Фото-заштитна и антимеланогена својства различитих екстраката кадсура Цоццинеа

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Соларно ултраљубичасто (УВ) зрачење, које карактеришу УВА (320–400 нм), УВБ (280–320 нм) и УВЦ (100–280 нм), је најкритичнији фактор животне средине који узрокује рак коже и фотостарење као резултат цитотоксичности, генотоксичности и фототоксичност. Конкретно, УВА и УВБ зрачење чине преко 95 процената и 3 процента дневног УВ зрачења [8]. УВА и УВБ зрачење може индуковати реактивне врсте кисеоника (РОС) индиректно или директно продирањем у епидермалне и/или дермалне слојеве коже, што доводи до оксидативног оштећења и смрти ћелија. Последњих деценија УВ зрачење је постало озбиљан проблем за здравље коже и још увек се опасно шири широм света [9–11]. УВ зрачење је директан и конзистентан стимуланс кератиноцита, који чине приближно 95 процената ћелијске масе коже епидерма. Кератиноцити делују као прва баријера против микробних, хемијских и физичких опасности и помажу у одбрани од УВА и УВБ зрачења. Када су кератиноцити изложени УВА и УВБ зрачењу, стварају се интрацелуларни РОС, што покреће апоптозу [12–14].

Меланоцити су одговорни за производњу и количину пигмената меланина, који су важни играчи у биолошкој одбрани епидермиса коже; њихова дисрегулација може изазвати поремећаје хиперпигментације или хипопигментације [15,16]. Меланоцити су распоређени у базалном слоју епидермиса коже, на који такође утиче излагање сунчевој светлости, реактивне врсте кисеоника (РОС) и хормони који стимулишу меланоците (-МСХ) [17,18]. Тирозиназа, члан породице протеина бакра типа -3, је еволуцијски очуван металопротеин који игра кључну улогу у меланогенези и активностима монофенол монооксигеназе, катехолазе и дифенола. Смањење нивоа тирозиназе, протеина повезаног са тирозиназом-1 (ТРП-1) и протеина повезаног са тирозиназом-2 (ТРП-2) има различите каталитичке ефекте. ТРП-1 је 5,6-дихидроксииндол-2-оксидаза карбоксилне киселине, а ТРП-2 је ДОПАхром таутомераза [19,20]. Поред тога, фактор транскрипције повезан са миофталмозом (МИТФ) и цАМП-респонсиве елемент-биндинг протеин (ЦРЕБ) су фактори транскрипције који првенствено регулишу меланогенезу и кодирају информације о начину и интензитету стимулације [17,21]. Више студија је показало да МИТФ и ЦРЕБ путеви регулишу меланогенезу. МИТФ је кључни фактор у транскрипцији ензима повезаних са меланогенезом и централни регулатор меланогенезе. -МСХ доводи до експресије МИТФ-а преко сигналног механизма који укључује везујући протеин повезан са цАМП (ЦРЕБ). Затим, МИТФ улази у језгро са секвенцом М-кутије (АГТЦАТГТГЦТ) да би промовисао транскрипцију специфичних меланогених гена и ензима. Такође је познато да фосфориловани ЦРЕБ стимулише -МСХ, који се везује за ЦРЕ консензус елемент у Митф промотору да би регулисао Митф транскрипцију [21–24].

У овој студији, екстракти корена КЦ (КЦР), стабљике (КЦС), листа (КЦЛ) и плода (КЦФ) су свеобухватно упоређени и извршене су вишеструке процене њихових фотопротективних и антимеланогених својстава.

2. Материјал и методе

2.1. Припрема КЦ екстракта

Трогодишња биљка КЦ 15 узгајана је у пластичној посуди од 9 литара у кампусу Мирианг Националног универзитета Пусан. КЦ је идентификовао професор Јанг Вхан Чои, аутор ове студије. Ови узорци су депоновани као узорци ваучера (приступни број КЦ-ПДРЛ-1) у хербаријуму Одељења за хортикултурну бионауку, Факултета природних ресурса и природних наука, Пусан Натионал Университи. Биљке су заливене у довољној мери коришћењем комплетног хранљивог раствора са нивоом проводљивости од 1.0 мС·цм−1 и који садржи следеће елементе (у ме·Л−1): НО3-Н, 16; НХ4-Н, 1,34; П, 4; К, 8; Ца, 8; и С, 4. КЦ хаљина у луци је убрана у децембру 2020. класификацијом корена, стабљика, листова и плодова (Слика 1А). Сакупљени узорци су одмах лиофилизовани у сушачи са замрзавањем и чувани у винил кесама на 20 ◦Ц до анализе. Осушени корени, стабљике, листови и плодови КЦ (20 г) су млевени у фини прах и екстраховани на собној температури етил алкохолом. Укратко, филтрација и упаравање ЕтОХ екстракта КЦ изведени су под сниженим притиском на 45 ◦Ц након чега је уследила лиофилизација. На крају, чврсти екстракт (50 мг/мЛ) је растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО) за даље експерименте.

цистанцхехерба епимедиум сагиттатумекстракт

2.2. Укупан садржај полифенола и флавоноида у екстрактима КЦ

Као што је претходно описано [25], укупан садржај полифенола и флавоноида у екстрактима корена, стабљике, листа и плода КЦ мерен је колориметријским методама Фолин–Циоцалтеу (укупни полифенол) и алуминијум хлорида (флавоноид). Апсорпција је мерена на 700 нм (укупни полифенол) коришћењем Ултроспец 6300 Про (ГЕ Хеалтхцаре Лифе Сциенцес, Бакингемшир, УК) и на 510 нм (флавоноид) коришћењем ВИЦТОР Мултилабел Плате Реадер (Перкин-Елмер, УСА) Валтхам, МА .

Стандардне криве су конструисане коришћењем галне киселине (укупни полифенол) и кверцетина (флавоноида) као стандарда, а резултати су изражени као еквиваленти галне киселине по граму (ГАЕ/г) КЦ екстракта корена, стабљике, листа и воћа и еквивалента кверцетина по граму (КЕ/г) екстракта корена КЦ, стабљике, листа и воћа.

2.3. ДППХ и АБТС тест

Активности уклањања радикала ДППХ и АБТС екстракта корена, стабљике, листа и плода КЦ ({{0}}.5 мг/мЛ) мерене су према претходно описаној методи [25] са малим модификацијама. Екстракти корена, стабљике, листа и плода КЦ (0.5 мг/мЛ) помешани су са раствором ДППХ (60 µМ) у микроплочама. Након што су узорци снажно протресени, држани су у мраку на 25 ◦Ц током 0.5 х. Основни раствори 7 мМ АБТС и 2,6 калијум персулфата су припремљени у дестилованој води на собној температури у мраку током 18 сати. Екстракти корена, стабљике, листа и плода КЦ (0,5 мг/мЛ) помешани су са радним раствором и остављени да одстоје 0,5 х на собној температури у мраку. Апсорбанција смеша узорака је праћена на 510 нм (ДППХ) или 734 нм (АБТС).

2.4. Ћелијска култура

Адхерирани кератиноцити (ХаЦаТ) и адхерирани меланоцити (Б16Ф10) су инокулисани у раствор културе ДМЕМ (Инвитроген Цорпоратион, Царлсбад, Калифорнија, САД) који садржи 10 процената ФБС (Инвитроген Цорпоратион, Царлсбад, Калифорнија, САД) и 1 проценат пеницилина (Инвитроген пенициллин/Ин Цорпоратион, Царлсбад, ЦА, УСА) и култивисан на 37 ◦Ц са 5 процената ЦО2. Адхерирани раст ћелија ХаЦаТ и Б16Ф10 је примећен редовно, а медијум је мењан свака два до три дана. За наредне експерименте коришћене су ћелије из фазе логаритамског раста.

2.5. УВА и УВБ зрачење

Кератиноцити су били изложени УВА или УВБ зрачењу (Био-Линк БЛКС-365, Виллбер-Лоурмат, Еберхардзелл, Немачка) са 5 8 В цевима које емитују већину своје енергије на врхунцу емисије на било 365 нм ( УВА) или 312 нм (УВБ). Дозе УВА зрачења биле су 20 Ј/цм2, а дозе УВБ зрачења су биле 50 мЈ/цм2.

2.6. Мерење виталности ћелије и цитотоксичности кроз ЦЦК-8 и ЛДХ анализу

За анализу виталности ћелија, ХаЦаТ кератиноцитима је додат раствор Целл Цоунтинг Кит-8 (ЦЦК-8) из комплета за анализу ЦЦК-8 (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) и суспензије ћелија меланома Б16Ф10 према упутствима произвођача и инкубиране на 37 ◦Ц током 4 х. Укратко, 2 104 ћелије су засејане у сваки бунар плоче 24- и инкубиране са 5 процената ЦО на 37 ◦Ц током 24 х. Укратко, 2 104 ћелије су засејане у сваки бунар плоче 24- и инкубиране са 5 процената ЦО на 37 ◦Ц током 24 х. После 24 х инкубације, ЦЦК-8 реагенс је додат у сваки бунар, а ћелије су даље инкубиране 4 х. Комплет за детекцију цитотоксичности (Роцхе Апплиед Сциенце, Швајцарска) је коришћен за одређивање ослобађања екстрацелуларне лактат дехидрогеназе (ЛДХ) у медијуму културе кератиноцита ХаЦаТ. Апсорбанца је анализирана на 450 нм (ЦЦК-8) и 490 нм (ЛДХ) коришћењем ВИЦТОР Мултилабел Плате Реадер-а.

2.7. Евалуација интрацелуларне производње РОС у кератиноцитима

Интрацелуларни нивои РОС су анализирани коришћењем {{0}}(и-6)-хлорометил-2′,7′-дихлорид-хидрофлуоресцеин диацетат ацетил естра (ЦМ-Х2ДЦФДА; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Све процедуре су обављене према упутствима произвођача. Укратко, након третмана другим делимичним екстрактима КЦ (0.5 мг/мЛ), кератиноцити (ХаЦаТ) су испрани физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС) и инкубирани са ЦМ-Х2ДЦФДА (5 µМ) током 0,5 х у мрак. Након тога, генерисање интрацелуларног РОС је визуелизовано коришћењем Царл Зеисс флуоресцентног микроскопа; Интензитет флуоресценције је мерен на основу флуоресцентне боје (ЦМ-Х2ДЦФДА) коришћењем проточног цитометра (Фит НКСТ Флов Цито, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Пасадена, Калифорнија, САД).

2.8. Анализа апоптозе

Након излагања и третмана, ХаЦаТ кератиноцити су трипсинизовани и центрифугирани. Након тога, апоптоза добијених ћелија је процењена коришћењем флуоресцеин изотиоцијаната (ФИТЦ) Аннекин В/Деад ЦеллАпоптосис Кит (Инвитроген Лифе Тецхнологиес, ​​Царлс-бад, ЦА, УСА) према упутствима произвођача. Укратко, кератиноцити су два пута испрани ПБС-ом, а кератиноцити у пуферу за везивање анексина су добијени и помешани са ФИТЦ/Анексином В (компонента А) и радним раствором пропидијум јодида (ПИ). Након инкубације на собној температури током 15 минута у мраку, мерена је апоптоза кератиноцита и израчунат је проценат апоптотичких ћелија помоћу проточног цитометра (Фит НКСТ Флов Цито, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Пасадена, Калифорнија, САД). Сигнали су детектовани за ФЛ1 (ФИТЦ/Некин В) и ФЛ3 (ПИ) канале, а установљено је бојење маркера квадранта и тачкице обојених ћелија.

2.9. Анализа садржаја интрацелуларног меланина и активности тирозиназе

Интрацелуларни садржај меланина и тестови активности тирозиназе су мерени објашњавањем где се мало модификована процедура разликује [24]. Меланоцити су третирани коначном концентрацијом од 0.5 µМ -МСХ и 0.5 мг/мЛ КЦ другим делимичним екстрактима током 48 х. Пелете меланоцита су лизиране са 1 Н НаОХ у 10 проценту ДМСО на 80 ◦Ц током 1 х. Релативни садржај меланина је одређен мерењем апсорбанције на 475 нм коришћењем ВИЦТОРМултилабел Плате Реадер-а. Интрацелуларна активност тирозиназе је одређена мерењем брзине производње допахрома коришћењем Л-ДОПА. Меланоцити су испрани ледено хладним ПБС-ом и лизирани у ПБС-у који садржи 1 проценат (в/в) Тритон Кс-100. Супстрат тирозиназе Л-ДОПА (2 мг/мЛ) је припремљен у истом пуферу за фосфатну лизу. Сваки екстракт је стављен у плочу са 96-бунарићем, а ензимска анализа је започета додавањем раствора Л-ДОПА. После инкубације од 1 х, мерена је апсорпција на 475 нм коришћењем ВИЦТОР Мултилабел Плате Реадер-а за анализу производње допахрома. Вредност сваког мерења је изражена као проценат контроле. Арбутин (А, 0,5 мг/мЛ) је коришћен као позитивна контрола.

Цистанцхеехинакозидје инхибитор тирозиназе.

2.10. Квантитативни ПЦР у реалном времену

Укупна РНК је изолована из сваке групе меланоцита коришћењем РНеаси Мини Кит (КИАГЕН, Хилден, Немачка). Реверзна транскрипција је изведена коришћењем комплета за реверзну транскрипцију цДНК великог капацитета (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Мајами, ОК, САД), према упутствима произвођача, да би се добио први ланац цДНК. Низови су затим коришћени као шаблони за квантитативни ПЦР у реалном времену (кРТ-ПЦР) коришћењем Био-Рад Цхромо4ТМ инструмента и СИБР Греен кПЦР мастер мешавине (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Мајами, ОК, САД). ПЦР је изведен под претходном денатурацијом на 95 ◦Ц током 5 мин, денатурацијом на 95 ◦Ц током 15 с и жарењем на 55–58 ◦Ц током 30 с. ГАПДХ мРНА је коришћена као интерна референца за тирозиназу, ТРП-1 и ТРП-2 мРНА. Релативна вредност експресије циљног гена=2−∆∆ЦТ. Прајмер секвенце су биле следеће: тирозиназа-сенсе (5′-ггццагцтттцаггцагаггт-3′), тирозиназа-анти-сенсе (5′-тггтгцттцатгггц аааатц-3′), ТРП-1-сенсе (5 ′-агццццаацтцтгтцтттттц-3′), ТРП-1-анти-сенсе (5′-ггтцтцццтацатттццагц-3′), ТРП-2-сенсе (5′- тццагаагтт{37}} ′), ТРП-2-анти-сенсе (5′-ггааггагтгагццаагттатг-3′), ГАПДХ-сенс (5′-аггтггтцтццтцтгацттц-3′) и ГАПДХ-антисенсе (5′-аггтггтцтццтцтгацттц-3′) -3′).

2.11. Вестерн блоттинг

Меланоцити су сакупљени и лизирани помоћу реагенса за екстракцију протеина сисара (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Све процедуре су обављене према упутствима произвођача. Све концентрације протеина су одређене коришћењем Био-Рад комплета за анализу протеина (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД). Затим је у супернатант протеина додат пуфер за пуњење и помешан. Смеша је кувана 10 минута, а протеини су одвојени коришћењем Мини-ПРОТЕАН Прецаст гелова (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД) и пребачени на Хибонд поливинилиден дифлуоридну мембрану (Амерсхам Биосциенцес, Писцатаваи, Њ, САД). Имунодетекција је обављена коришћењем тирозиназе (1:1000), ТРП-1 (1:1000), ТРП-2 (1:1000), МИТФ (1:1000), фосфорилисаног ЦРЕБ(п-ЦРЕБ 1: 1000), ЦРЕБ(1:1000) и -тубулин (1:1000) (Технологија ћелијске сигнализације, Беверли, МА, САД) користећи СигналБоост Иммунореацтион Енханцер Кит (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД). Мембрана је инкубирана преко ноћи са примарним антителима на 4 ◦Ц. Козје анти-зечје (ИгГ) секундарно антитело (1:5000, технологија ћелијске сигнализације) је додато у мембрану и инкубирано на собној температури 1 х. Протеинске траке су примећене коришћењем побољшаног Пиерце ЕЦЛ вестерн блоттинг супстрата (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) и квантификоване као однос интензитета траке циљног протеина према интензитету траке -тубулина.

2.12. Статистичка анализа

Сви тестови су независно поновљени најмање три пута. Сви статистички параметри су представљени као средња стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Статистичке анализе су обављене коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА), након чега је уследио Дан-ов пост-хоц тест. Вредност п < 0.01="" или="" п="">< 0,05="" се="" сматра="">

тест за флавоноиде

3. Резултати

3.1. Поређење антиоксидативних својстава неколико делимичних екстраката КЦ

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >КЦС (25,7 ± 2,1 проценат ) > КЦФ (8,7 ± 1,1 проценат ) (Слика 1Е).

3.2. Поређење одрживих и оштећених кератиноцита третираних са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству УВА, УВБ или не-зрачења

Спровели смо следеће експерименте да бисмо истражили ефекте КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ онкератиноцита. Прво, сви екстракти су примењени на ХаЦаТ кератиноците у присуству УВА, УВБ или не-зрачења. ЦЦК-8 анализа је показала да екстракти нису значајно променили виталност кератиноцита у концентрацијама од 0.5 мг/мЛ. Касније су кератиноцити третирани КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ у присуству УВА или УВБ зрачења. УВА и УВБ зрачење значајно инхибира виталност кератиноцита, као што је приказано анализом ЦЦК-8 на слици 2А. Међутим, открили смо да се одрживост кератиноцита озрачених УВА и УВБ зракама повећала у следећем редоследу: КЦЛ, КЦР, КЦС и КЦФ (слика 2А). Такође смо пратили оштећене кератиноците мерењем екстрацелуларног ослобађања ЛДХ. Резултати су показали да УВА или УВБ зрачење значајно олакшава ослобађање ЛДХ; међутим, КЦЛ, КЦР, КЦС и КЦФ значајно су ослабили ослобађање ЛДХ са излагањем УВА или УВБ у том редоследу (Слика 2Б). Наведени експериментални резултати су показали да су антипролиферативни и цитотоксични ефекти УВА или УВБ зрачења на кератиноците ублажени по редоследу КЦЛ, КЦР, КЦС и КЦФ. Посебно, КЦЛ може вратити виталност ћелија на нивое контроле.

Слика 2. Вијабилност кератиноцита и ефекти цитотоксичности КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ екстракта у присуству УВА, УВБ или не-зрачења.

3.3. Поређење интрацелуларне РОС производње у кератиноцитима третираним са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству или одсуству УВА и УВБ зрачења

Како интрацелуларна производња РОС изазива озбиљно оштећење кератиноцита, они се сматрају потенцијалним медијаторима оштећења изазваних УВА или УВБ зрачењем. Неколико студија је сугерисало да УВА или УВБ зрачење индукује ендогену производњу РОС [12,14]. Циљ нам је био да утврдимо да ли је дошло до повећања нивоа ендогених РОС у кератиноцитима озраченим УВА или УВБ. Сходно томе, анализирали смо интензитет интрацелуларне флуоресценције сонде ЦМ-Х2ДЦФДА помоћу флуоресцентне микроскопије и проточне цитометрије. Као резултат флуоресцентне микроскопије, слике бојења ЦМ-Х2ДЦФДА показале су благо бојење у контролним кератиноцитима третираним КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ и значајно бојење у кератиноцитима озраченим УВА или УВБ (Слика 3А). Према квантификованим резултатима проточне цитометрије, УВА и УВБ зрачење је повећало нивое интрацелуларних РОС у кератиноцитима за 27,2 ± 4,5 одсто и 34,1 ± 4,2 одсто, респективно, у поређењу са оним у контроли (5,7 ±0.2 процента). Поред тога, слично резултатима флуоресцентне микроскопије, потврђено је да је интрацелуларни ниво РОС потиснут екстрактима КЦ у редоследу КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ у присуству УВА или УВБ зрачења (слика 3Б). Ови резултати указују на то да неколико делимичних екстраката КЦ значајно инхибира оштећење кератиноцита смањењем ендогених нивоа РОС.

Слика 3. Утицај екстракта КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ на интрацелуларну производњу РОС у УВА, УВБ или неозраченим кератиноцитима

3.4. Поређење апоптозе кератиноцита третираних са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству или одсуству УВА и УВБ зрачења

Да би се открила апоптоза, која је поуздан показатељ оштећења кератиноцита, кератиноцити су обојени Анексином В у комбинацији са пропидијум јодидом. Комплет флуоресцеин изотиоцијаната (ФИТЦ) Аннекин В/Апоптосис Деад Целл Кит је коришћен за тестирање брзине апоптозе у кератиноцитима. УВА и УВБ зрачење је олакшало активност бојења Анексином В, док су КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ смањили стопу активности бојења Анексином В у присуству УВА и УВБ зрачења. Само КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ (0.5 мг/мЛ) нису изазвали активност бојења Анексином В. Квантификовани подаци из проточне цитометрије показали су да УВА и УВБ зрачење повећава ниво апоптозе кератиноцита за 46,3± 1,5 одсто и 48,7 ± 1.0 процената, у поређењу са контролном (5.0 процената ± 0.7 процената). Важно је да је потврђено да је ниво апоптозе потиснут екстрактима КЦ у редоследу КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ у присуству УВА или УВБ зрачења (Слика 4А, Б). Све у свему, УВА и УВБ зрачење је изазвало оштећење кератиноцита, а неколико делимичних екстраката КЦ ослабили су оштећење кератиноцита изазвано УВ зрачењем.

Слика 4. Ефекат екстракта КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ на апоптозу у УВА, УВБ или неозраченим кератиноцитима.

3.5. Поређење садржаја интрацелуларног меланина и активности тирозиназе меланоцита третираних са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству или одсуству третмана -МСХ

Пре истраживања биолошког потенцијала КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ на меланогенезу изазвану МСХ, виталност ћелија након третмана КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ (0.5 мг/мЛ) процењена је коришћењем ЦЦК-8 тест у меланоцитима Б16Ф10 са или без -МСХ. КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ (0,5 мг/мЛ) нису променили виталност ћелија у присуству или одсуству -МСХ (Слика 5А). -МСХ је важан меланогени агенс који може повећати садржај интрацелуларног меланина везивањем за меланокортин 1 рецептор и активирањем аденилат циклазе. Да би се истражио ефекат КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ на меланогенезу у меланоцитима, садржај интрацелуларног меланина је одређен визуелним посматрањем и биохемијским мерењима. Као што је приказано на Слици 5Б, садржај интрацелуларног меланина је значајно повећан за -МСХ. Међутим, заједнички третман са КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ показао је значајно смањење интрацелуларног садржаја меланина у поређењу са третманом -МСХ. Редослед биохемијских мерења који указује на инхибицију интрацелуларног садржаја меланина био је следећи: КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ (Слика 5Б). Испитивање интрацелуларне активности тирозиназе је изведено према тесту садржаја интрацелуларног меланина. Интрацелуларна активност тирозиназе меланоцита стимулисаних -МСХ се повећала, док је меланоцита стимулисаних -МСХ третираних КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ смањена. Редослед биохемијских мерења који указује на инхибицију интрацелуларне тирозинасеактивности био је следећи: КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ (Слика 5Ц). Ови резултати показују да неколико делимичних екстраката КЦ значајно смањује садржај интрацелуларног меланина и инхибира активност тирозиназе без промене виталности ћелија.

3.6. Поређење нивоа транскрипције и транслације тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 у меланоцитима третираним са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству или одсуству-МСХ третман

Да би се истражио ефекат КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ на смањење нивоа експресије протеина и иРНК маркера меланогенезе (тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2), меланоцити су третирани КЦР , КЦС, КЦЛ и КЦФ у присуству или одсуству -МСХ. Као што је приказано на слици 6А–Ц, нивои мРНА тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 су значајно повећани третманом -МСХ. Насупрот томе, у поређењу са третманом -МСХ, КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ смањили су експресију мРНК тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2. Поред тога, КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ сами нису имали значајан утицај на нивое мРНК тирозиназе, ТРП-1 и ТРП{11}}. Вестерн блот анализа је изведена у сарадњи са ПЦР-ом у реалном времену. Резултати су показали да -МСХ третман повећава нивое експресије протеина тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 и да су ови нивои смањени заједничким третманом са КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ (слика 6Д ). Секвенца квантитативне ПЦР у реалном времену и вестерн блотинирања инхибиције тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 мРНА и експресије протеина била је следећа: КЦЛ > КЦР=КЦС > КЦФ (Слика 6). Ови резултати сугеришу да неколико делимичних екстраката КЦ има потенцијал да промовише анти-меланогенезу, што се показало смањењем регулације маркера меланогенезе.

3.7. Поређење МИТФ експресије и ЦРЕБ фосфорилације меланоцита третираних са неколико делимичних екстраката КЦ у присуству или одсуству третмана -МСХ

Тирозиназа, ТРП-1 и ТРП-2 су неопходни у меланогенези. Њихова експресија је регулисана МИТФекспресијом и ЦРЕБ фосфорилацијом [17,21]. Вестерн блот анализа је показала да су КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ ефективно инхибирали повећање нивоа протеина МИТФ-а узроковано третманом -МСХ. Поред тога, само КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ једва да су детектовали експресију МИТФ протеина. Секвенца квантификованих вестерн блот резултата који указује на инхибицију нивоа експресије МИТФ протеина била је следећа: КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ (Слика 7А). Штавише, КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ су преокренули ефекте третмана -МСХ на фосфорилацију ЦРЕБ. КЦР, КЦС, КЦЛ и КЦФ сами су имали мали утицај на фосфорилацију ЦРЕБ. Секвенца квантификованих вестерн блот резултата који указује на инхибицију нивоа фосфорилације ЦРЕБ била је следећа: КЦЛ > КЦР > КЦС > КЦФ (Слика 7Б). Ови резултати су показали да је неколико делимичних екстраката КЦ потиснуло меланогенезу у меланоцитима, барем делимично, кроз МИТФ експресију и ЦРЕБ фосфорилацију.

4. Дискусија

Популарност избељивања коже расте широм света због повећања УВ зрачења и вероватно ће достићи велике размере у наредним деценијама у естетске сврхе [8]. Бројне врсте избељивача, као што су којична киселина и арбутин, користе се на козметичком и фармацеутском тржишту. Штавише, природним екстрактима се поклања све већа пажња због њихових потенцијалних антиоксидативних, антиинфламаторних, антитуморских, антибактеријских и других активности [26,27]. На основу карактеристика антиоксиданата и фотопротективне и антимеланогенезе, развијено је неколико козметичких и фармацеутских кандидата. Добро је познато да су ова својства кандидата за избељивање незаменљиви допринос козметичком и фармацеутском истраживању и развоју [28]. ТДМ има вишекомпонентна и вишециљна својства и у великој мери побољшава људску биолошку ефикасност и квалитет живота [29]. Савремена фитокемијска истраживања показују да КЦ садржи различите састојке, при чему су главни састојци лигнани и терпеноиди [30]. Идентификовано је више од 202 једињења, укључујући дибензоциклооктадиен лигнане, спиробензофураноид дибензоциклооктадиен лигнане, арилнафталенске лигнане, кадлонгилактон тритерпеноиде и сесквитерпеноиде [31,32]. Осушени корени, стабљике и листови КЦ имају широку традицију употребе у ТДМ за лечење реуматоидног артритиса, чирева на дванаестопалачном цреву, гастроинтестиналних поремећаја и гинеколошких проблема. Осушени корени КЦ, са деловањем чишћења топлоте и елиминисања токсина, изазивају диурезу за уклањање едема. Плодови КЦ се највише конзумирају у облику свежег воћа, сокова и воћног вина, што указује да су корисни за здравље људи [7,33,34]. Претходна истраживања су такође показала да је богат биоактивним састојцима као што су лигнани, тритерпеноиди, флавоноиди, фенолне киселине, стероиди и аминокиселине, које имају високу нутритивну и медицинску вредност [3,35]. У овој студији екстраховани су различити делови КЦ. Приметно је да је укупан садржај полифенола и флавоноида у листовима и корену КЦ био много већи него у стабљикама и плодовима. Листови и корени садрже више него двоструко више полифенола и флавоноида него стабљике и плодови. Као резултат тога, сматрамо да укупни полифеноли и флавоноиди дају значајан допринос фотопротективним и антимеланогеним ефектима КЦ.

Кожна фототоксичност узрокована УВ зрачењем је првенствено последица ћелијске цитотоксичности, интрацелуларне акумулације РОС-а и апоптозе у кератиноцитима. Стога је разумније фокусирати се на инхибицију ћелијске цитотоксичности, интрацелуларну акумулацију РОС и апоптозу у кератиноцитима озраченим УВА и УВБ [36,37]. Као што је описано у овој студији [10,38], интервенција са екстрактима КЦ на фото-цитотоксичност (УВА: 20 Ј/цм2, УВБ: 50 мЈ/цм2) показала је да екстракти КЦ значајно смањују ћелијску цитотоксичност, интрацелуларну акумулацију РОС и апоптоза. У складу са претходним резултатима, фото-заштитни ефекти листова и корена КЦ били су много већи од ефеката стабљике и плода. Штавише, наши резултати су показали да екстракти КЦ показују горе поменуте ефекте промовишући антиоксидативну активност. Меланогенеза се често примећује након УВ зрачења и првенствено је повезана са пигментацијом или хиперпигментацијом [39]. Према досадашњим истраживањима, метода изазивања меланогенезе коришћењем -МСХ је широко призната и примењена. Стога је ова студија заснована на конструкцији модела меланоцита стимулисаног -МСХ [24,39]. Открили смо да екстракти КЦ потискују -МСХ-стимулисани интрацелуларни садржај меланина и активност тирозиназе. Поред тога, КЦ екстракти су смањили транскрипцију и транслацију маркера меланогенезе као што су тирозиназа, ТРП-1 и ТРП-2 у меланоцитима стимулисаним -МСХ. Даље, истражили смо експресију МИТФ протеина и фосфорилацију ЦРЕБ у меланоцитима стимулисаним -МСХ. Слично томе, у овој студији смо открили да екстракти КЦ потискују -МСХ посредовану експресију МИТФ протеина и ЦРЕБ фосфорилацију у меланоцитима. У складу са фотопротективним резултатима, антимеланогени ефекти листова и корена КЦ били су много већи од ефеката стабљика и плодова.

цистанцхе кришке

За више информација кликните овде.

5. Закључци

Све у свему, потенцијални фотопротективни и антимеланогени ефекти екстракта КЦ пронађени су у овој студији. Екстракт КЦ са високим садржајем полифенола и флавоноида може да има фото-заштитне и антимеланогене ефекте на кератиноците и меланоците. Ова студија даје образложење и стратегију истраживања козметичких и фармацеутских интервенција за природна средства за избељивање и фотопротективну заштиту.