такође укључују друге факторе који се односе на циљну активност, као што су метаболити компоненти, хемијски деградирани производи, па чак и неки цитокини излучени из Цацо{1}} ћелија као одговор на стимулацију која може утицати на циљну биоактивност. Дакле, вишефактор који је горе поменут, а не само транспортоване нетакнуте компоненте, одређује 'Папп вредност. Према томе, „Папп може јаче корелирати са ин виво ситуацијама од канонске Папп вредности. У овој студији смо разјаснили пасивно дифузну и слабо апсорбовану природу ПРЕ на основу његове 'Папп вредности, а ова природа може бити повезана са високом дозом и дугим периодом клиничког лечења ЦД-а. Ипак, ови налази ће пружити систематичније смернице за клиничаре у примени ЦД-а када су идентификоване само транспортне карактеристике већине АИГ-а у ЦД-у, а не само ПхГ.

Међутим, одабрана ставка биоактивности мора бити довољно осетљива да би се детектовала у медијуму пријемне коморе, што представља изазов за успостављање система биолошке анализе за процену транспортних карактеристика ПЕ. Штавише, биоактивност такође треба да зависи од што је могуће више компоненти. У нашој студији, тест укупног антиоксидативног капацитета био је прикладнији од неколико других метода (С1 сл.). Али чак и тако, наш тест може открити ТР од ПРЕ само на 120 мин.

Заједно, ова студија је успоставила нови систем биолошке анализе за процену цревне пермеабилности ПРЕ у диференцираним Цацо-2 ћелијама. Добијени резултати су показали да је слабо апсорбована пасивна дифузија низ концентрацијски градијент без ефлукса главни транспортни механизам ПРЕ (Сл. 5), који представља фармакокинетичку основу за клиничку примену ПхГ у ЦД. Коришћење новог система биолошке анализе за процену ТР и на тај начин израчунавање 'Папп вредности за процену интестиналног транспортног својства АИГ-а у ПЕ је изводљиво. Овај приступ такође може бити погодан за друге ПЕ с обзиром на одговарајућу биоактивност.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%