Ниске концентрације параквата изазивају рану активацију екстрацелуларне сигнално регулисане киназе 1/2, протеин киназе Б и Ц-Јун Н-терминалне киназе 1/2 путеви: Улога Ц-Јун Н-терминалне киназе у ћелијској смрти изазваној паракватом

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Миреиа Нисо-Сантано, Јосе´ М. Мора´н, Лоурдес Гарцı´а-Рубио, Ана Го´мез-Мартı´н, Роса А. Гонза´лез-Поло, Герма´н Солер,§ и Јосе´ М. Фуентес

Апстрактан:

Паракват је хербицид са потенцијалним ризиком да изазове паркинсонизам због доказане неуротоксичности и јаке структурне сличности са 1-метил-4-фенилпиридинијумом (МПП плус), добро познатим неуротоксином који изазива сличан клинички синдром доПаркинсонова болест(ПД). Међутим, тренутно се врло мало зна о сигналним путевима које активира паракват у било ком ћелијском систему. У овој студији смо истраживали ефекат параквата на активацију киназе 1 и 2 регулисане екстрацелуларним сигналом (ЕРК1/2), ц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК) и протеин киназе Б (ПКБ) у Е18 ћелијама. Ниске концентрације параквата стимулисале су веома рано повећање фосфорилације ЕРК1/2, ЈНК1/2 и ПКБ. Инхибитори фосфатидилинозитол 3-киназе (ПИ{{13}К) вортманин и ЛИ 294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Х{{ 19}}бензопиран{20}}оне) инхибирао је рано повећање фосфорилације ПКБ изазвано паракватом. Штавише, рано паракватом посредовано повећање активације ЕРК1/2 било је осетљиво на инхибитор протеин киназе киназе 1 (МЕК1) активиран митогеном ПД 98059(2#-амино-3#-метоксифллавон), док су одговори ЈНК1/2 били блокира ЈНК1/2 инхибитор СП 600125 (антра[1-9-цд]пиразол-6(2Х)-он). Предтретман вортманином, ЛИ 294002 или ПД 98059 није утицао на смрт паракват ћелија у Е18 ћелијама. Насупрот томе, СП 600125 је значајно смањио ћелијску смрт изазвану паракватом у Е18 ћелијама. У закључку, показали смо да ниске концентрације параквата стимулишу снажно врло рано повећање фосфорилације ЕРК1/2, ЈНК1/2 и ПКБ у Е18 ћелијама. Штавише, представљени подаци сугеришу да инхибиција ЈНК1/2 пута штити ћелије Е18 од ћелијске смрти изазване паракватом и подржава чињеницу да инхибиција ране активације ЈНК1/2 може представљати потенцијалну стратегију у лечењу ПД. Кључне речи: паракват; ниске концентрације; ЈНК; смрт ћелије; Паркинсон.

Биљка против Паркинсонове болести:цистанцхе

УВОД

Паркинсонова болест (ПД)је неуродегенеративни поремећај који се карактерише смрћу допаминергичких неурона у суб-Цонстантиа нигра у комбинацији са интрацитоплазматским инклузијама познатим као Левијева тела (Оланов и Таттон, 1999). Само 5–10 процената пацијената са ПД има породични облик ове болести са аутозомно доминантним начином наслеђивања (Гассер, 2001). Генетски фактори су важни код младих пацијената, али није вероватно да ће играти главну улогу у чешћим спорадичним ПД. Насупрот томе, епидемиолошке студије указују на неколико фактора животне средине који повећавају ризик од развоја ПД(Паркинсонова болест). То укључује пестициде, хербициде, индустријске хемикалије, пољопривреду и живот у руралним срединама (Цори-Слецхта ет ал., 2005; Гассер, 2001; Ландриган ет ал., 2005; Таннер и БенСхломо, 1999). Најубедљивији аргумент у прилог фактора животне средине у ПД односи се на откриће биолошких ефеката МПТП-а (1-метил-4-фенил-1,2,3,6- тетрархија-дропиридин). Овај токсин централног нервног система производи синдром који је и клинички и анатомски сличан ПД (Копин и Маркеи, 1988; Лангстон ет ал., 1983). У том смислу, широко коришћени хербицид паракват (1,1#-диметил-4,4#-бипиридинијум) је предложен као претпостављени фактор ризика на основу његове структурне хомологије са МППþ, активним метаболитом МПТП ( Таннер и Лангстон, 1990), и на извештаје о паркинсонизму који су повезани са изложеношћу узрочнику (Хертзман ет ал., 1990; Хуббле ет ал., 1993; Јименез-Јименезет ал., 1992; Лиоу ет ал., 1997; Ванг ет ал. ал., 1992). Међутим, док су сигнални путеви укључени у МППþ ћелијску смрт добро познати (Халворсен ет ал., 2002; Гомез-Сантос ет ал., 2002; Гонзалез-Поло ет ал., 2003), врло мало се зна о активираним сигналним путевима паракватом (Цхенг ет ал., 2003; Цхун ет ал., 2001; Пенг ет ал., 2004) У сваком случају, не постоје студије о раним догађајима уоченим након излагања ниским концентрацијама параквата.

Неколико стимулуса, укључујући МППþ и паракват, може активирати низ интрацелуларних сигналних каскада које су блиско повезане и са смрћу ћелије и путевима преживљавања ћелије. На пример, МППþ (Гомез-Сантос ет ал., 2002; Халворсен ет ал., 2002) активира чланове породице протеин киназе активиране митогеном (МАПК) и протеин киназе Б (ПКБ). Чланови ТхеМАПК породице активирају МППþ или паракват укључују киназе 1 и 2 регулисане екстрацелуларним сигналом (ЕРК1/2), ц-Јун Н-терминалне киназе (ЈНК1 и ЈНК2) и п38 МАПК. Опште је прихваћено да ЕРК1/2 и активација ПКБ промовише преживљавање ћелија активирањем анти-апоптотичких сигналних путева, док је активација ЈНК1/2 и п38 МАПК повезана са смрћу неуронских ћелија (Харпер и ЛоГрассо, 2001; Схин ет ал., 2001; Ксиа ет ал., 1995) . Активација фосфатидилинозитол 3-киназе (ПИ-3К)/ПКБ пута је укључена у преживљавање неурона (Схин ет ал., 2001). Конкретно, активација ЈНК1/2 пута може да игра кључну улогу у токсичности МПП и параквата (Цассарино ет ал., 2000; Халворсен ет ал., 2002; Пенг ет ал., 2004) и последично у ћелијским процесима на које утиче ПД(Паркинсонова болест).

Херб цистанцхе: Анти-Паркинсонова болест

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Ћелијска линија и култура.

У овој студији коришћени су спонтано овековечени неуробласти мозга пацова, Е18 ћелије. Ћелијска линија Е18 је добијена спонтаном имортализацијом из култура 18-дневних феталних можданих кортекса пацова и љубазно ју је обезбедио др А. Мун˜оз (Институто де ИнвестигационесБиоме´дицас, ЦСИЦ, Мадрид, Шпанија) . Е18 ћелије представљају примитивне неуробласте који експримирају НФ 68 и примитивни неуронски маркер нестин, али им недостаје маркер астроцита, глијални фибриларни кисели протеин. После индукције делимичне диференцијације са дибутирил-цАМП, ћелије експримирају додатне неуронске маркере као што су НФ 145, НФ 220 и енолаза специфична за неуроне (Мун˜оз, лична комуникација). Ћелије су узгајане у Ханксовом Ф-12 (Хицлоне, Бревиерес, Француска) и допуњене са 10 процената ФЦС (Хицлоне), стрептомицином (100 мг/мл) и пеницилином (100 У/мл). Ћелије су засејане на 5 3 10 5 у боцу за културу ткива 75-цм2 (ТПП, Трасадинген, Швајцарска) и инкубиране на 37 Ц у атмосфери од 5 процената ЦО2/95 процената ваздуха. Културе су пасиране једном недељно трипсинизацијом коришћењем раствора трипсин-ЕДТА (Хицлоне).

Третмани ћелијама.

Конфлуентне ћелије (~ 80 процената) у боци за културу ткива 75-цм2 су трипсинизоване и засејане у посуде за културу ткива у концентрацији од 5 3104 ћелија/цм2. Двадесет четири сата касније, медијум је аспириран и замењен само свежим медијумом или медијумом који садржи назначене концентрације параквата. У даљим експериментима, различите концентрације инхибитора киназе (ЛИ 294002, вортманин, СП 600125 и ПД(Паркинсонова болест)98059, сви из Токриса, Бристол, Уједињено Краљевство) су додати 30 минута пре излагања параквату. Пошто су инхибитори киназе растворени у диметил сулфоксиду, контроле су направљене са највишом коришћеном концентрацијом (0,2 процента вол/вол). Додатак диметил сулфоксида није утицао на вредности виталности контролних плоча.

Тест виталности ћелија.

Вијабилност ћелија је одређена колориметријским МТТ тестом (Мосманн, 1983). У живим ћелијама, митохондријски ензим сукцинат дехидрогеназа може да метаболише МТТ у формазанску боју која апсорбује светлост на 570 нм. За ове експерименте коришћене су 24-плоче за испитивање бунара. На крају сваког третмана, 100 лл МТТ припремљеног у концентрацији од 5 мг/мл у ПБС је додато у сваку плочу. После 3 х инкубације, медијум је декантован, а преципитати формазана су растворени киселим изопропанолом (0,04–0,1 Н ХЦл у апсолутном изопропанолу). Апсорбанца конвертоване боје је мерена на таласној дужини од 570 нм са одузимањем позадине на 630–690 нм. Апсорбанција нетретираних култура је постављена на 100 процената.

Да би се потврдили резултати добијени МТТ тестом, ћелијска смрт је такође процењена мерењем ослобађања цитосолног ензима лактат дехидрогеназе (ЛДХ) у медијум културе коришћењем колориметријског комплета за ЛДХ тест (Роцхе, Индианаполис, ИН) према упутствима произвођача . Цурење ЛДХ је дефинисано као однос активности ЛДХ у медијуму културе према укупној активности по бунарчићу (3100). Упоредиви подаци су добијени коришћењем обе методе.

Припрема ћелијских екстраката и Вестерн блот анализа.

Након експерименталних третмана, ћелије (култивисане у посудама од 60- мм) су два пута испране хладним ПБС-ом и уклоњене шкартом, а затим центрифугиране на 900 3 г 5 минута на 4 Ц. Ћелије су лизиране у пуферу који садржи 50мМ ХЕПЕС, пХ 7,5, 300мМНаЦл, 1% Тритон Кс-100, 2мМ ЕДТА, 5мМ МгЦл2, 25мМ НаФ, 1мМНа3ВО4 и коктел инхибитора протеазе (Сигма, Ст Лоуис, МО). Ћелије су центрифугиране на 13,000 3 г током 5 минута на 4 Ц. Супернатанти су чувани на 80 Ц до анализе Вестерн блот-ом. Концентрација протеина је мерена према Брадфорду (1976) коришћењем БСА као стандарда.

Једнаке количине протеина (10 ЛГ по стању) су растворене у 12% СДС гел електрофорези и пренете на ПВДФ мембране према конвенционалним делимично модификованим методама (Фуентес ет ал., 2000). Укратко, протеини су пребачени (250 мА током 60 мин) на ПВДФ мембране коришћењем Мини Транс-Блот Целл апарата (Био-Рад, Херцулес, ЦА). Процедура за имунодетекцију укључује пренос и блокирање мембране (60 мин на собној температури) са ТТБС (10мМ Трис/ХЦл, пХ 7,5, 150мМ НаЦл и 0,2% Твеен-20) који садржи 10% немасног сушеног млека. Мембране су затим инкубиране 60 минута на собној температури са зечјим поликлонским примарним антителима (сва из Целл Сигналлинг, Беверли, МА, разблажене 1:1000) у ТТБС þ 10 процената немасног сушеног млека или 5 процената БСА. После испирања (два 5- мин периода са ТТБС), мембране су инкубиране (60 мин на собној температури) са секундарним антителима зеца коњугованим са пероксидазом (1:5000 у ТТБС са 10 процената немасног сушеног млека). Након испирања (два 5-мин. периода и један 10-}мин период), детекција везаних антитела је визуелизована хемилуминисценцијом коришћењем ЕЦЛ-плус реагенса (Амерсхам Биосциенцес, Орсаи, Француска) и анализирана помоћу Куантити-а Један софтвер (Био-Рад). Садржај актина је анализиран као контрола коришћењем зечјег поликлонског антитела (из Сигме) разблаженог 1:2500 у ТТБС са 10% немасног сушеног млека).

Статистичка анализа.

Сваки експеримент је поновљен најмање три пута са задовољавајућом корелацијом између резултата појединачних експеримената. Приказани подаци су они репрезентативног експеримента; свака група је била у просеку од три до четири јела културе. Сви подаци су изражени као средња вредност ±СЕМ. Резултати су анализирани помоћу АНОВА. Вредности п мање од 0.05 сматране су значајним.

Анти-Паркинсонова болест:Екстракт Цистанцхе

РЕЗУЛТАТИ

Цитотоксични ефекти параквата у ћелијама Е18

Као што је раније објављено (Цаппеллетти ет ал., 1998; Цхун ет ал., 2001; Гонзалез-Поло ет ал., 2004), неколико ћелијских линија је осетљиво на токсична својства параквата. Излагање параквату изазвало је смањење виталности ћелија зависно од дозе. (Слика 1.) У овој студији, ћелије Е18 третиране са 25 лМ параквата током 24 х показале су губитак виталности ћелије од 50 процената. Вијабилност ћелија је процењена мерењем трансформације у МТТ у формазанску боју која апсорбује светлост на 570 нм. Овај тест се у великој мери користи за праћење ћелијске смрти у неколико ћелијских линија, укључујући ћелије Е18 (Донаире ет ал., 2005; Гарциа-Роман ет ал., 2001) и различите увреде, укључујући паракват (Цхун ет ал., 2001; Гонзалез -Поло ет ал., 2004).

Активација ЕРК1/2 у Е18 ћелијама изазвана паракватом

Повећање активације ЕРК1/2 у Е18 ћелијама третираним паракватом праћено је Вестерн блотингом коришћењем фосфоспецифичног ЕРК1/2 (Тхр202/Тир204) антитела. Експозиција ћелија Е18 неуробласта са 25 лМ параквата је изазвала значајно повећање фосфорилационог (Тхр202/Тир204) статуса ЕРК1/2 (44/42 кДа) (слика 2А). Максимални пораст фосфорилације десио се након 5 минута, након чега нивои фосфорилације полако опадају до скоро базалних нивоа. Штавише, повећање фосфорилације ЕРК1/2 изазвано паракватом није зависило од концентрације (слика 2Б). Предтретман инхибитором тхеМЕК1, ПД(Паркинсонова болест)98059 (50 1М; Дудлеи ет ал., 1995) је у потпуности инхибирао паракватом индуковано повећање фосфорилације ЕРК1/2 (слика 3).

Паракватом изазвана активација ПКБ у Е18 ћелијама

Активација ПКБ-а у Е18 ћелијама је откривена Вестерн блотингом коришћењем фосфо-специфичног (Сер473) антитела. Стимулација Е18 ћелија са 25 1М параквата је произвела значајно повећање фосфорилације ПКБ (слика 4А). Ово повећање се дешава након 20 минута, упоредиво са оним код фосфорилације ЕРК1/2 након што су нивои фосфорилације полако опали на близу базалних нивоа (слика 4А). Штавише, паракватом посредована повећања фосфорилације ПКБ су зависила од концентрације са максимумом од 25 лМ параквата (слика 4А). Пошто је ПИ{14}}К неопходан за активацију ПКБ, улога ПИ-3К у активацији ПКБ изазваној паракватом у Е18 ћелијама је стога истражена коришћењем ПИ-3К инхибитора вортманина и ЛИ 294002.

Повећања фосфорилације ПКБ посредована паракватом била су потпуно блокирана након претходног третмана (30 мин) Е18 ћелија са 100 нМ вортманина и 30 лМ ЛИ 294002 (слика 5). Ова запажања показују да пут зависан од ПИ-3К посредује повећање фосфорилације ПКБ у Е18 ћелијама изазвано паракватом.

Активација ЈНК1/2 у Е18 ћелијама изазвана паракватом

Претходне студије су показале да паракват активира ЈНК1/2 у неуронима (Цхун ет ал., 2001; Пенг ет ал., 2004) и не-неуронским ћелијама (Беннетт ет ал., 2001; Цхенг ет ал., 2003). Међутим, коришћене концентрације су у великој мери веће од оних које се користе у овом раду. Поред тога, времена изабрана за визуелизацију ЈНК1/2 активације су такође дужа. Активација ЈНК1/2 у Е18 ћелијама је откривена Вестерн блотингом коришћењем фосфоспецифичног ЈНК (Тхр183/Тир185) антитела. Стимулација Е18 ћелија са 25 1М параквата је произвела значајно и рано повећање фосфорилације ЈНК (46/54 кДа) (слика 6А). Ова повећања су била максимална након 5 минута након чега су се нивои фосфорилације смањили према базалним нивоима (слика 6А). Међутим, паракватпосредована повећања фосфорилације ЈНК1/2 нису зависила од концентрације (слика 6Б). Паракватом посредована повећања фосфорилације ЈНК1/2 била су осетљива на инхибитор ЈНК1/2 СП 600125 (10 1М; Слика 7; Беннетт ет ал., 2001). Коначно, паракват (25 лМ) није стимулисао мерљива повећања фосфорилације п38 МАПК у Е18 ћелијама у истим експериментима током периода (подаци нису приказани). Ови експерименти су изведени коришћењем фосфоспецифичног п38 МАПК(Тхр180/Тир182) антитела.

Мерење виталности ћелија након третмана Е18 ћелија инхибиторима параквата и киназе

Пошто смо показали да паракват у свим случајевима производи рану активацију ЕРК1/2, ПКБ и ЈНК1/2 у Е18 ћелијама, накнадно смо утврдили улогу брзе активације ових киназних путева у ћелијској смрти изазваној ниским концентрацијама параквата користећи фармаколошке специфичне инхибитори. Као што је приказано на слици 1, излагање Е18 ћелија 25 лМ параквата изазвало је значајно смањење виталности ћелија (око 50 процената). Да би се истражила улога ЕРК1/2, ПКБ и ЈНК1/2 у ћелијској смрти изазваној паракватом, ћелије Е18 су претходно инкубиране 30 минута са следећим инхибиторима киназе: ПД(Паркинсонова болест)98059 (50 лМ; МЕК1/2 инхибитор), ЛИ 294002 (30 лМ; ПИ-3К инхибитор), вортманин (100 нМ; ПИ-3К инхибитор) и СП 600125 (10 лМ; инхибитор ЈНК1/2). Као што је приказано на слици 8 (и то је сажето у табели 1), вортманин, ЛИ 294002 и ПД 98059 нису имали значајан утицај на губитак виталности ћелије изазван 25 1М параквата.

ДИСКУСИЈА

Недавно су различите студије повећале интересовање за могућност да еколошки неуротоксини као што су пестициди могу бити повезани са развојем негенетског ПД(Паркинсонова болест)(Цори Слецхта ет ал., 2005; Ландриган ет ал., 2005; Норрис ет ал., 2004; Ритз и Иу, 2000; Схерер ет ал., 2001). ПК је један од могућих хербицида који су укључени у ПД, због сличне хемијске структуре са МППþ и јаке корелације између инциденције болести и количине ПКусед (Ланска, 1997; Лиоу ет ал., 1997; Ритз и Иу, 2000). Међутим, механизам неуронске токсичности која се јавља при недовољном излагању ниским нивоима параквата није утврђен. У сваком случају, претходни радови нису заинтересовани за рани процес који је сведочио након излагања параквату. Главни налаз ове студије је да смо показали да ћелије Е18 неуробласта изложене ниским концентрацијама паракватрапидно повећавају активирану фосфорилацију генерално антиапоптотичких сигналних путева ПИ-3К/ПКБ и МЕК ЕРК, као и генерално проапоптотичког ЈНК1/ 2 МАПК. Насупрот томе, паракват није стимулисао мерљива повећања фосфорилације п38 МАПК у зависности од времена или концентрације. Као што је горе наведено, користили смо ниску концентрацију параквата. Релевантност чињенице да ли паракват може ући у мозак или не зато што је наелектрисан молекул, расправља се. Међутим, недавни налази (Схимизу ет ал., 2001) открили су да паракват може да користи неутралну аминокиселинску пумпу да уђе у мозак. Налази представљени у овом раду указују на то да је потребна само ниска концентрација параквата у ћелији да би се брзо стимулисало неколико сигналних путева укључујући НК, који су укључени у процесе ћелијске смрти. Ове ране активације због ниске концентрације параквата су по први пут предложене у овом раду.

Мало пажње је посвећено проучавању промена у нивоима фосфорилације ПКБ или ЕРК1/2 изазваних паракватом (Цхенг ет ал., 2003; Пенг ет ал., 2004). У сваком случају, претходни извештаји (Пенг ет ал., 2004) користе релативно високе концентрације параквата (400 лМ), мерење степена фосфорилације ЕРК након 12-18 х изложености. У тим временима, нису приметили промене у нивоима п-ЕРК. У нашем раду смо открили рану (5–10 мин) и важну активацију ЕРК1/2 (Сл. 2А). Ова активација полако опада до базалних нивоа. У нашим условима, нивои фосфорилисаног ЕРК1/2 (после 12-18х) су исти као у контроли, што указује да овај пут није активан у овим временима (подаци нису приказани) како су описали Пенг ет ал. (2004). Ова активација не зависи од концентрације, што указује на резултат да се робусна стимулација ЕРК добија и одржава са веома ниским концентрацијама параквата. Промене у нивоима фосфорилисаног ПКБ још увек нису описане након излагања параквату. На слици 4 показујемо да резултати зависе од времена и концентрације, показујући максимални ефекат након 20-мин експозиције са 25 лМ параквата. То јест, рана повећања фосфорилације ПКБ-а посредована паракватом су упоредива са онима уоченим за ЕРК1/2. Ови подаци откривају рано повећање активирања фосфорилације и ПКБ и ЕРК путева преживљавања. Нема података о раној активацији ПКБ или ЕРК у ћелијској смрти изазваној паракватом. Међутим, претходне студије (Халворсен ет ал., 2002) описују слично рано повећање у оба пута у ћелијама неуробластома СХ-СИ5И изложеним МППþ. У овом случају, нивои фосфорилације не опадају према базалном нивоу. Ови подаци су посебно занимљиви због раније повезане сличне структуре између параквата и МППþ, што указује на другачији почетак ћелијске машинерије укључене у ефекат оба молекула.

Више пажње је посвећено улози ЈНК1/2пута у посредовању сигнала који доприносе смрти ћелија изазване паракватом. У овој студији смо показали да ниске концентрације (25 лМ) параквата изазивају значајно повећање фосфорилисаног ЈНК1/2 (слика 6). Као што се дешава у ПКБор ЕРК1/2, ова активација зависи од времена са веома раним почетком (5 мин) и са спорим повратком на базалне нивое. Претходни радови (Цхенг ет ал., 2003; Цхун ет ал., 2001; Пенг ет ал., 2004) показују касне (12–18 х) активације ЈНК1/2 пута произведене у сваком случају релативно високим концентрацијама параквата (од 400 лМ [Пенг ет ал., 2004] до 800 лМ [Цхунет ал., 2001]). У нашим условима, степен фосфорилације ЈНК1/2 у назначеним временима је упоредив са контролом. Све у свему, ови резултати по први пут указују на то да излагање ћелија веома ниској концентрацији параквата доводи до ране активације ПКБ, ЕРК1/2 и ЈНК1/2 путева.

Након што смо установили да паракват покреће рану активацију ПКБ, ЕРК1/2 и ЈНК1/2 у ћелијама Е18, затим смо истражили улогу ових путева протеин киназе у ћелијској смрти изазваној паракватом користећи неколико фармаколошких инхибитора. Вијабилност ћелије је праћена мерењем трансформације у МТТ у формазанску боју која апсорбује светлост на 570 нм. МТТ тест је коришћен за прецизно мерење неуронске повреде након разних увреда укључујући МППþ или паракват (Гонзалез Поло ет ал., 2003, 2004; Сцхмуцк ет ал., 2002; Схенг ет ал., 2002; Сторцх ет ал., 2004. ), и то је најчешће коришћена метода за одређивање смрти ћелије. Као што је приказано на слици 8, ​​предтретман са селективним ЈНК1/2 инхибитором СП 600125 значајно је смањио ћелијску смрт изазвану паракватом. Ова концентрација СП 600125 потпуно је блокирала паракватом индуковану активацију ЈНК1/2 (слика 7). Ови подаци сугеришу да инхибиција ране активације ЈНК1/2 пута штити ћелије од ћелијске смрти изазване паракватом. Ови подаци су у сагласности са претходним студијама (Цхун ет ал., 2001; Пенг ет ал., 2004), које су показале да је ЈНК1/2 укључен у смрт неуронских ћелија изазвану паракватом. Међутим, ове студије користе између 15 и 30 пута више концентрације параквата од оне употребљене у овој студији. Такође смо показали да ниске концентрације параквата могу произвести не само активацију већ и рану активацију овог пута. Заштита примећена код СП600125 такође указује да је пут ЈНК1/2 укључен у ћелијску смрт изазвану паракватом. Поред тога, инхибиција ЈНК1/2 је дизајнирана као потенцијална стратегија у лечењу ПД(Паркинсонова болест)на неколико модела и ин виво и ин витро (Ванг ет ал., 2004).

неуропротективни ефекат цистанче

Претходне студије су показале да су и ПКБ и ЕРКпутеви укључени у преживљавање неурона (Гуитон ет ал., 1996; Схин ет ал., 2001). У овој студији смо показали да ниске концентрације параквата производе и рано стимулишу и ПКБ и ЕРК путеве. Ова запажања сугеришу да активација ПКБ и ЕРК изазвана паракватом може бити укључена у заштиту ћелија од ћелијске смрти изазване паракватом. Да бисмо истражили ову могућност, користили смо структурно неповезане ПИ-3К инхибиторе вортманин и ЛИ 294002 и ЕРК1/2 инхибитор ПД(Паркинсонова болест)98059. Занимљиво је да и ПКБ и ЕРК инхибиција нису промениле виталност ћелија у присуству параквата, што сугерише да, у нашим условима, повећана ПКБ и ЕРКактивација није од суштинског значаја за преживљавање у ћелијској смрти изазваној паракватом у Е18 ћелијама.

Добро је познато да је механизам неуротоксичности параквата, између осталих фактора, посредован оксидативним стресом (Гонзалез-Поло ет ал., 2004; Моллаце ет ал., 2003). У том смислу, недавно је описан веома брз цитосолни оксидативни стрес у раним апоптотичким догађајима који су имплицирани у ћелијску смрт изазвану паракватом (Гонзалез-Поло ет ал., 2004). Како оксидативни стрес активира чланове породице МАПК (као што су ЕРК1/2 и ЈНК1/2) и ПКБ (Камата и Хирата, 1999), ова рана активација ЕРК1/2, ЈНК1/2 и ПКБ се може приписати брзој оксидацији изазвана стресом после излагања параквату.

Укратко, наши резултати по први пут показују да ниске концентрације параквата стимулишу веома рано и снажно повећање фосфорилације ПКБ, ЕРК1/2 и ЈНК1/2 у ћелијама Е18. Поред тога, показали смо да инхибиција ране активације ЈНК1/2 пута штити ћелије Е18 од ћелијске смрти изазване паракватом. Овај резултат указује на постојање неких раних догађаја (као што је брза активација ЈНК1/2) који играју суштинску улогу у ћелијској смрти изазваној ниским концентрацијама параквата. Овај резултат такође отвара нову и узбудљиву линију у проучавању токсичности параквата и његове могуће импликације у развоју ПД(Паркинсонова болест).

БЕЛЕШКА: Цистанцхеје традиционална кинеска биљка која делује на неуроне и мождане ћелије. цистанцхе је такође познат као пустињски гинсенг, то је потенцијални третман за неуро болести као нпрПаркинсонова болестна основу савремених фармаколошких студија