Болест бубрега: Како никл изазива аутофагију у бубрезима?

За више информација:Ali.ma@wecistanche.com

Део Ⅰ: Никл индукује аутофагију преко ПИ3К/АКТ/мТОР и АМПК путева у бубрезима миша

Хенг Иин, Зхицаи Зуо и др.

1. Представљање

Никл(Ни), природни елемент, широко је распрострањен у деловима животне средине, укључујући земљиште, воду и ваздух (Сцхренк ет ал, 2020). Ни (Никл)једињења и метални Ни (Никл)имају многе индустријске и комерцијалне примене, као што су производња легура, галванизација, никл-кадмијум батерије и катализатори у хемијској и прехрамбеној индустрији (Генцхи ет ал., 2020). Међутим, огромна индустријска употреба Ни (Никл)доводи до широко распрострањеног загађења животне средине, што повећава ризик од излагања људи Ни кроз храну и воду за пиће (Дас ет ал, 2018). Иако Ни (Никл) је есенцијални микронутријент за људе и животиње, прекомерно излагање Ни је изузетно опасно по здравље људи (Дас ет ал., 2018).

Са повећањем инциденције Ни (Никл)Контаминација последњих година, токсикологија Ни, укључујући имунотоксичност, хепатотоксичност, нефротоксичност и плућну токсичност, привлачи све већу пажњу (Гатхван ет ал., 2013; Денг ет ал., 2016; Хасанеин и Фелегари, 2017; Гуо ет ал., 2020а). 2020б). Тхебубрега, као важан циљни орган у Ни (Никл)токсикологију, са акумулацијом Ни (Никл)и Ни (Никл)једињења у њима кроз хроничну изложеност могу изазвати значајно оштећење бубрега (Елангован ет ал, 2018). Постојећа истраживања нашег истраживачког тима су показала индукцију оксидативног стреса, апоптозе, упале и заустављања ћелијског циклуса убубрегабројлера од НиЦл2 (Никлхлорид 2) у храни која прелази 300 мг/кг (Гуо ет ал, 2014, 2016а,2016б). Неколико студија је сугерисало да механизам токсикологије Ни бубрега укључује оксидативно оштећење, прекиде ланца ДНК и апоптозу (Лее ет ал, 2001; Цхен ет ал., 2010).

Игра кључну улогу у ћелијској хомеостази,аутофагијаутврђено је да постоји повезаност са инциденцом и патогенезом различитих болести (Мартин ет ал, 2019). Недавне студије су показале да ћелијска смрт може бити посредована неконтролисаним или прекомерном стимулацијомаутофагија(Дентон и Кумар, 2019). Као сложен и високо уређен унутарћелијски процес,аутофагијапочиње формирањем двомембранских везикула познатих као аутофагозоми који гутају део цитосола и органела (Мартин ет ал, 2019). Након тога, аутофагозоми учествују у протеолизи захваћених супстанци након преласка у лизозоме.

Аутофагијаје осетљив на различите врсте ћелијског стреса, као што су недостатак фактора раста или хранљивих материја, хипоксија, оштећење ДНК, реактивне врсте кисеоника (РОС), агрегација протеина, интрацелуларни патогени или оштећење органела (Додсон ет ал, 2013). То је изузетно сложен процес за регулисањеаутофагија, који укључује много сигналних путева, укључујући протеин киназу активирану аденозин монофосфатом (АМПК), фосфатидилинозитол 3-киназу-И (ПИ3К) и мета рапамицина (мТОР) путева сисара (Цао ет ал2021). И, мТОР пут има кључни ефекат уаутофагијаиницијација. мТОР активност је основна контролна тачкааутофагија, чији инхибиторни ефекат доводи до дефосфорилације ослобађања УЛК1аутофагијаинхибиција (Парзвцх и Клионски, 2014). Штавише, ПИ3К/Акт и АМПК су главни узводни регулатори мТОР (Гонг ет ал, 2020; Ксу ет ал, 2020). Претходна истраживања су показала да тешки метали (као што су Цд, Хг, Цу и Пб) могу изазвати појавуаутофагија(Су ет ал, 2017). Иако Хуанг ет ал. (2016) и Сон ет ал. (2017) су утврдили да Ни (Никл)изложеност може ефикасно да изазовеаутофагијау ћелијама бронхијалног епитела, прецизан механизам је још увек нејасан,

Ефекат Ни (Никл)нааутофагијаје ретко пријављен, а доступно је само неколико студија о ефектима Ни на бубрегеаутофагијамишева ин виво. Дакле, тренутни рад има за циљ да потврди да ли НиЦл2 (Никлхлорид 2)третман може изазватиаутофагијаи да процени потенцијални механизам НиЦл (Никлхлорид)-индукованааутофагија, укључујући АМПК и ПИ3К/АКТ/мТОР путеве.

Никл утиче на бубреге и изазива болест бубрега

Кликните на Цистанцхе за болест бубрега

2. Материјал и методе

2.1. Хемикалије и антитела

Никлхлорид(НиЦл) је обезбедила Цхенгду Келонг Цхемицал Цо., Лтд (Ченгду, Кина). У имуноблот анализи, сва антитела су купљена од Целл Сигналинг Тецхнологи (ЦСТ, САД), укључујући лаки ланац 3Б (ЛЦ3Б) повезан са протеином 1 против зеца микротубула 3Б (ЛЦ3Б) (Мачка бр. 43566Т), анти-зечји п62 (СКСТМ1) (Мачка бр.5114Д), против зеца Бецлин1 (Мачка бр.3495Т), против зецааутофагијасродни протеин12 (Атг12) (Мачка бр. 4180Т), анти-зечји Атг5 (Мачка бр. 12994Т), анти-зечји Атг16Л1 (кат бр. 8089Т), анти-зечји Атг7 (кат бр. 8558Т), анти-зечји Атг3 ( Цат бр.3415Т), циљ рапамицина против зеца сисара (мТОР) (Мачка бр. 2983Т), анти-зечји п-мТОР (Мачка бр. 5536Т), анти-зечји унц-51 попут киназе 1 (УЛК1 )(Мачка бр.8054Д), анти-зечја п-УИК1(Мачка бр.5869Т), анти-зечја ПИ3К(Мачка бр.4292С), анти-зечја п ПИ3К(Мачка бр.4228Т, анти-зечја Акт(Мачка бр. .9272С), анти-зечји п-Акт (кат бр. 4060Т), анти-зечји мТОР (кат бр. 2972С), анти-зечји п-мТОР (кат бр. 5536С), анти-зечји АМПК (кат бр. 5831С ), анти-зечји п-АМПК (кат. бр. 2535С) и -актин (кат. бр. 4970Т).

2.2. Животиње и третмани

Укупно 160 здравих мужјака ИЦР мишева старих осам недеља обезбедила је компанија Дасхуо Биологицал Тецхнологи Цомпани (Ченгду, Кина). Све животиње су држане у константним условима (температура 25±2Ц;12-х циклус светло-мрак) у асептичном окружењу и храњене стандардном исхраном са пелетима и водом ад либитум. Мишеви су класификовани у четири групе насумично, од којих је свака садржала четрдесет микрофона након седам дана аклиматизације. Контроли је интрагастрично давана дестилована вода, док је Ни (Никл)(НиЦл2 (Никлхлорид 2).6Х2О) са дозама од 7,5,15 и 30 мг/кг је даван интра-гастрично за животиње у експерименталним групама. Ни усвојен овде је одређен према вредности средње смртоносне дозе (ЛД50, 306,11 мг/кг) постигнуте у истраживању акутне оралне токсичности мужјака мишева. НиЦл (Никлхлорид),.6ХЗО је разблажен коришћењем дестиловане воде пре извођења експеримената. Четири групе су даване са дозом од 1 мЛ на 100 г телесне тежине једном дневно током 28 дана. Након третмана током 14 и 28 дана, све животиње су хумано жртвоване да би се сакупилебубрегаузорци за анализу у одељцима испод. Све експерименталне животиње и поступци су спроведени у складу са споразумом који је добио одобрење од Комитета за бригу о животињама и Етичког комитета на пољопривредном универзитету Сицхуан (бр. одобрења:2012-024, Цхенгду, Кина).

2.3. Одређивање индекса и функција бубрега

Сви мишеви су мерени сваке недеље и хумано жртвовани по завршетку третмана, а затимбубрезибили исечени и измерени. Тхебубрегакоришћени индекс је био однос измеђубубрегатежина и телесна тежина.

Истраживачи су мерили азот урее у крви (БУН) и нивое серумског креатинина (ЦРЕ) пратећи упутства комерцијалних комплета које је произвео Наниинг Јианцхенг Биоенгинееринг Институте оф Цхина (Нањинг, Кина),

2.4. Одређивање акумулације Ни у бубрезима (Никл)

Бубрегузорци су узети 28. дана током експеримента. Затим, 1 мЛ ХЦиО и 9 мЛ ХНО. (Цхенгду Келонг Цхемицал Цо., Лтд., Кина) су коришћени за мокро варење 0.5 г порција узорака током 24 х у цевима отпорним на високе температуре. Затим су ове епрувете стављене на врућу плочу да би се испарила сва течност, након чега је уследила суспензија остатка коришћењем 10 мЛ 0,1 М/Л ХНО. Након тога, истраживачи су анализирали узорке у смислу Ни (Никл)уз помоћ пламеног атомско апсорпционог спектрофотометра (ААС700, ПеркинЕлмер, САД).

2.5. Хистопатолошко и ултраструктурно посматрање

Након што се сакупи и затим фиксира у 4 процента параформалдехида,бубрегаузорци су дехидрирани алкохолом, стављени у парафин, исечени на 5 ум, и обрађени да се боје са хематоксилином и еозином. Дигитални фотоапарат (Никон ДС-Ри1, Јапан) је коришћен за посматрање резова и фотографисање хистопатолошких промена. По десет микроскопских поља свакогбубрегабили прегледани. Слике приказане у раду биле су репрезентативне.

За ултраструктурну процену, 2,5 одсто глутаралдехида је примењено за фиксирањебубрегаткива (око 1 мм5) на собној температури. Након тога је уследило накнадно фиксирање ових ткива у 1 проценту осмијум тетроксида, дехидрирано у ацетону и уграђено у епоксидну смолу. Припремљени ултратанки резови су стављени на бакарне мреже, а затим обојени уранил ацетатом и оловним ацетатом. Ултраструктурне слике су снимљене коришћењем ЈЕМ-1400електронског микроскопа за пренос блица (ЈЕОЛ, Јапан).

обновити и побољшати функцију бубрега: цистанцхе

2.6. Имунохистохемијски

Након депарафинисања помоћу ксилена, парафинске кришке су рехидриране коришћењем степенованог сета раствора етанола. Затим је уследило испирање дестилованом водом и ПБС, и 15 мин блокирање активности ендогене пероксидазе (ЕПА) кроз инкубацију коришћењем 3 процента Х,О у метанолу за гашење ЕПА. Да бисмо олакшали проналажење антигена, третирали смо кришке кроз микроталасно загревање 15 минута у 0.01 М натријум цитратни пуфер са пХ од 6,0. Након засићења нормалним 10% козјим серумом током 30 минута, кришке су затим подвргнуте инкубацији коришћењем примарних антитела преко ноћи на 4 степена. 1 процентно биотиниловано козје анти-зечје/мишје ИгГ секундарно антитело (Бостер, Вухан, Кина) је коришћено за инкубацију резова испраних ПБС-ом на 37 степени током 1 сата, а затим на 37 степени, стрептавидин-биотин комплекс (САБЦ; Бостер , Вухан, Кина) коришћен је 30 мин. Затим је уследило потапање резина у диаминобензидин хидрохлорид (ДАБ; Бостер, Вухан, Кина) за визуелизацију имунореакције. Коначно, након лаганог контрастног бојења хематоксилином, резови су дехидрирани етанолом, очишћени ксиленом и монтирани, сукцесивно.

Интегрисана оптичка густина (ИОД) је коришћена за квантификацију нивоа протеина ЛЦ3Б и п62. Аналитичка метода за ИОД вредност се односила на Фангет ал. (2018). За снимање слика је усвојен Никон ДС-Рил систем дигиталних микроскопских камера (Јапан). Истраживачи су затим одабрали пет поља (0.064 мм²) у свакој области слика сваког пресека за анализу уз помоћ софтвера Имаге-Про Плус в6.0 (Медиа Ци-бернетицс Инц, Бетхесда, МД, САД ).

2.7. Вестерн блоттинг

Екстракција протеина избубрегаузорци су рађени коришћењем РИПА пуфера за лизу, а за мерење концентрације коришћен је реагенс за анализу БЦА протеина (П0010С, Беиотиме Тецхнологи, Кина). СДС-ПАГЕ је затим спроведен за узорке протеина, који су потом пребачени на нитроцелулозне мембране. Блокиране коришћењем 5% обраног млека током 1 х на собној температури, мембране су инкубиране са примарним антителом на 4 степена преко ноћи. Након употребе секундарног антитела коњугованог с пероксидазом рена за инкубацију током 1 х, коришћен је Цхемидоц КСРС за детекцију протеинских трака на мембранама коришћењем ЕЦЛ комплета (П0018А, Беиотиме Тецхнологи, Кина).

2.8. Квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену (кРТ-ПЦР)

БубрезиУзети су и млевени течним азотом у малтеру помоћу тучка, а затим сачувани на ниској температури (-80 степен), укупна РНК бубрега је екстрахована коришћењем РНАисо Плус (9108/9109, Такара, Отсу, Јапан) у складу са препорукама произвођач. Затим је уследила синтеза комплементарне ДНК (цДНК) са РР047А Прим-СцриптТМ РТ комплетом реагенса који је произвела Такара у Јапану према упутствима. Након тога, кРТ-ПЦР је спроведен коришћењем ЛигхтЦицлер ⑩ 480 ПЦР система у реалном времену (Био-Рад, САД) и комплета СИБР Премик Ек ТакТМИИ (ДРР820А, Такара, Јапан). Прајмери ​​који се користе за ПЦР су наведени у табели 1. -актин је коришћен за нормализацију експресије гена, а релативна експресија мРНК је израчуната помоћу 2-4ац методе (Ливак и Сцхмиттген, 2001).

2.9. Статистичка анализа

Подаци су изражени у облику средње вредности ± стандардна девијација и анализирани помоћу ЛСД или Дунетт-ове Т3 анализе варијансе. СПСС софтвер (верзија 22.0, ИБМ Цорп, Армонк, НИ, УСА) је коришћен за све статистичке анализе за Виндовс. П<0.05 represents="" a="" significant="">

Табела 1: Секвенца прајмера коришћених у студији,

3. Резултати

3.1.НиЦлз (Никлхлорид)нарушава функцију бубрега

Као што је приказано на слици 1А, телесна тежина је опала у три групе третиране НиЦл2 (Никлхлорид 2). Такође је утврђено значајно смањење релативне тежинебубрега(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Серум ЦРЕ и БУН су коришћени као стандардни биомаркери за функцију бубрега. Резултати бубрежне функције су приказани на сл. 1Ц и Д, а концентрације ЦРЕ и БУН су значајно повећане (П<0.05)in the=""> (Никлхлорид 2)-третман групе 14. и 28. дана у односу на контролу.

Слика 1Е је показала да три Ни (Никл)групе за лечење имају значајно веће концентрације Ни у бубрезима (П<0.05)compared to="" the="">

3.2. НиЦл (Никлхлорид)- индукује хистопатолошке варијације бубрега

Слика 2 показује да НиЦлз (Никлхлорид)третман је изазвао хистопатолошке варијацијебубрегаса дозама и временом, укључујући отечени гломерул заједно са суженим капсуларним простором, вакуоларну и грануларну дегенерацију у бубрежном тубуларном епителу.

Слика 2. НиЦл2 (Никлхлорид 2)изазива хистопатолошке промене у бубрегу.

Хистопатолошке лезије су укључивале отечени гломерул заједно са суженим капсуларним простором (*), вакуоларну дегенерацију (црне стрелице) и грануларну дегенерацију (беле стрелице) у бубрежним тубуларним епителима. ХЕ бојење, скала=50 µм.

3.3.НиЦл (Никлхлорид)индукује аутофагију и повећава гене и протеине повезане са аутофагијом у бубрезима

ЛЦ3 и п62 су кључни биомаркери зааутофагија(Гомез-Сан-цхез ет ал..2016). У поређењу са контролом, три НиЦл2 (Никлхлорид 2) групе на третману су сведоци значајног повећања нивоа протеина ЛЦ3-И/И (П< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">аутофагијаје такође одређивање ТЕМ-а у овој студији. Као што је приказано на слици 3Ф, ТЕМ запажања су показала да је број аутолизосома повећан у бубрежном ткиву након НиЦл2 (Никлхлорид 2)изложеност.

Слика 3. НиЦл2 (Никлхлорид 2)повећава аутофагију у бубрезима мишева.

(А) Вестерн блот резултати ЛЦ3 и п62. (Б, Ц) Квантификација ЛЦ3-ИИ/И и п62. (ДЕ) Експресија мРНК ЛЦ3 и п62. (Ф)

Ултраструктурна структура епителне ћелије проксималног увијеног тубула (десне слике показују делимично увећање левих фигура; црне стрелице показују структуре аутолизозома).

Вредности су представљене са средњим вредностима ± стандардна девијација (н {{0}}). Колоне означене различитим словима су значајне разлике (П <>

Штавише, имунохистохемија је коришћена за мерење нивоа протеина ЛЦ3Б и п62 убубрегаткива у овој студији. Као што је приказано на слици 4, позитивне ћелије су обојене браон, а ЛЦ3Б и п62 су углавном експримирани у цитоплазми епителних ћелија бубрежних тубула. У поређењу са контролом, ИОД вредности ЛЦ3Б су показале значајно повећање (П< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Никлхлорид) 14. и 28. дана. Поред тога, ИОД вредности п62 су значајно смањене (П< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Слика 4. Резултати имунохистохемије ЛЦ3Б и п62 у бубрезима мишева.

(А) Имунохистохемијске слике ЛЦ3Б. (бар=50 µм) (Б) Имунохистохемијске слике п62 (скала бар=50 µм)

(Ц) Интегрисана оптичка густина (ИОД) ЛЦ3Б. (Д) Интегрисана оптичка густина (ИОД) п62.

Вредности су представљене са средњим вредностима ± стандардна девијација (н {{0}}). Колоне означене различитим словима су значајне разлике (П <>

Гени и протеини повезани сааутофагијаи укључени уаутофагијафлукс је измерен да би се додатно проверили ефекти НиЦл (Никлхлорид) нааутофагија. То укључује Бецлин1, Атг5, Атг12, Атг16Л1, Атг7 и Атг3 (Ли и Зханг.2019; Нишимура и Тоозе,2020). Као што је приказано на Сл.5А-Ц, у поређењу са контролом, третиране групе Ни (Никл)показују значајно више нивое протеина Бецлинл, Атг5, Атг12, Атг16Л1, Атг7 и Атг3(П<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Слика 5. НиЦл2 (Никлхлорид 2)повећава гене и протеине повезане са аутофагијом у бубрезима мишева.

(А) Вестерн блот резултати Бецлин1, Атг5, Атг12, Атг16Л1, Атг7 и Атг3. (Б&Г) Квантификација експресије протеина Бецлин1, Атг5, Атг12, Атг16Л1, Атг7 и Атг3.

(ХМ) Експресија мРНК Бецлин1, Атг5, Атг12, Атг16Л1, Атг7 и Атг3. Вредности су представљене са средњим вредностима ± стандардна девијација (н=8). Колоне означене различитим словима су значајне разлике (П <>

3.4.НиЦл2 (Никлхлорид 2)индукује ПИ3К/Акт/мТОР и АМПК путеве у бубрезима

мТОР је неопходан регулатораутофагија(Ванг ет ал., 2017). А добро успостављени путеви узводног регулатора мТОР укључују ПИ3К/Акт и АМПК (Гонг ет ал..2020: Ксу ет ал..2020). Дакле, ова студија је мерила протеин АМПК и ПИ3К/Акт путева.

Како Фг.6А и Б показују да је утврђено да нивои протеина п-ПИ3К, п-АКТ и п-мТОР имају значајно смањење (П< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Никлхлорид 2)14. и 28. дана експеримента у односу на контролу. Групе за третман су показале значајно веће нивое протеина п-АМПК и п-УЛК1 (П<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Никлхлорид 2)Утврђено је да су третиране групе имале значајно смањење експресије мРНА ПИ3К, АКТ и мТОР (П<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Ови резултати то откривајуаутофагијаиндуковано НиЦл2 (Никлхлорид 2)у бубрезима миша укључени су путеви АМПК и ПИ3К/Акт/мТОР.

Слика 6. НиЦл2 (Никлхлорид 2)индукује ПИ3К/Акт/мТОР и АМПК сигналне путеве у бубрезима мишева.

(А) Вестерн блот резултати п-ПИ3К, ПИ3К, п-АКТ, АКТ, п-АМПК, АМПК, п-мТОР, мТОР, п-УЛК1 и УЛК1.

(БФ) Квантификација експресије п-ПИ3К/ПИ3К, п-АКТ/АКТ, п-АМПК/АМПК, п-мТОР/мТОР и п-УЛК1/УЛК1 протеина. (Г, К)

Експресија мРНА ПИ3К, АКТ, АМПК, мТОР и УЛК1. Вредности су представљене са средњим вредностима ± стандардна девијација (н=8). Колоне означене различитим словима су значајне разлике (П <>

КЛИКНИТЕ ОВДЕ ДА СЕ ДЕЛИТЕⅡ