ИСГ{0}}зависна активација сензора МДА5 је антагонизована са САРС-ЦоВ-2 протеазом слична папаину како би се избегао урођени имунитет домаћина
Nov 08, 2023
Активација рецептора сличних РИГ-И, гена И индуцибилног ретинојском киселином (РИГ-И) и протеина 5 повезаног са диференцијацијом меланома (МДА5) успоставља антивирусно стање повећањем регулације интерфероном (ИФН) стимулисаних гена (ИСГ). Међу њима је ИСГ15, чије механичке улоге у урођеном имунитету и даље остају загонетне. У овој студији, извештавамо да је коњугација ИСГ15 неопходна за антивирусне ИФН одговоре посредоване вирусним РНК сензором МДА5. ИСГилација домена активације каспазе и регрутације МДА5 промовише његову олигомеризацију и на тај начин покреће активацију урођеног имунитета против низа вируса, укључујући коронавирусе, флавивирусе и пикорнавирусе. ИСГ{12}}зависна активација МДА5 је антагонизована кроз директну де-ИСГилацију посредовану протеазом сличном папаину САРС-ЦоВ-2, недавно насталог коронавируса који је изазвао пандемију ЦОВИД{18}} . Наш рад показује кључну улогу ИСГ15 у МДА5-посредованом антивирусном одговору и такође идентификује кључни механизам за избегавање САРС-ЦоВ{22}}, који може бити усмерен на развој нових антивирусних лекова и вакцина за борба против ЦОВИД-а-19.
цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем
Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити
【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692
Вирусну пертурбацију имунолошке хомеостазе домаћина прати урођени имуни систем, који се ослања на рецепторе који осећају молекуларне обрасце повезане са опасношћу или патогеном (ПАМП)1–3. Рецептори слични РИГ-И (РЛР) РИГ-И и МДА5 су кључни за детекцију вируса испитивањем цитоплазме за вирусне или имуностимулативне РНК4 које су изведене из домаћина. Везивање РНК за Ц-терминални домен (ЦТД) и хеликазу РИГ-И и МДА5 доводи до њихове конформације засноване на сигналима која омогућава регрутовање неколико ензима5. Ови ензими модификују РЛР на више домена и места, а пост-транслационе модификације (ПТМ) су посебно добро проучене за домене активације и регрутације каспазе (ЦАРД), сигналне модуле. Протеин фосфатаза 1 (ПП1) / дефосфорилише РИГ-И и МДА5 ЦАРДс6. У случају РИГ-И, дефосфорилација промовише Лис63-повезану полиубиквитинацију ЦАРД-ова помоћу ТРИМ25 (трипартитни мотив који садржи 25) и других Е3 лигаза7,8, који стабилизује олигомерни облик РИГ-И, чиме се омогућава митохондријски антивирусни -везивање сигналног протеина (МАВС). У поређењу са онима из РИГ-И, појединачни кораци активације МДА5 и укључени критични ПТМ-ови су мање схваћени. Активација РЛР-а индукује производњу ИФН-а типа И и ИИИ који, заузврат, пропагирају антивирусну сигнализацију повећањем ИСГ-а9,10. Међу њима је ИСГ15, протеин сличан убиквитину који се може ковалентно коњуговати са лизинским остацима циљних протеина, ПТМ процес који се назива ИСГилација11. Иако је широко познато да коњугација ИСГ15 делује антивирусно12, механизми ИСГилације протеина домаћина који би могли да објасне широку антивирусну рестриктивну активност ИСГ15 тренутно су непознати. Узрочник текуће пандемије ЦОВИД{40}}, тешког акутног респираторног синдрома коронавируса 2 (СЦоВ2), припада породици Цоронавиридае која садржи неколико других људских патогена. Коронавируси имају изузетну способност да потисну антивирусне одговоре посредоване ИФН-ом, а ниска производња ИФН-а код пацијената заражених СЦоВ{44}}у корелацији са тешком болешћу13. Међу антагонистима корона вируса ИФН је протеаза слична папаину (ПЛпро) која има деубиквитинирајуће и де-ИСГилирајуће активности14,15. У овој студији идентификујемо суштинску улогу ИСГилације у активацији МДА5. Даље показујемо да СЦоВ2 ПЛпро реагује са МДА5 и антагонизује ИСГ15-зависну активацију МДА5 путем активне де-ИСГилације, откривајући да је СЦоВ2 већ еволуирао да би избегао имунолошки надзор од стране МДА5.
Резултати
МДА5, али не и РИГ-И, сигнализација захтева ИСГ15.
Да бисмо идентификовали ПТМ-ове МДА5 ЦАРД-а који могу регулисати активацију МДА5, подвргли смо афинитетно пречишћени МДА5-2ЦАРД фузионисан са глутатион-С-трансферазом (ГСТ-МДА5-2ЦАРД), или сам ГСТ, течној хроматографији заједно са тандем масеном спектрометријом (ЛЦ –МС/МС), и открили да је, конкретно, ГСТ–МДА5–2ЦАРД заједно пречишћен са ИСГ15, који се појавио као две траке које су мигрирале спорије (за ~15 и 30 кДа) од немодификованог ГСТ–МДА5–2ЦАРД (проширени подаци Слика 1а). Имуноблотинг (ИБ) је потврдио да је ГСТ–МДА5–2ЦАРД модификован од стране ИСГ15 (Проширени подаци, слика 1б). Затим смо утврдили релевантност ИСГ15 за МДА{23}}индуковану сигнализацију. Док је експресија ФЛАГ-МДА5 у дивљим (ВТ) мишјим ембрионалним фибробластима (МЕФ) индуковала ИФН-месинџер РНК и протеин, као и транскрипте Ццл5 на начин зависан од дозе, експресија ФЛАГ-МДА5 у Исг15−/− МЕФс је довела до аблације експресија антивирусних гена и протеина (слика 1а и проширени подаци, слика 1ц). Слично, индукција антивирусног гена снажно је смањена у ИСГ15 нокаут (КО) ХеЛа (људским) ћелијама у поређењу са ВТ контролним ћелијама (слика 1б и проширени подаци, слика 1д), искључујући ефекат специфичан за врсту. Насупрот томе, ФЛАГ-РИГ-И је индуковао упоредиве количине излученог ИФН-протеина, као и транскрипта Ифнб1 и Ццл5 у Исг15-/- и ВТ МЕФс (слика 1а и проширени подаци, слика 1ц). Транскрипти ИФНБ1 и ЦЦЛ5, као и производња ИФН-протеина од стране ФЛАГ-РИГ-И били су слични или благо побољшани у ИСГ15 КО ХеЛа ћелијама у поређењу са ВТ ћелијама (слика 1б и проширени подаци, слика 1д), у складу са претходним извештајима да је ИСГилација негативно утиче на РИГ-И сигнализацију16,17
Фиг. 1|ИСГилација је потребна за МДА5, али не и РИГ-И, сигнализацију. а,б, ЕЛИСА ИФН- из супернатаната МЕФ-а (ВТ или Исг15−/−) (а) и ХеЛа ћелија (ВТ или ИСГ15 КО) (б) пролазно трансфектованих са све већим количинама ФЛАГ-означеног МДА5 или РИГ-И за 40 х. Лизате целих ћелија (ВЦЛ) испитао је ИБ са анти-ИСГ15, анти-ФЛАГ и анти-актином (контрола оптерећења). ц, ЕЛИСА ИФН- из супернатаната ВТ или Исг15−/− МЕФ који су лажно стимулисани или трансфектовани са ЕМЦВ РНК (0.1 или 0.4 µг мл−1), ХМВ-поли (И: Ц) (0.5 µг мл−1) или РАБВЛе (1 пмол мл−1), или инфициран са СеВ (10 хемаглутинационих јединица (ХАУ) мл−1) током 24 х. д, РТ-кПЦР анализа мРНК Ифнб1, Ццл5 и Тнф у ВТ и Исг15−/− МЕФс стимулисаним као у ц. е, фосфорилација ИРФ3 у ВЦЛ-овима НХЛФ-а који су трансфектовани назначеним сиРНА током 30 сати, а затим лажно стимулисани или трансфектовани са ЕМЦВ РНК (0,4 µг мл-1) или РАБВЛе (1 пмол мл-1) током 6 сати, процењено од ИБ са анти-пСер396-ИРФ3 и анти-ИРФ3. ф, ЕЛИСА ИФН- из супернатаната НХЛФ-а који су трансфектовани назначеним сиРНА током 30 х, а затим лажно стимулисани или трансфектовани са ЕМЦВ РНК (0,4 µг мл-1) или РАБВЛе (1 пмол мл-1), или инфицирани са СеВ (10 ХАУ мл-1) током 16 х. г, ЕЛИСА ИФН- из супернатаната ПБМЦ који су трансдуцирани током 40 х са назначеним схРНА лентивирусним честицама, а затим инфицирани мутЕМЦВ (МОИ=10) или СеВ (200 ХАУ мл-1) током 8 х. х, РТ-кПЦР анализа ИФНА2 и ИЛ-6 мРНК у ПБМЦ које су трансдуциране и инфициране као у г. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима (средња вредност ± сд од н= 3 биолошких реплика у а–д и ф, и средња вредност од н= 2 биолошких реплика у г и х). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Затим смо тестирали ефекат делеције гена ИСГ15 на активацију ендогеног МДА5 и РИГ-И од стране њихових одговарајућих лиганда. Производња ИФН, као и експресија гена ИФНБ1, ЦЦЛ5 и ТНФ индукована трансфекцијом РНК вируса енцефаломиокардитиса (ЕМЦВ) или поли(И:Ц) високе молекулске тежине (ХМВ), оба се претежно сенсирају помоћу МДА5, су били дубоко ослабљени у ћелијама Исг15-/- МЕФ, ИСГ15 КО ХеЛа и ИСГ15 КО ХАП-1 у поређењу са њиховим одговарајућим контролним ћелијама (слика 1ц,д и проширени подаци, слика 1е-г). Важно је да аблација индукције антивирусног гена помоћу ЕМЦВ РНК или ХМВ-поли(И:Ц) у ИСГ15 КО ћелијама није била последица поништене експресије гена МДА5; напротив, експресија МДА5 мРНА је побољшана у ИСГ15 КО ћелијама у поређењу са ВТ ћелијама (Проширени подаци, слика 1ф,г). За разлику од стимулације са МДА5 агонистима, стимулација Исг15−/− МЕФс и ИСГ15 КО ХеЛа ћелија трансфекцијом водеће РНК (РАБВЛе) вируса беснила или инфекције вирусом Сендаи (СеВ), који су РИГ-И стимуланси, довела је до производње ИФН-а и експресија антивирусног гена упоредива са ВТ ћелијама (слика 1ц,д и проширени подаци, слика 1е). Да бисмо искључили потенцијалне клонске ефекте који би могли бити повезани са ћелијама избрисаним геном ИСГ15, извели смо експерименте пролазног утишавања гена у примарним нормалним људским плућним фибробластима (НХЛФ). Утишавање ИСГ15, слично обарање МДА5, довело је до скоро потпуног губитка фосфорилације ИФН-регулаторног фактора 3 (ИРФ3) – обележја активације РЛР-сигнала – након стимулације са ЕМЦВ РНК, али не и РАБВЛе је угасио производњу ИФН-а, као и експресија антивирусног транскрипта у НХЛФ трансфектованим са ЕМЦВ РНК, али не у ћелијама стимулисаним РАБВЛе или СеВ (слика 1ф и проширени подаци, слика 1х). Мала укосница (сх)РНА посредована утишавањем ИСГ15 или МДА5 у примарним мононуклеарним ћелијама људске периферне крви (ПБМЦ) такође је значајно смањила експресију антивирусног протеина и транскрипта након инфекције рекомбинантним мутантним ЕМЦВ (мутЕМЦВ) са недостатком МДА5 антагонизма18,19, у поређењу са инфицирани ПБМЦ трансдуковани са нециљаном контролном схРНА (слика 1г, х и проширени подаци, слика 1и). Насупрот томе, осиромашење ИСГ15 или МДА5 није утицало на одговоре цитокина у ПБМЦ након СеВ инфекције (слика 1г, х и проширени подаци, слика 1и). Ови резултати показују да је ИСГ15 неопходан за имунолошку сигнализацију од стране МДА5, али не и РИГ-И. МДА5 КАРТИЦЕ су ИСГилиране на Лис23 и Лис43.
цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем
Да бисмо потврдили нашу МС анализу која је идентификовала МДА5–2ЦАРД ИСГилацију, прво смо тестирали да ли је ендогени МДА5 такође модификован од стране ИСГ15. Ендогени МДА5 је био снажно ИСГилиран у ћелијама трансфектованим са ХМВ-поли(И: Ц) или инфицираним вирусима денга (ДЕНВ) или Зика (ЗИКВ) које се детектују помоћу МДА5 (реф. 5) (слика 2а). Приметно је да је ендогени МДА5 такође био ИСГилован у неинфицираним ћелијама, иако на веома ниским нивоима (Проширени подаци, слика 2а), што је у складу са претходним налазима да су многи протеини домаћини такође ИСГиловани на ниским нивоима у нормалним (неинфицираним) условима20. У ћелијама које су третиране анти-ИФНАР2 да би блокирале регулацију ИСГ посредоване сигнализацијом ИФНАР, утишавање ИСГ15 или МДА5 довело је до упоредивог смањења експресије гена ИФНБ1 након мутЕМЦВ инфекције (Проширени подаци, слика 2б), што указује да је ИСГ{20}}зависан МДА5 сигнализација се јавља чак иу одсуству ИФНАР сигнализације.
т МДА5Δ2ЦАРД (садржи хеликазу и ЦТД), је примарно место МДА5 ИСГилације које показује две истакнуте траке за ИСГиловани 2ЦАРД (слика 2б). Реконституција ИСГ15 КО ХеЛа ћелија са ВТ ИСГ15 или некоњугираним ИСГ15 мутантом у коме су два глицина потребна за коњугацију замењена аланином (ИСГ15-АА)21, показала је ковалентну коњугацију ИСГ15 (слика 2ц) . Мутација појединачних резидуа лизина у ГСТ–МДА5–2ЦАРД на аргинин је открила да мутација на једном месту Лис23 и Лис43 значајно смањује ИСГилацију (Проширени подаци, слика 2ц), док је њихова комбинована мутација (Лис23Арг/Лис43Арг) скоро укинула ИСГилацију (Сл. ). ФЛАГ–МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг пуне дужине такође је показао значајно смањену ИСГилацију (слика 2е и проширени подаци, слика 2д); заостала ИСГилација уочена у ФЛАГ–МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг је вероватно због додатних мањих места у 2ЦАРД и/или Δ2ЦАРД. Треба напоменути да мутација Лис23Арг/Лис43Арг није утицала на МДА5–2ЦАРД СУМОилацију5 (проширени подаци, слика 2е). Штавише, док је РИГ-И–2ЦАРД био снажно убиквитиниран (што представља ковалентну Лис63-повезану убиквитинацију7), ни МДА5–2ЦАРД ВТ ни Лис23Арг/Лис43Арг мутант нису показали нивое убиквитинације који се могу детектовати (Слика проширених података 2ф). Заједно, ови резултати указују на то да се МДА5 КАРТИЦЕ подвргавају ИСГилацији на две главне локације, Лис23 и Лис43.
ЦАРД ИСГилација је неопходна за активацију МДА5.
Када се упореде њихове способности трансдукције сигнала, мутанти МДА5–2ЦАРД Лис23Арг и Лис43Арг на једном месту показали су делимично смањену активацију ИФН-промотора у поређењу са ВТ МДА5–2ЦАРД, док је мутант Лис23Арг/Лис43Арг имао дубоко смањену скоро јаку сигналну активност, што је било као код мутаната Сер88Глу и Сер88Асп6 са дефектним сигналима (Проширени подаци, слика 2г). Насупрот томе, мутант у коме је Лис68, који је остатак лизина који је најближи Лис43 и Лис23, замењен аргинином (Лис68Арг) показао је упоредиву ИСГ15 коњугацију и способност сигнализације са ВТ 2ЦАРД (Проширени подаци, слика 2ц,г). МДА5–2ЦАРД Лис23Арг/Лис43Арг, за разлику од ВТ МДА5–2ЦАРД, такође није успео да изазове димеризацију ИРФ3 (проширени подаци, слика 2х). ФЛАГ–МДА5 Лис23Арг, Лис43Арг или Лис23Арг/Лис43Арг су такође показали смањене, или скоро укинуте способности активирања ИФН-промотора, у поређењу са ФЛАГ–МДА5 ВТ (слика 2ф). МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг је показао дубок сигнални дефект чак и када је изражен у великим количинама, док је ВТ МДА5 индуковао антивирусне транскрипте на начин зависан од дозе (слика 2г). Сагласно, фосфорилација СТАТ1, обележје ИФНАР сигнализације, као и експресија ИСГ протеина су високо индуковани МДА5 ВТ, али не и Лис23Арг/Лис43Арг (слика 2х). Комплементација МДА5-генски уређених људских астроцита (СВГА) са МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг или Сер88Глу довела је до значајног смањења транскрипта ИФНБ1, ЦЦЛ5 и ИСГ у поређењу са ћелијама које експримирају ВТ МДА5 (Слика 2и и Проширени подаци) Сл. . Ови резултати показују да је ИСГилација на Лис23 и Лис43 неопходна за МДА{64}}посредоване одговоре цитокина.
цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем
Дефосфорилација помоћу ПП1 регулише МДА5 ИСГилацију.
Слично РИГ-И, МДА5 је фосфорилисан унутар ЦАРДс у неинфицираним ћелијама, што спречава аутоактивацију; дефосфорилација РИГ-И и МДА5 помоћу ПП1 / је кључна за ослобађање РЛР-а из њихових стања потиснутих сигнализацијом6,22–24. Дефосфорилација РИГ-И омогућава Лис{10}}убиквитинацију ЦАРД-а, што промовише мултимеризацију и сигнализацију РИГ-И5. Детаљи о томе како ЦАРД дефосфорилација (на Сер88) покреће активацију МДА5 остали су неухватљиви, и стога смо тестирали да ли дефосфорилација регулише МДА5 ИСГилацију. Утишавање ПП1 / јако смањена МДА5–2ЦАРД ИСГилација (Проширени подаци, слика 3а). Штавише, фосфомиметички Сер88Глу и Сер88Асп мутанти су имали смањену ИСГилацију, док је фосфо-нул Сер88Ала мутант показао јачу ИСГилацију од ВТ МДА5–2ЦАРД (Проширени подаци, слика 3б). Супротно томе, МДА5 ВТ и Лис23Арг/Лис43Арг су имали упоредиву фосфорилацију Сер88 (проширени подаци, слика 3ц). Заједно, ови подаци сугеришу да дефосфорилација МДА5 на Сер88 претходи ЦАРД ИСГилацији. Затим смо користили В протеин вируса морбила (МеВ-В), који антагонизује МДА5 Сер88 дефосфорилацију кроз ПП1 / антагонизам25. Експресија МеВ-В појачала је фосфорилацију Сер88 (што указује на аблацију дефосфорилације) ГСТ-МДА5-2ЦАРД или ФЛАГ-МДА5 на начин зависан од дозе, као што је раније приказано25. Повећана фосфорилација помоћу МеВ-В је у корелацији са падом ИСГилације (Проширени подаци, слика 3д,е). За разлику од ВТ МеВ-В, мутант МеВ-В који је укинуо антагонизам ПП1-везивања и МДА5-дефосфорилације (МеВ-ВΔтаил)25, показао је мали ефекат на МДА5–2ЦАРД ИСГилацију (Проширени подаци Слика 3ф), јачање инхибиције ИСГилације првенствено због инхибиције ПП1, а не других антагонистичких ефеката, од стране МеВ-В. В протеини из Нипах и Хендра вируса (НиВ-В и ХеВ-В) такође су побољшали фосфорилацију МДА5 Сер88 и, сходно томе, пригушили МДА5 ИСГилацију (Проширени подаци, слика 3г,х), што сугерише да неколико парамиксовирусних В протеина инхибира МДА5 ИСГилацију кроз мани. Сер88 фосфорилације, иако прецизни механизми за појединачне В протеине тек треба да се утврде. Узети заједно, ови подаци сугеришу да ИСГилација МДА5 ЦАРД зависи од дефосфорилације на Сер88.
ИСГилатион промовише МДА5 склопове вишег реда.
Активација РЛР захтева везивање РНК, олигомеризацију РЛР и њихову транслокацију из цитосола у митохондрије ради интеракције са МАВС5. Да бисмо разјаснили механизам којим ИСГилација утиче на активност МДА5, прво смо испитали да ли ИСГилација утиче на везивање РНК. Ендогени МДА5 пречишћен од ВТ или Исг15−/− МЕФс је подједнако добро деловао са ХМВ-поли(И: Ц) ин витро (проширени подаци, слика 4а). МДА5 ВТ и Лис23Арг/Лис43Арг су показали упоредиво везивање за ХМВ-поли(И:Ц), што указује да ИСГилација не утиче на способност везивања за РНК МДА5 (Проширени подаци, слика 4б). Када смо пратили транслокацију МДА5 из цитосола у митохондрије након стимулације ЕМЦВ РНК, открили смо да је утишавање ИСГ15, али не тако. Ц трансфекција, укинула транслокацију МДА5 (слика 3а). Насупрот томе, транслокација РИГ-И након трансфекције РАБВЛе била је ефикасна и код осиромашених ИСГ15-и код си. Ц-трансфектоване ћелије (слика 3б). Ови подаци су показали да ИСГилација регулише транслокацију МДА5 или корак узводно од ње. Пошто транслокација МДА5 из цитосола у митохондрију захтева интеракцију са 14-3-3η26, упоредили смо 14-3-3η везивање ВТ и мутантног МДА5. Способност МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг да веже 14-3-3η била је слична оној код ВТ МДА5 или мутанта Лис68Арг (проширени подаци, слика 4ц). Међутим, док је ЕМЦВ РНА стимулација ефикасно изазвала олигомеризацију МДА5 у ВТ МЕФ-овима, формирање МДА5 олигомера је аблаирано у МЕФ-овима са недостатком ИСГ15- (слика 3ц). Нокдаун ИСГ15 у 293Т ћелијама такође је укинуо олигомеризацију ФЛАГ-МДА5-2ЦАРД (слика 3д). Насупрот томе, ко-експресија компоненти машинерије ИСГилације, Убе1Л и УбцХ8, снажно је побољшала олигомеризацију МДА5–2ЦАРД у си. Ц-трансфектоване ћелије, али не и ћелије осиромашене ИСГ{51}}(Слика 3д), што указује да је ИСГилација потребна за формирање МДА5 олигомера. У прилог овом концепту, ФЛАГ–МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг је показао скоро укинуту олигомеризацију, док је ВТ МДА5 олигомеризован ефикасно (слика 3е). Такође смо упоредили ефекат мутације Лис23 Арг/Лис43Арг са мутацијама које ометају олигомеризацију и које се локализују или на интерфејсу између МДА5 мономера и ометају МДА5 филаментацију посредовану везањем РНК (Иле841Арг/Глу842Арг и Асп848Ала/Пхе2,Асп848Ала/Пхе2) или на ЦАРД-ове (Гли74Ала/Трп75Ала) и пореметити олигомеризацију 2ЦАРД27. За разлику од ВТ МДА5, мутант Лис23Арг/Лис43Арг, сличан МДА5 Гли74Ала/Трп75Ала, показао је мањак олигомеризације и, у складу са тим, укинуо је способност активирања ИФН-промотора (Слика 3ф,г). Увођење Лис23Арг/Лис43Арг у позадину Иле841Арг/Глу842Арг или Асп848Ала/Пхе849Ала, од којих је сваки сам по себи смањио олигомеризацију и сигнализацију МДА5, такође је укинуо формирање МДА5 олигомера и индукцију ИФН-а (Сл. 3). Како ЛГП2 олакшава нуклеацију МДА5 на дволанчаној РНК и тиме олигомеризацију МДА529,30, упоредили смо ЛГП2 везивање МДА5 ВТ и Лис23Арг/Лис43Арг. МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг је ступио у интеракцију са ЛГП2 једнако ефикасно као ВТ МДА5 (Проширени подаци, слика 4д), ојачавајући предлог да ЦАРД ИСГилатион промовише олигомеризацију МДА5 независно од филаментације посредоване РНК-везивањем. Заједно, ови резултати утврђују да ИСГилација олакшава ЦАРД олигомеризацију и МДА5 склопове вишег реда.
Слика 2|Активација МДА5 захтева ИСГилацију на Лис23 и Лис43. ендогена МДА5 ИСГилација у НХЛФ-овима који су лажно третирани, трансфектовани са ХМВ-поли(И: Ц) (0.1 µг мл-1) током 40 х (лево) или инфицирани са ДЕНВ или ЗИКВ (МОИ {{ 10}} за сваки) током 48 х (десно), одређено ИП са анти-МДА5 (или контролом изотипа ИгГ) и ИБ са анти-ИСГ15. б, ИСГилација ФЛАГ-означених МДА5-2ЦАРД и МДА5Δ2ЦАРД у пролазно трансфектованим ћелијама ХЕК293Т које су такође експримирале В5-ИСГ15, ХА-Убе1Л и ФЛАГ-УбцХ8, процењено од стране ФЛАГ ПД и ИБ са анти-В5 на 40 х након транскције. ц, Ендогена МДА5 ИСГилација у ИСГ15 КО ХеЛа ћелијама стабилно реконституисана вектором, ВТ ИСГ15 или ИСГ15-АА и ко-трансфектована са ХА–Убе1Л и ФЛАГ–УбцХ8 након третмана ИФН (1,000 У мл-1) током 24 х, одређено ИП са анти-МДА5 и ИБ са анти-ИСГ15. д, ИСГилација ГСТ-МДА5-2ЦАРД ВТ и Лис23Арг / Лис43Арг у ћелијама ХЕК293Т које су ко-трансфектоване са В5-ИСГ15, ХА-Убе1Л и ФЛАГ-УбцХ8 током 24 сата, одређено ГСТ ПД и ИБ са анти-В5. е, ИСГилација ФЛАГ-МДА5 ВТ и Лис23Арг / Лис43Арг у ћелијама ХЕК293Т које су ко-трансфектоване са В5-ИСГ15, ХА-Убе1Л и ФЛАГ-УбцХ8, утврђено ФЛАГ ПД и ИБ са анти-В5. ф, активност репортера ИФН-луциферазе у ћелијама ХЕК293Т које су трансфектоване 40 х вектором, ФЛАГ-МДА5 ВТ или мутантима. Вредности луциферазе су представљене као индукција прегиба у односу на вредности за ћелије трансфектоване вектором, постављене на 1. ВЦЛс је испитан ИБ са анти-ФЛАГ и анти-актином. г, РТ-кПЦР анализа ИФНБ1 и ЦЦЛ5 мРНА у ћелијама ХЕК293Т које су пролазно трансфектоване било вектором или повећањем количине ФЛАГ-МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг. х, СТАТ1 фосфорилација и обиље протеина ИСГ (ИФИТ1 и -2) у ВЦЛ ћелијама ХЕК293Т које су биле пролазно трансфектоване вектором или ФЛАГ-МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, које је одредио ИБ. И, РТ-кПЦР анализа назначених антивирусних гена у МДА5 КО СВГА који су пролазно реконституисани или празним вектором или ФЛАГ-означеним МДА5 ВТ, Лис23Арг/Лис43Арг или Сер88Глу. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима (средња вредност ± сд од н= 3 биолошких реплика у ф, г и и). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Слика 3|ЦАРД ИСГилатион промовише формирање МДА5 склопова вишег реда. а,б, цитосол-митохондријска фракционисање ВЦЛ-ова из НХЛФ-а који су трансфектовани током 30 х са нециљаном контролном сиРНА (си. Ц) или ИСГ15-специфичном сиРНА (си.ИСГ15), и затим лажно третирани или трансфектовани са ЕМЦВ РНК (0.4 µг мл-1 ) (а) или РАБВЛе (1 пмол мл-1 ) (б) током 16 х. ИБ је изведен са анти-МДА5 (а), анти-РИГ-И (б), анти-ИСГ15 и анти-актином (а и б). -Тубулин и МАВС су служили као маркери чистоће за цитосолну и митохондријску фракцију, респективно (а и б). ц, Ендогена олигомеризација МДА5 у ВТ и Исг15-/- МЕФ-овима који су трансфектовани са ЕМЦВ РНК (0,5 µг мл-1) током 16 х, и процењени помоћу СДД-АГЕ и ИБ са анти-МДА5. ВЦЛ су даље анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и испитани од стране ИБ са анти-МДА5 и анти-актином. д, Олигомеризација ФЛАГ-МДА5-2ЦАРД у ћелијама ХЕК293Т које су трансфектоване назначеним сиРНА, било са или без ХА-Убе1Л и ФЛАГ-УбцХ8 током 48 сати, утврђено помоћу НативеПАГЕ и ИБ са анти-ФЛАГ. ВЦЛ су даље анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и испитани од стране ИБ са анти-ФЛАГ, анти-ХА, анти-ИСГ15 и анти-актином. е, Олигомеризација ФЛАГ-МДА5 ВТ и Лис23Арг / Лис43Арг у пролазно трансфектованим ћелијама МДА5 КО ХЕК293, процењена помоћу СДД-АГЕ и ИБ са анти-ФЛАГ. ВЦЛ су даље анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и ИБ са анти-ФЛАГ и анти-актином. ф, Олигомеризација ФЛАГ-означеног МДА5 ВТ и мутаната у пролазно трансфектованим ћелијама МДА5 КО ХЕК293, процењена помоћу НативеПАГЕ и ИБ са анти-МДА5. ВЦЛ су даље анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и испитани од стране ИБ са анти-МДА5 и анти-актином. г, активност репортера ИФН-луциферазе у ћелијама МДА5 КО ХЕК293 које су трансфектоване током 24 сата или празним вектором, или ФЛАГ-означеним МДА5 ВТ или мутантима. Активност луциферазе је представљена као индукција прелома у односу на вредности за ћелије трансфектоване вектором, постављене на 1. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима (средња вредност ± сд од н= 3 биолошких реплика у г). ***П< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
МДА5 сигнализација зависна од ИСГилације ограничава репликацију вируса.
Затим смо проценили да ли је ИСГилација МДА5 потребна за његову способност да ограничи репликацију вируса. ФЛАГ–МДА5 ВТ, али не и Лис23Арг/Лис43Арг, снажно (за ~ 2 лог) инхибира ЕМЦВ репликацију (слика 4а). Слично, МДА5 КО ХЕК293 ћелије су реконституисане са ВТ МДА5, али не и ћелије комплементоване мутантом Лис23Арг/ Лис43Арг, што је ефикасно ограничило ДЕНВ репликацију (слика 4б). Такође смо реконституисали СВГА астроцита МДА5 КО, физиолошки релевантног типа ћелије за ЗИКВ инфекцију, било са вектором, или МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, а затим проценили репликацију ЗИКВ током 40- х временског тока. ЗИКВ репликација је ослабљена ~100- пута у ћелијама реконституисаним са ВТ МДА5 у поређењу са ћелијама које експримирају вектор. Насупрот томе, ћелије комплементоване са МДА5 Лис23Арг/Лис43Арг нису ограничавале ЗИКВ, слично ћелијама које експримирају МДА5 Сер88Глу (слика 4ц). ВТ МДА5, али не и Лис23Арг/Лис43Арг, такође је ограничио репликацију СЦоВ2, иако у мањој мери од оне која је уочена за друге тестиране вирусе (слика 4д).
Слика 4|ИСГилација је потребна за вирусну рестрикцију помоћу МДА5. ЕМЦВ титри у супернатанту ћелија ХЕК293Т које су трансфектоване 40 х било вектором, или ФЛАГ–МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, а затим инфициране са ЕМЦВ (МОИ=0.001) током 24 х, одређено ТЦИД50 тестом. б, Проценат ћелија МДА5 КО ХЕК293 инфицираних ДЕНВ-ом које су трансфектоване током 24 сата било вектором, или ФЛАГ–МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, а затим лажно третиране или инфициране са ДЕНВ (МОИ=5) током 48 сати , проценио ФАЦС коришћењем анти-флавивируса Е (4Г2). ССЦ, бочно распршивање. ц, ЗИКВ титри у супернатанту МДА5 КО СВГА који су трансфектовани 30 х вектором или ФЛАГ-означеним МДА5 ВТ, Лис23Арг/Лис43Арг или Сер88Глу, а затим инфицирани са ЗИКВ (МОИ=0.1) у назначеним временима. , утврђено тестом плака. пфу, јединице које формирају плак; хпи, сати након инфекције. д, титри СЦоВ2 у супернатанту ћелија ХЕК293Т–хАЦЕ2 које су трансфектоване током 24 сата или празним вектором, или ФЛАГ–МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, а затим инфициране са СЦоВ2 (МОИ=0.5) током 24 х, утврђено тестом плака. е, Шема експерименталног приступа да се 'раздвоји' улога ИСГ15 у МДА5-посредованој индукцији ИФН-а од његове улоге у пригушивању ИФНАР сигнализације. Суп., супернатант. ф, НХЛФ 'донаторске' ћелије су трансфектоване 40 х са назначеним сиРНА, а затим инфициране са мутЕМЦВ (МОИ=0.1) током 16 х. Супернатанти ћелија су УВ-инактивирани и пребачени на Веро ћелије 'примаоца'. После 24 х, ћелије су инфициране ЗИКВ-ом (МОИ=0.002–2) током 72 х, а ЗИКВ-позитивне ћелије су одређене имунобојењем са анти-флавивирусом Е (4Г2) и супстратом ТруеБлуе пероксидазе. г, РИГ-И КО ХЕК293 'донаторске' ћелије су трансфектоване са си. Ц или си.ИСГ15 заједно са вектором или ФЛАГ–МДА5 ВТ или Лис23Арг/Лис43Арг, током 24 х, након чега следи ЕМЦВ инфекција (МОИ=0.001) током 16 х. УВ-инактивирани ћелијски супернатанти су пребачени на Веро ћелије 'примаоца' током 24 х, након чега је уследила инфекција са ЕМЦВ (МОИ=0.001–0,1) током 40 х. Цитопатски ефекти изазвани ЕМЦВ визуелизовани су Кумассие Блуе бојењем. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима (средња вредност ± сд од н= 3 биолошких реплика у а–д). *П< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Затим смо утврдили ефекат утишавања ИСГ15 на способност МДА5 да инхибира репликацију вируса. Иако МДА5 Лис23Арг/ Лис43Арг није успео да потисне ЕМЦВ репликацију без обзира на утишавање ИСГ15, ВТ МДА5 је ефикасно ограничио ЕМЦВ репликацију у си. Ц-трансфектоване ћелије и, неочекивано, такође у ћелијама осиромашеним ИСГ15- (Проширени подаци, слика 5а). У истраживању основног механизма ових неочекиваних резултата, открили смо да су ћелије инфициране ЕМЦВ које су експримирале ВТ МДА5 имале значајно повећан ниво експресије ИСГ протеина када је ИСГ15 био утишан у поређењу са инфицираним ћелијама трансфицираним са ВТ МДА5 и си. Ц (Проширени подаци, слика 5б). Слично томе, повишен ИСГ транскрипт и експресија протеина примећени су у ћелијама са недостатком ИСГ15-које су трансфектоване са ЕМЦВ РНК или инфициране са мутЕМЦВ, упркос укидању индукције ИФН (Проширени подаци, слика 5ц,д). Насупрот томе, МДА5 нокдаун је поништио експресију протеина ИФН- и ИСГ, као што се очекивало (Проширени подаци, слика 5д). Приметили смо да је обиље протеина УСП18, деубиквитинирајућег ензима који негативно регулише ИФНАР сигнализацију31, знатно смањено у ћелијама осиромашеним ИСГ15- након ЕМЦВ инфекције у поређењу са инфицираним ћелијама које су трансфектоване са си. Ц или МДА5-специфична сиРНА (Проширени подаци, слика 5б,д), што је у складу са пријављеном улогом ИСГ15 у спречавању деградације УСП1832. Заједно, ови подаци сугеришу да је у експерименталним поставкама циљања ИСГ15-гена (то јест, утишавања или КО) антивирусни ефекат МДА5 ИСГилације маскиран аберантном регулацијом ИСГ-а због аблације инхибиторног ефекта ИСГ15 на ИФНАР сигнализацију.
5|СЦоВ2 ПЛпро се везује за и де-ИСГилира МДА5–2ЦАРД. а Риббон приказ кристалне структуре СЦоВ2 ПЛпро: ИСГ15 комплекса (Протеин Дата Банк, приступни број 6ИВА). Наведени су кључни остаци који посредују у интеракцији места 1 (Асн156 и Арг166/Глу167) или интеракције места 2 (Пхе69) у ПЛпро-у, као и његово каталитички активно место (Цис111). б, ИСГилација ГСТ–МДА5–2ЦАРД у ћелијама ХЕК293Т које су котрансфектоване током 20 х вектором или В5-означеним СЦоВ2 ПЛпро ВТ или мутантима, заједно са ФЛАГ–ИСГ15, ХА–Убе1Л и ФЛАГ–УбцХ8, одређује ГСТ ПД и ИБ са анти-ФЛАГ и анти-ГСТ. ВЦЛс је испитао ИБ са анти-В5, анти-ХА, анти-ФЛАГ и анти-актином. ц, Везивање ХА-означеног МДА5 или РИГ-И за В5-означеног СЦоВ2– ПЛпро или ФЛАГ-означеног МеВ-В (позитивна контрола) у пролазно трансфектованим ћелијама ХЕК293Т, одређено ХА ПД и ИБ са анти-В5 или анти-ФЛАГ, и анти-ХА. ВЦЛ је испитао ИБ са анти-В5 и анти-ФЛАГ. д, Олигомеризација ФЛАГ-МДА5-2ЦАРД у ћелијама ХЕК293Т које су ко-трансфектоване вектором или В5-означеним СЦоВ2 ПЛпро ВТ или Цис111Ала током 24 сата, процењено од стране НативеПАГЕ и ИБ са анти-ФЛАГ. ВЦЛ су даље анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и испитани од стране ИБ са анти-ФЛАГ, анти-В5 и анти-актином. е, ИСГилација ГСТ–МДА5–2ЦАРД у ћелијама ХЕК293Т које су такође експримовале ФЛАГ–ИСГ15, ХА–Убе1Л и ФЛАГ–УбцХ8, и биле су котрансфектоване током 40 х вектором или назначеним В5-означеним коронавирусним ПЛпро протеини, одређени ГСТ ПД и ИБ са анти-ФЛАГ, анти-В5 и анти-ГСТ. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима.
Затим смо применили тест заштите од вируса који експериментално раздваја МДА5 сигнализацију у ћелијама инфицираним вирусом од низводне ИФНАР сигнализације у истим ћелијама (слика 4е). Супернатанти из ћелија 'донатора' инфицираних мутЕМЦВ који су били или си. Ц трансфицирани или осиромашени или ИСГ15 или МДА5, инактивирани су ултраљубичастим (УВ) зрацима и затим пребачени у неинфициране ћелије 'примаоца'. Ћелије 'Примед' примаоца су затим инфициране ЗИКВ-ом да би се директно пратио антивирусни ефекат МДА5-посредоване производње ИФН-а од стране ћелија донора. Док су супернатанти из си. Ц-трансфектоване ћелије 'донора' снажно су инхибирале репликацију ЗИКВ, а супернатанти из ИСГ15 или МДА5 оборених ћелија минимално су ограничавали ЗИКВ инфекцију (слика 4ф). Слично, супернатанти културе из донорских ћелија инфицираних ЕМЦВ трансфицирани са ВТ МДА5 заједно са си. Ц је довео до веће заштите ћелија примаоца од вирусног изазова него код ћелија које експримирају ВТ МДА5 и осиромашене од ИСГ15 (Слика 4г). Заједно, ови подаци показују да је ИСГилација важна за МДА{16}}посредовану рестрикцију низа РНК вируса.
Слика 6|СЦоВ2 ПЛпро инхибира ИСГ15-посредовану МДА5 сигнализацију путем своје активности де-ИСГилазе. а, РТ-кПЦР анализа транскрипта ИФНБ1, ИФНЛ1, ИСГ15, МДА5 и РИГ-И у НХЛФ-овима који су трансфектовани назначеним сиРНА током 40 х, а затим трансфицирани лажном РНК или СЦоВ2 РНК (0,4 µг мл −1 ) током 24 х. б, Везивање СЦоВ2 Нсп3 за ендогени МДА5 у А549–хАЦЕ2 ћелијама које су инфициране са СЦоВ2 (МОИ=0.5) током 24 х, одређено ИП са анти-МДА5 (или контролом ИгГ изотипа) праћено ИБ са анти-Нсп3 и анти-МДА5. ВЦЛс је испитао ИБ са анти-Нсп3 и анти-актином. ц, Ендогена МДА5 ИСГилација у ћелијама А549–хАЦЕ2 које су лажно инфициране или инфициране са СЦоВ2 (МОИ=0.5) током 40 х у присуству ПЛпро инхибитора (ГРЛ-0617; 50 µМ) или вехикла контрола (диметилсулфоксид), одређена ИП са анти-МДА5 (или контролом изотипа ИгГ), праћеном ИБ са анти-ИСГ15 и анти-МДА5. ИБ је испитао обиље протеина ИФИТ1, РСАД2, ИСГ15 и актина у ВЦЛ. Ефикасна репликација вируса је верификована од стране ИБ са анти-Нсп3 и анти-Спике (С). д, РТ-кПЦР анализа транскрипта ИФНБ1, ЦЦЛ5 и ИФИТ1 и ЕМЦВ геномске РНК (гРНА), у ХеЛа ћелијама које су пролазно трансфектоване 24 сата вектором или В5-СЦоВ2 ПЛпро ВТ или мутантима, а затим инфициране мутЕМЦВ (МОИ=0.5) током 12 х. е, титри ЕМЦВ у супернатанту ћелија РИГ-И КО ХЕК293 које су пролазно трансфектоване током 24 сата вектором или ФЛАГ-МДА5, заједно са В5-означеним СЦоВ2 ПЛпро ВТ, Цис111Ала или Арг166Сер/Глу167Арг, а затим инфецтед, са ЕМЦВ (МОИ=0.001) током 16 х, утврђено тестом плака. ф, Обиље протеина назначених ИСГ у ВЦЛ-овима из експеримента у е, одређено ИБ са назначеним антителима. Подаци представљају најмање два независна експеримента са сличним резултатима (средња вредност ± сд од н= 3 биолошких реплика у а, д и е). *П< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
СЦоВ2 ПЛпро циља МДА5 за де-ИСГилацију.
Коронавируси као што су САРС-ЦоВ (СЦоВ), МЕРС-ЦоВ и недавно појавили СЦоВ2 кодирају ПЛпро који посредује у цепању вирусног полипротеина33. Поред тога, ПЛпро има активности деубиквитинације и де-ИСГилације. Недавно је показано да СЦоВ2 ПЛпро модулира антивирусне одговоре првенствено путем своје активности де-ИСГилазе15. Пошто је познато да је МДА5 главни сензор за откривање коронавируса34,35 и пошто су наши подаци показали да је ИСГилација потребна за МДА{10}посредовану рестрикцију вируса, испитали смо да ли СЦоВ2 ПЛпро ензимски уклања МДА5 ИСГилацију да би антагонизовао урођени имунитет. СЦоВ2 ПЛпро ВТ, али не и његов каталитички неактивни мутант (ПЛпро Цис111Ала)15, укинуо је ИСГилацију ГСТ-МДА5-2ЦАРД и ФЛАГ-МДА5 (слика 5а,б и проширени подаци слика 6а). Мутанти ПЛпро Асн156Глу и Арг166Сер/Глу167Арг, који су маргинално и озбиљно нарушени у везивању ИСГ15 на интерфејсу 'места 1', односно 14,36, су благо или нису утицали на ИСГилацију. Насупрот томе, ПЛпро Пхе69Ала, у којем је интерфејс „места 2“ који преференцијално одређује везивање за убиквитин, али не и за ИСГ15, поремећен14,36, смањио је МДА5 ИСГилацију једнако снажно као ВТ ПЛпро (Слика 5а,б и Проширени подаци, Слика 6а ). СЦоВ2 ПЛпро, међутим, није потиснуо убиквитинацију РИГ-И–2ЦАРД (Проширени подаци, слика 6б). Открили смо да је ПЛпро посебно интераговао са МДА5, али не и са РИГ-И, као што је то учинио и МеВ-В који везује МДА5 и служи као контрола37 (слика 5ц). Ниске количине ПЛпро инхибирају сигнализацију од стране МДА5, али не и РИГ-И, док веће количине ПЛпро потискују антивирусну сигнализацију оба РЛР-а (проширени подаци, слика 6ц). Ово јача да је МДА5 директна мета ПЛпро-а. Де-ИСГилација ИРФ3 вероватно објашњава инхибиторни ефекат који веће дозе ПЛпро имају на РЛР сигнализацију15,38. Када се испитује ефекат ПЛпро на олигомеризацију МДА5–2ЦАРД, ПЛпро ВТ, али не и Цис111Ала, ефикасно је блокирао олигомеризацију МДА5–2ЦАРД (слика 5д), што указује да СЦоВ2 ПЛпро инхибира формирање МДА5 олигомера зависно од ИСГилације путем своје ензимске активности. ПЛпро ензими сродних -цоронавируса, СЦоВ, МЕРС-ЦоВ и вируса мишјег хепатитиса (МХВ), као и -цоронавируса ХЦоВ-НЛ63 (НЛ63) такође су се везали и ефикасно смањили МДА5–2ЦАРД ИСГилацију (слика 5е) , што сугерише да МДА5 антагонизам од стране ПЛпро-а може бити широко очуван међу коронавирусима.
цистанцхе биљке које повећавају имуни систем
СЦоВ2 ПЛпро антагонизује ИСГ{1}}зависну МДА5 сигнализацију.
Затим смо утврдили релевантност ИСГ{0}}зависне МДА5 сигнализације за индукцију антивирусних цитокина коју изазива СЦоВ2. Пошто је познато да инфекција СЦоВ2 минимално индукује ИФН типа И због ефикасних вирусних антагонизама39, изоловали смо укупну РНК из ћелија инфицираних СЦоВ2-, а затим је поново трансфектовали у ћелије да бисмо стимулисали урођену имунолошку сигнализацију. СЦоВ2 РНК, али не и РНК из лажно третираних ћелија, снажно индукује транскрипте ИФН; међутим, ова индукција је значајно смањена када су ИСГ15 или МДА5 утишани (слика 6а). Обарање РИГ-И није негативно утицало на експресију антивирусног гена изазвану СЦоВ2 РНК, што указује да се СЦоВ2 РНК–ПАМП примарно осећају на оси ИСГ15–МДА5 (слика 6а).
Открили смо да је СЦоВ2 неструктурни протеин 3 (Нсп3), унутар којег се налази ПЛпро, лако интераговао са ендогеним МДА5 током аутентичне инфекције СЦоВ2 (слика 6б). Ендогена МДА5 ИСГилација није била детектива у ћелијама инфицираним СЦоВ2-, иако је вирус покренуо експресију ИСГ15; међутим, у инфицираним ћелијама третираним специфичним ПЛпро инхибитором15, МДА5 ИСГилација и низводна индукција ИСГ су били снажно побољшани (слика 6ц), подржавајући предлог да ПЛпро ефикасно потискује МДА5 ИСГилацију и сигнализацију током живе СЦоВ2 инфекције. Затим смо испитали ефекат ВТ и мутантног ПЛпро на активацију ендогеног МДА5 током мутЕМЦВ инфекције. У складу са њиховим ефектом на МДА5 ИСГилацију (слика 5б и проширени подаци, слика 6а), СЦоВ2 ПЛпро ВТ и Пхе69Ала су спречили индукцију антивирусног транскрипта, док МДА5 Арг166Сер/ Глу167Арг, слично Цис111Ала мутанту, није утицао на експресију антивирусног гена (Сл. 6д). У складу са овим, репликација мутЕМЦВ је побољшана у ћелијама које експримирају ПЛпро ВТ или Пхе69Ала, али не и у ћелијама које експримирају ПЛпро Цис111Ала или Арг166Сер/Глу167Арг (слика 6д). Слично, ВТ ПЛпро, али не мутант Арг166Сер/Глу167Арг или Цис111Ала, блокирао је рестрикцију ЕМЦВ помоћу ФЛАГ-МДА5 (слика 6е); ефекат на репликацију вируса корелирао је са индукованим ИСГ протеинима (слика 6ф). Заједно, ово утврђује СЦоВ2 ПЛпро као ИФН антагонист који активно де-ИСГилира МДА5.
Дискусија
Познато је да коњугација ИСГ15 даје антивирусну активност великом броју вируса; међутим, идентификовано је само неколико правих супстрата12. С друге стране, ИСГ15 у свом некоњугованом облику делује провирално тако што појачава УСП{3}}посредовану инхибицију ИФНАР сигнала31,32,40. Ова студија идентификује кључну улогу ИСГилације у индукцији ИФН посредоване МДА{8}. Наш рад такође наглашава важност експерименталног дизајна у којем је раздвајање улоге ИСГ15 у активацији МДА5 од оне у пригушивању ИФНАР сигнализације од суштинског значаја за откривање моћне антивирусне активности ИСГ15. У зараженом организму, вероватно је збир вишеструких догађаја ИСГилације (који утичу и на протеине домаћина и на вирусне протеине) оно што одређује исход инфекције и патогенезу, што може бити зависно од контекста12.
Предности цистанцхе тубулоса- ојачати имуни систем
Наши налази показују да ИСГилација МДА5 делује аналогно убиквитинацији РИГ-И5 везаној за Лис{1}}: оба ПТМ-а (1) су регулисана дефосфорилацијом изазваном ПП1- и (2) промовишу ЦАРД олигомеризацију и РЛР виши -ред скупштине. Међутим, док је убиквитин у изобиљу и у неинфицираним и у инфицираним ћелијама, експресија ИСГ15 је снажно повећана стимулацијом ИФН-а. Ипак, чак и на базалним нивоима, ИСГ15 је коњугован са многим протеинима домаћина20, укључујући МДА5, као што је показао наш рад, што може бити довољно за почетну активацију МДА5. Током вирусних инфекција које се детектују вишеструким ПРР-овима, МДА5 ИСГилација може бити механизам „примања“ при чему појачана регулација ИСГ15 непосредним урођеним сензором (на пример, РИГ-И)41 покреће МДА5 да уђе у „кицк-старт“ режим. Како ИСГ15 негативно регулише РИГ-И16,17, ИСГилација може да изазове 'промену сензора' где се активација МДА5 промовише када се нивои ИСГ15 повећају, док се активност РИГ-И пригушује. Идентификовали смо да СЦоВ2 ПЛпро антагонизује МДА5 ИСГилацију преко своје ензимске активности након везивања за сензор; ова стратегија је вероватно очувана међу корона вирусима, што захтева даљу истрагу. Анализа крио-електронске микроскопије открила је да је коронавирусни Нсп3 део комплекса пора који обухвата двомембранске везикуле изведене из ендоплазматског ретикулума и извози новосинтетизовану вирусну РНК42. Стога, МДА5 може да се позиционира у непосредној близини места извоза вирусне РНК да би олакшао детекцију ПАМП-а; међутим, ПЛпро домен Нсп3 (који се налази на цитоплазматској страни) блокира МДА5 сигнализацију кроз директну де-ИСГилацију. Неки вируси такође могу да инхибирају МДА5 ИСГилацију кроз дисрегулацију фосфорилације МДА5, као што је приказано за МеВ-В. Укратко, наша студија открива истакнуту улогу ИСГилације у активирању имунитета посредованог МДА{40}, као и његову инхибицију од стране СЦоВ2, откривајући потенцијалну молекуларну мету за дизајн терапеутика против ЦОВИД-а-19.
Референце
1. Лиу, Г. & Гацк, МУ Изразите и оркестриране функције РНК сензора у урођеним. Имунитет 53, 26–42 (2020).
2. Ву, Ј. & Цхен, ЗЈ Урођени имунолошки сенсинг и сигнализација цитосолних нуклеинских киселина. Анну. Рев. Иммунол. 32, 461–488 (2014).
3. Цхов, КТ, Гале, М.Јр & Лоо, ИМ РИГ-И и други РНА сензори у антивирусном имунитету. Анну. Рев. Иммунол. 36, 667–694 (2018).
4. Сцхлее, М. Главни сензори патогених РНА-РИГ-И рецептора. Имунобиологи 218, 1322–1335 (2013).
5. Рехвинкел, Ј. & Гацк, МУ Рецептори слични РИГ-И: њихова регулација и улоге у сенсингу РНК. Нат. Рев. Иммунол. 20, 537–551 (2020).
6. Виес, Е. ет ал. Дефосфорилација РНА сензора РИГ-И и МДА5 помоћу фосфатазе ПП1 је неопходна за урођену имунолошку сигнализацију. Имунитет 38, 437–449 (2013).
7. Гацк, МУ ет ал. ТРИМ25 РИНГ-фингер Е3 убиквитин лигаза је неопходна за антивирусну активност посредовану РИГ-И. Натуре 446, 916–920 (2007).
8. Цхианг, Ц. & Гацк, МУ Пост-транслациона контрола интрацелуларних путева сенсинга патогена. Трендс Иммунол. 38, 39–52 (2017).
9. Лазеар, ХМ, Сцоггинс, ЈВ & Диамонд, МС Заједничке и различите функције интерферона типа И и типа ИИИ. Имунитет 50, 907–923 (2019).
10. Шогинс, ЈВ Интерфероном стимулисани гени: шта сви они раде? Анну. Рев. Вирол. 6, 567–584 (2019).
11. Зханг, Д. & Зханг, ДЕ Интерфероном стимулисан ген 15 и систем ИСГилације протеина. Ј. Интерферон Цитокине Рес. 31, 119–130 (2011).
12. Пернг, ИЦ & Ленсцхов, ДЈ ИСГ15 у антивирусном имунитету и даље. Нат. Рев. Мицробиол. 16, 423–439 (2018). 13. Хадјадј, Ј. ет ал. Ослабљена активност интерферона типа И и инфламаторни одговори код тешких пацијената са ЦОВИД{7}}. Наука 369, 718–724 (2020).
14. Клемм, Т. ет ал. Механизам и инхибиција протеазе сличне папаину, ПЛпро, САРС-ЦоВ-2. ЕМБО Ј. 39, е106275 (2020).
15. Схин, Д. ет ал. Протеаза слична папаину регулише ширење вируса САРС-ЦоВ-2 и урођени имунитет. Природа 587, 657–662 (2020).
16. Ким, МЈ, Хванг, СИ, Имаизуми, Т. & Иоо, ЈИ Регулација негативне повратне спреге РИГ-И посредоване антивирусне сигнализације путем коњугације ИСГ15 изазване интерфероном. Ј. Вирол. 82, 1474–1483 (2008).
17. Ду, И. ет ал. ЛРРЦ25 инхибира ИФН сигнализацију типа И циљајући РИГ-И повезан са ИСГ15- за аутофагичну деградацију. ЕМБО Ј. 37, 351–366 (2018).
18. Хато, СВ ет ал. Водећи протеин менговируса блокира транскрипцију гена за интерферон-алфа/бета и инхибира активацију регулаторног фактора интерферона 3. Ћелијски микробиол. 9, 2921–2930 (2007).
19. Деддоуцхе, С. ет ал. Идентификација ЛГП2-повезаног МДА5 агониста у ћелијама инфицираним пикорнавирусом. еЛифе 3, е01535 (2014).
20. Дурфее, ЛА, Лион, Н., Сео, К. & Хуибрегтсе, ЈМ Те ИСГ15 систем коњугације широко циља на новосинтетизоване протеине: импликације на антивирусну функцију ИСГ15. Мол. Целл 38, 722–732 (2010).
21. Ленсцхов, ДЈ ет ал. Идентификација интерфероном стимулисаног гена 15 као антивирусног молекула током инфекције Синдбис вирусом ин виво. Ј. Вирол. 79, 13974–13983 (2005).
22. Гацк, МУ, Нистал-Виллан, Е., Инн, КС, Гарциа-Састре, А. & Јунг, ЈУ негативна регулација РИГ-И антивирусне активности посредована фосфорилацијом. Ј. Вирол. 84, 3220–3229 (2010).
23. Нистал-Виллан, Е. ет ал. Негативна улога фосфорилације РИГ-И серина 8 у регулацији производње интерферон-бета. Ј. Биол. Цхем. 285, 20252–20261 (2010).
24. Махарај, НП, Виес, Е., Столл, А. & Гацк, МУ Конвенционална протеин киназа Ц-алфа (ПКЦ-алфа) и ПКЦ-бета негативно регулишу трансдукцију РИГ-И антивирусног сигнала. Ј. Вирол. 86, 1358–1371 (2012).
25. Давис, МЕ ет ал. Антагонизам фосфатазе ПП1 од стране В протеина вируса малих богиња је неопходан за урођени имунски бег од МДА5. Целл Хост Мицробе 16, 19–30 (2014).
26. Лин, ЈП, Фан, ИК & Лиу, ХМ Те 14-3-3ета шаперон протеин промовише антивирусни урођени имунитет кроз олакшавање олигомеризације МДА5 и интрацелуларне редистрибуције. ПЛоС Патог. 15, е1007582 (2019).
27. Ву, Б. ет ал. Структурна основа за препознавање дсРНА, формирање филамента и активацију антивирусног сигнала помоћу МДА5. Целл 152, 276–289 (2013).
28. Иу, К., Ку, К. & Модис, И. Црио-ЕМ структуре МДА5-дсРНА филамената у различитим фазама хидролизе АТП. Мол. Целл 72, 999–1012 (2018).
29. Брунс, АМ, Лесер, ГП, Ламб, РА & Хорватх, ЦМ Те урођени имуни сензор ЛГП2 активира антивирусну сигнализацију регулацијом интеракције МДА5–РНА и склапања филамента. Мол. Целл 55, 771–781 (2014).
30. Уцхикава, Е. ет ал. Структурна анализа везивања дсРНА за рецепторе за препознавање антивирусних образаца ЛГП2 и МДА5. Мол. Целл 62, 586–602 (2016).
31. Малакхова, ОА ет ал. УБП43 је нови регулатор интерферонске сигнализације независно од његове активности изопептидазе ИСГ15. ЕМБО Ј. 25, 2358–2367 (2006).
32. Зханг, Кс. ет ал. Хумани интрацелуларни ИСГ15 спречава прекомерно појачавање интерферона-алфа/бета и ауто-инфламацију. Природа 517, 89–93 (2015).
33. Харцоурт, БХ ет ал. Идентификација продуката репликације корона вируса тешког акутног респираторног синдрома и карактеризација активности протеазе сличне папаину. Ј. Вирол. 78, 13600–13612 (2004).
34. Ротх-Цросс, ЈК, Бендер, СЈ & Веисс, СР Мишји вирус хепатитиса вируса корона вируса миша препознаје МДА5 и индукује интерферон типа И у можданим макрофагима/микроглијама. Ј. Вирол. 82, 9829–9838 (2008).
35. Менацхери, ВД ет ал. Слабљење и рестаурација мутанта коронавируса тешког акутног респираторног синдрома коме недостаје активност 2'-О-метилтрансферазе. Ј. Вирол. 88, 4251–4264 (2014).
36. Бекес, М. ет ал. Препознавање активности ди-убиквитина и деубиквитинирања везаних за Лис48- протеазе сличне папаину САРС коронавируса. Мол. Целл 62, 572–585 (2016).
37. Цхилдс, К. ет ал. мда-5, али не и РИГ-И, је уобичајена мета за протеине парамиксовируса В. Вирологи 359, 190–200 (2007).
38. Схи, ХКС ет ал. Позитивна регулација активације регулаторног фактора 3 интерферона од стране Херц5 преко ИСГ15 модификације. Мол. Целл Биол. 30, 2424–2436 (2010).
39. Бланцо-Мело, Д. ет ал. Неуравнотежен одговор домаћина на САРС-ЦоВ-2 покреће развој ЦОВИД-19. Целл 181, 1036–1045 (2020).
40. Спеер, СД ет ал. Недостатак ИСГ15 и повећана отпорност на вирусе код људи, али не и код мишева. Нат. Цоммун. 7, 11496 (2016).
41. Ерретт, ЈС, Сутхар, МС, МцМиллан, А., Диамонд, МС & Гале, М. Јр. Те суштинске, нередундантне улоге РИГ-И и МДА5 у откривању и контроли инфекције вирусом Западног Нила. Ј. Вирол. 87, 11416–11425 (2013).
42. Волф, Г. ет ал. Молекуларна пора покрива двоструку мембрану органеле репликације коронавируса. Наука 369, 1395–1398 (2020).
43. Мајор, ЕО ет ал. Успостављање линије хуманих феталних глијалних ћелија које подржавају размножавање ЈЦ вируса. Проц. Натл Ацад. Сци. УСА 82, 1257–1261 (1985).
44. Хертзог, Ј. ет ал. Инфекција бразилским изолатом Зика вируса генерише РИГ-И стимулациону РНК, а вирусни протеин НС5 блокира индукцију и сигнализацију ИФН типа И. ЕУР. Ј. Иммунол. 48, 1120–1136 (2018).
45. Церикан, Б. ет ал. Интринзична адаптација ћелије која произилази из хроничне аблације кључног регулатора рхо ГТПазе. Дев. Целл 39, 28–43 (2016).
46. Цхан, ИК & Гацк, МУ. Механизам вируса денга вируса заснован на фосфомиметици за антагонизацију урођеног имунитета. Нат. Иммунол. 17, 523–530 (2016).
47. Риедл, В. ет ал. Зика вирус НС3 опонаша ћелијски 14-3-3-мотив везивања да антагонизује РИГ-И- и МДА5-посредовани урођени имунитет. Целл Хост Мицробе 26, 493–503 (2019).
48. Улане, ЦМ, Родригуез, ЈЈ, Парисиен, ЈП & Хорватх, ЦМ СТАТ3 убиквитилација и деградација вирусом заушака потискују сигнализацију цитокина и онкогена. Ј. Вирол. 77, 6385–6393 (2003).
49. Оудсхоорн, Д. ет ал. ХЕРЦ6 је главна Е3 лигаза за глобалну коњугацију ИСГ15 у ћелијама миша. ПЛоС ОНЕ 7, е29870 (2012).
50. Ким, ДК ет ал. Свеобухватна, флексибилна колекција региона кодирања САРС-ЦоВ-2. Г3 (Бетхесда) 10, 3399–3402 (2020).
51. Цхианг, Ц. ет ал. Онкопротеин хуманог папилома вируса Е6 циља на УСП15 и ТРИМ25 да потисне РИГ-И посредовану урођену имунолошку сигнализацију. Ј. Вирол. 92, е{7}} (2018).
52. Гацк, МУ ет ал. Улоге РИГ-И Н-терминалне тандем ЦАРД и варијанте спајања у ТРИМ25-посредованој антивирусној трансдукцији сигнала. Проц. Натл Ацад. Сци. УСА 105, 16743–16748 (2008).
53. Цхианг, ЈЈ ет ал. Вирусно демаскирање ћелијских 5С рРНА псеудогених транскрипата индукује имунитет посредован РИГ-И. Нат. Иммунол. 19, 53–62 (2018).
54. Спаррер, КМЈ ет ал. ТРИМ23 посредује аутофагију изазвану вирусом преко активације ТБК1. Нат. Мицробиол. 2, 1543–1557 (2017).
