Меланин-деколоризирајућа активност антиоксидативних ензима, глутатион пероксидазе, тиол пероксидазе и каталазе

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Гиеонгцхан Јеон¹· Цхинхан Ким²· Ук Мин Цхо²· Ее Таек Хванг³· Хиунг Сео Хванг⁴· Јихо Мин¹

Апстрактан

Меланин је најважнији фактор за одређивање боје коже. Подузимају се многи истраживачки напори како би се разградила већ произведена једињења меланина у кожи за лепоту. Ово истраживање је истраживало ефекте на смањење боје меланина три антиоксидативна ензима, глутатион пероксидазе (ГПКС), тиол пероксидазе (ТПКС) и каталазе, у лизозомалној фракцији. Раствор меланина је третиран ензимима и водоник пероксидом, а затим реаговао 48 х. ГПКС и ТПКС су обезбојили меланин, а између њих, ГПКС је био ефикаснији, али Каталаза није била ефикасна. ГПКС је такође инхибирао производњу меланина у ћелијама меланома Б16Ф10. ГПКС, који је присутан у скоро свим микроорганизмима, игра важну улогу у ћелијском одбрамбеном механизму реактивних врста кисеоника. Поред тога, није био цитотоксичан, али је био значајно ефикасан у деколоризацији боје меланина. Стога је у биолошком и микробиолошком пољу могућност његове употребе у козметици за избељивање коже велика.

Кључне речи Меланин · Глутатион пероксидаза (ГПКС) · Тиол пероксидаза (ТПКС) · Каталаза · Б16Ф10 · Лизозом

Цистанцхе је састојак за избељивање коже.

Увод

Чисто лице је један од основних елемената лепоте за савремене људе, посебно Азијати који су одушевљени белом кожом. Једињење меланина је најважнији фактор у одређивању боје коже. Разликује се од еумеланина који има црну или браон боју и феомеланина, који резултира ружичастом до црвеном нијансом [1]. Једињење меланина се синтетише оксидацијом тирозина у ћелијама меланоцита, које се налазе у базалном слоју епидермиса; а главна улога овог пигмента у кожи је да штити дермис блокирањем штетног ултраљубичастог зрачења [2, 3]. Међутим, ако је превише једињења меланина присутно у кожи, то чини кожу тамном и нечистом, и може изазвати хиперпигментацију, попут мелазме [4].

Било је много студија везаних за козметику за негу коже која решавају ове проблеме, али већина тренутно развијене козметике за избељивање коже има функцију да инхибира синтезу меланина кроз неколико механизама, као што је блокирање оксидације тирозина или УВ зрака који могу да подстичу синтеза меланина [5]. Овим производима је потребно много времена да буду ефикасни и нису ефикасни за специфичне симптоме, као што је хиперпигментација [6]. Тренутно, типичан метод уклањања меланина који је већ направљен је ласерски третман [7]. Ако се развију материјали који могу да реше ове проблеме без таквих процедура, они ће имати велику корист у биолошкој и козметичкој области.

У претходним истраживањима покушали смо да пронађемо начин да обезбојимо једињења меланина која су већ произведена. Било је истраживачких извештаја о корелацији лизозома и меланина. Врло је вероватно да диференцирани кератиноцити посебно деградирају екстринзичне меланозоме у складу са врстом основних функција аутофагије које контролишу количину ћелијских органела или уклањају дефектне органеле, као што је пероксизом [8]. Аутофагични пут, од цитоплазме до лизозома, игра значајну улогу у деградацији меланозома у хуманим епидермалкератиноцитима [9]. Ови подаци пружају доказ да лизозомски специфични ензими доприносе разградњи меланина. Раније смо открили активност ензима на редукцију боје меланина у лизозомској фракцији, комплексу који садржи хидролизате за разлагање отпадног материјала и ћелијских остатака у пероксизомима и лизозомима [10, 11]. Овај рад је проучавао ефекте три одабрана ензима, глутатион пероксидазе, тиол пероксидазе, каталазе, у лизозомалној фракцији на смањење боје меланина. Ове пероксидазе делују на одбрану од оштећења ћелија изазваних реактивним врстама кисеоника (РОС), и присутне су код свих еукариота [12].

Реактивне врсте кисеоника (РОС) се формирају као природни нуспроизвод нормалног метаболизма кисеоника у ћелијама и могу се повећати стресом околине. Високо генерисани РОС може оштетити ћелије. Штетни ефекти РОС на ћелију су следећи [12, 13]: оштећење ДНК или РНК, оксидације полинезасићених масних киселина у липидима, оксидације амино киселина у протеинима и оксидативна деактивација специфичних ензима оксидацијом кофактора. Ћелије неутралишу РОС помоћу антиоксидационог система како би се спречило такво оштећење ткива. У овом систему, супероксидањон произведен метаболизмом је веома разоран; иако се претвара у водоник пероксид помоћу супероксид дисмутазе (СОД), водоник пероксид је још увек реактиван. Водоник-пероксид се трансформише у Х2О помоћу каталазе и троши у производњи глутатион-дисулфида (ГССГ) из глутатиона катализом ГПКС-а. ТПКС ради слично као ГПКС [13].

Ова студија је истраживала ефекат деколоризације меланина три антиоксидативна ензима, ГПКС, ТПКС и Цаталасе. Као резултат тога, ГПКС и ТПКС су били ефикасни у смањењу боје меланина. Међу њима, ГПКС није имао цитотоксичност при оптималној концентрацији активности деколоризације меланина и ефикасно је инхибирао синтезу меланина. Стога, он пружа доказе да ГПКС игра важну улогу у механизму деколоризације меланина лизозомске фракције, не само антиоксидативне активности, и нуди потенцијал новог козметичког средства за избељивање као једног ензима.

Материјали и методе

Пероксидазе и анализа активности пероксидазе

Концентрација три пероксидазе (глутатион пероксидаза, тиол пероксидаза и каталаза) одређена је комплетом за испитивање (комплет за испитивање пероксидазе, Д2ПД-100, КуантиЦхромТМ) купљеним од Биоассаи Системс. Глутатион пероксидаза 2 (ГПКС2, НБП1-78,824, Новус) и тиол пероксидаза (ТПКС,НБП1-78,805, Новус) су купљене од Новуса, а Каталаза (9001-05-2, Сигма-Алдрицх) ) је купљен од Сигма-Алдрицх.

Овај комплет за анализу користи Х2О2 и боју донора електрона која формира ресоруфин током пероксидазе. Тест је изведен на собној температури (РТ), а интензитет боје је мерен на 570 нм. Пероксидазе су реаговале са бојом донора електрона са 0,6 процената водоник пероксида током 10 минута на собној температури. После реакције, додат је реагенс за заустављање, а апсорбанца узорка је мерена спектрофотометријом на микроплочи. Активност је израчуната на следећи начин:

Активност пероксидазе=РСАМПЛЕ −РБЛАНК × [Ресоруфин](𝜇М) × Реакција Вол(𝜇Л)РРЕСОРУФИН −РХ2 О т(мин) Волумен узорка (𝜇Л)

(У/Л). Једна јединица (У) ензима ће катализовати формирање 1 μмол ресоруфина у минути у условима анализе. Овде РСАМПЛЕ, РБЛАНК, РРЕСОРУФИН и РХ2О представљају апсорпцију узорка, празног узорка, ресоруфина и воде, респективно; а н је фактор разблажења узорка. [Ресоруфин] за овај тест је 50 μМ. Запремина реакције је 100 μЛ, а запремина узорка у овој студији је 10 μЛ.

Деколоризација меланина помоћу глутатион пероксидазе (ГПКС), тиол пероксидазе (ТПКС) и каталазе

Раствор меланина садржи {{0}}.1 мМ ПБС (фосфатним пуфером физиолошки раствор, пХ: 7,0) и меланин прах (Синтхетиц, Сигма) који је припремљен оксидацијом тирозина водоник пероксидом. Садржај меланина је мерен апсорбанцијом на 450 нм. Да би се одредила концентрација меланина, припремљена је стандардна крива од аутентичног стандарда синтетичког меланина (Р2=0.999, подаци нису приказани).

Да би се потврдила деколоризација меланина, 100 ппм раствора меланина који садржи (50 до 1000) μУ/Л пероксидаза (ГПКС,ТПКС, каталаза) са 1 мМ водоник пероксида реаговао је на собној температури и мерен је сваког дана. Вредност деколоризације меланина одређена је одузимањем концентрације меланина након реакције од почетне вредности.

Цистанцхе инхибира синтезу меланина.

Ћелијска култура

Ћелије меланома мишева Б16Ф10 (КЦЛБ 80008) купљене су од Кореан Целл Лине Банк (КЦЛБ, Сеул, Кореја). Ћелије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) који садржи 4500 мг/Л глукозе, 4 мМ л-глутамина, 1 мМ натријум пирувата, коме је додат 10 процената феталног говеђег серума (ФБС), 20 мМ 1 проценат ХЕПЕС-а, а ћелије су инкубиране у влажном стању које садржи 5 процената ЦО2 на 37 степени. Медијум је замењен свака 2 дана (д), а ћелије су сакупљене коришћењем раствора трипсин/ЕДТА.

Тест виталности ћелије (МТТ тест)

Токсичан ефекат глутатион пероксидазе на ћелију мела-нома Б16Ф10 потврђен је МТТ тестом, општим методом који се користи за одређивање утицаја узорка на виталност адхерентне ћелије. Овај тест користи 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолијум бромид (МТТ) који се митохондријским путем може редуковати у формазан ензим у живим ћелијама. Ћелије величине 3 × 103 су засејане по бунарчићу у 96-плочи са бунарима и инкубиране 24 х. Затим је узорак додат у сваки бунар и инкубиран 72 х. Након тога, медијум је замењен оним који садржи 0,5 мг/мЛ МТТ, и инкубиран 2 х. Затим је уклоњен МТТ реагенс за боју, а генерисани формазан је растворен у ДМСО током 30 мин. Коначно, концентрације формазана су измерене на 570 нм коришћењем спектрофотометрије на микроплочи. Вијабилност ћелије је израчуната на следећи начин: виталност ћелије( проценат )=(узорак − празан)/(контрола − празан)*100.

цистанцхе на хиндском

Анализа садржаја меланина

3 × 105 Б16Ф10 ћелија је засејано по бунарчићу у 6-плочу са бунарима и инкубирано 24 х да би се причврстило. Медијум сваког бунарчића је замењен са једним који је садржао различите концентрације ензима и 10 нМ -МСХ, а затим инкубиран 72 х. Након тога, сви бунари су испрани ДПБС пуфером и сакупљени коришћењем 0,5 процентног раствора трипсина/ЕДТА. Пелете ћелија добијене центрифугирањем су лизиране са 200 μЛ 1 Н НаОХ који садржи 10 процената ДМСО током 1 х на 80 степени. Коначно, садржај лизираног меланина је мерен апсорбанцијом на 450 нм. Ефикасност ензима инхибиције производње меланина одређена је поређењем са позитивном контролом употребом 100 мг/мЛ арбутина.

Резултати

Пероксидазна активност глутатион пероксидазе (ГПКС), тиол пероксидазе (ТПКС) и каталазе

Ова студија је проширено истраживање примене третмана лизозомском фракцијом за деколоризацију једињења меланина ин витро и ин виво. У претходној студији смо открили да лизозомална фракција изолована из ћелија Хела, С. церевисиае, кокошијег јајета утиче на смањење боје меланина иефикасност деколоризације меланина била је повезана са активношћу пероксидазе лизозомске фракције микрозомалне фракције која није везана за мембрану, укључујући лизозоме и пероксизоме. Да би се потврдио ефекат пероксидазе на смањење боје меланина, одабране су три пероксидазе, глутатион пероксидаза (ГПКС), тиол пероксидаза (ТПКС) и каталаза. Ови ензими играју важну улогу у смањењу оксидативног стреса изазваног реактивним врстама кисеоника у ћелијама [14].

Активност ових ензима је одређена помоћу комплета за испитивање (Перокидасе ассаи кит, Д2ПД-100, КуантиЦхром™). Ова метода се заснивала на оксидацији боје донора електрона која формира ружичасту боју током реакције пероксидазе [15]. Активност пероксидазе је изражена коришћењем следећих јединица: 1 јединица=1 У=формирање 1 µмол ресоруфина у минути под условима теста. Табела 1 сумира активност и концентрацију три пероксидазе, ГПКС, ТПКС и каталазе.

Активност деколоризације меланина глутатион пероксидазе (ГПКС), тиол пероксидазе (ТПКС) и каталазе

Да би се потврдио ефекат деколоризације меланина од пероксидаза, 100 ппм раствора меланина је третиран са 1 мМ водоник пероксида и (50 до 1000) µУ/Л концентрацијом сваке пероксидазе. Узорци су реаговани 2 дана на собној температури, а затим упоређивани са почетном концентрацијом. Слика 1 показује смањење меланина након 48 х. Слика 1 показује доказе да ТПКС и ГПКС имају активност деколоризације меланина. Каталаза није имала утицаја на смањење боје меланина (слика 1а). ТПКС је био ефикасан у деколоризацији једињења меланина, а ефикасност је била најбоља када се третира у концентрацији од 1 µУ/мЛ (слика 1б). ГПКС је такође имао активност смањења боје меланина, која је била најбоља при концентрацији од 0,2 µУ/мЛ, а постепено се смањивала при вишим концентрацијама (слика 1ц). Ова вредност представља 175 процената побољшану редукцију боје меланина, у поређењу са контролом третираном само водоник-пероксидом. ГПКС је био ефикаснији у погледу концентрације и активности пероксидазе у поређењу са ТПКС. Третман 0,2 µУ/мЛ ГПКС и 1 мМ водоник пероксида дораствор меланина је обезбојио 13 процената од 100 ппм меланина за 4 дана (Сл.2). Међутим, ни ГПКС ни ТПКС нису показали никакав ефекат смањења боје у одсуству водоник-пероксида (подаци нису приказани).

Табела 1 Специфични подаци ензима, глутатион пероксидазе 2, тиол пероксидазе и каталазе

Утицај глутатион пероксидазе (ГПКС) и Х2О2 на виталност ћелија Б16Ф10

Ефекат ГПКС-а на виталност Б16Ф10 меланомацелија је потврђен МТТ тестом, пре теста инхибиције синтезе меланина. Да би се пронашла одговарајућа концентрација водоник-пероксида за лечење, цитотоксичност је процењена третманом водоник-пероксидом током 72 х у различитим концентрацијама. Под концентрацијом од 0.1 мМ, Х2О2 није имао ћелијску токсичност за ћелије током 72 х, док је при концентрацији изнад 1 мМ примећена велика токсичност. (слика 3а). Утицај ГПКС-а на преживљавање ћелија је затим процењен у присуству 0.1 мМ водоник пероксида, који није био цитотоксичан. ГПКС није имао цитотоксичност за Б16Ф10 ћелије испод концентрације од 0,5 μУ/мЛ, што је било ефикасно у студијама деколоризације меланина (слика 3б).

Фиг. 1Релативно смањење боје меланина у поређењу са третманом само водоник пероксидом.

Утицај глутатион пероксидазе (ГПКС) и Х2О2 на синтезу меланина у ћелијама меланома Б16Ф10

Истраживали смо ефекат ГПКС-а, који је био најефикаснији у деколоризацији меланина, на синтезу меланина у мел-аноцитима. Слика 4 приказује садржај меланина у Б16Ф10ћелијама меланома третираним сваким узорком током 72 х. Третман са 0.05 μУ/мЛ ГПКС-а и 0,1 мМ Х2О2 индуковао је највећу инхибицију меланогенезе за 43 процента у поређењу са контролом (само третман са -МСХ). Ово је било 153 процента више од позитивне контроле (третман арбутином и -МСХ), и 22 процента више од водоник пероксида без ензима, док третман ГПКС није показао драматично смањење меланина у одсуству водоник пероксида такође подржава овај став (подаци нису приказани). Као резултат тога, ГПКС је инхибирао производњу једињења меланина, али је на синтезу меланина у ћелијама више утицао водоник пероксид него ГПКС.

Дискусија

У овој студији, наши истраживачи су пронашли оптималну концентрацију и ефекат ГПКС, ТПКС и Цаталасе, антиоксидантензима који смањују оксидативни стрес у ћелијама, на деколоризацију једињења меланина. Као резултат екстрацелуларних експеримената коришћењем синтетизованих једињења меланина, ГПКС и ТПКС имају ефекат обезбојавања меланина, али Каталасед не. Постоје извештаји да ензими који разграђују лигнин у неким гљивама, попут лаказе, лигнин пероксидазе, могу разградити меланин у присуству водоник пероксида [16–18]. Кроз ово истраживање је потврђено да антиоксиданти, који се налазе у свим еукариотима и не ензими који разграђују лигнин, имају активност обезбојавања меланина. Иако ГПКС и ТПКС такође могу да смање боју меланина у присуству водоник пероксида, ови ензими имају могућност да делују као главна компонента механизма деколоризације меланина лизозомске фракције.

ГПКС, који је био најефикаснији у смањењу боје меланина ин витро, третиран је ћелијама меланома Б16Ф10 да би се утврдио његов ефекат на синтезу меланина. У Б16Ф10 меланомаћелијама, ГПКС није био цитотоксичан у концентрацијама које су биле ефикасне у деколоризацији једињења меланина, а концентрација водоник-пероксида третираног заједно била је 0,1 мМ, без токсичности. Третман водоник пероксидом је у великој мери инхибирао синтезу меланина, а при раду са ГПКС ефикасност је била боља, док није било концентрационе зависности лека. Пошто се ензими брзо троше водоник-пероксид, може се тумачити да што је већа концентрација ензима који се третира, то је мања инхибиција синтезе меланина од стране водоникпероксида. Чињеница да третман ГПКС-а није показао драматично смањење меланина у одсуству водоник пероксида такође подржава овај став (подаци нису приказани). Као резултат тога, ГПКС је инхибирао производњу једињења меланина, али је на синтезу меланина у ћелијама више утицао водоник пероксид него ГПКС. Ови резултати сугеришу да антиоксидативни ензими индукују деградацију у аутофагијским механизмима који варе меланозоме.

цистанцхе таблете

За више информација кликните овде.

Закључак

Наша студија показује да глутатион пероксидаза (ГПКС) и тиол пероксидаза (ТПКС) доприносе деколоризацији меланина, а ГПКС ефикасно инхибира синтезу меланина. Резултати подржавају хипотезу да антиоксидативни ензими индукују деградацију у аутофагијским механизмима који варе меланозоме. Да би се донео дефинитиван закључак, може бити потребно проучавање механизма варења меланозома у ћелијама коже, кератиноцитима и меланоцитима.