Вишекомпонентни режими вакцинације против Цхламидиа Трацхоматис изазивају реакције антитела и Т ћелија и убрзавају уклањање инфекције код модела примата који није човек Ⅱ

материјали и методе

Антигени и адјуванси вакцине

У овој студији коришћени су различити антигени и адјуванси вакцине: ЦТХ522 антиген вакцине, заснован на МОМП (11) је даван интрамускуларним путем (ИМ) са ЦАФ01 адјувансом (42) или алуминијум хидроксидом (АлОХ) адјувансом, или интраназалним путем ( ИН) без помоћног средства. Плазмидна ДНК вакцина, пцДНА3.1-МОМП, направљена је клонирањем консензус МОМП у плазмидни вектор пцДНА3.1 (14) и давана интрадермалним (ИД) путем са електропорацијом (ЕП) у леђима. Вакцина рекомбинантног хуманог аденовируса серотипа 5 (рХуАд5) која експримира МОМП (ХуАд5-МОМП) направљена је хомологном рекомбинацијом консензус МОМП (ААЦ45154.1) у Е1 и Е2 делетед ХуАд5 плазмид пАЛ1112 вектор и администриран преко 1 у4тра вектору . Модификована вакцина Анкара-МОМП вакцина произведена одрекомбиновање консензуса МОМП(ААЦ45154.1) у плазмид п3186 и атенуирани МВА вектор (14) и примењен прекоинтрамускуларни пут.

Кликните овде да бисте добили Цистанцхе за антиинфламаторно

Ц. трацхоматис серовар Д залиха

Цхламидиа трацхоматис серовар Д (Цт СвД; УВ{{0}}/Цк, АТЦЦ® ВР-885™) је добијен из Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ, Манассас, ВА) и размножен у ХеЛа{ {2}} ћелије, сакупљене и пречишћене како су описали Цалдвелл ет ал. (43). Залихе Ц. трацхоматис СвД су чуване на -80 степену у 0,2 М сахарозе, 20 мМ натријум фосфата (пХ 7,4) и 5 ​​мМ глутаминске киселине (СПГ), а концентрација јединица које формирају инклузије (ИФУ) је одређена у ХеЛа{11}} ћелије и МцЦои ћелије.

Примати који нису људи

Тридесет макаки циномолгус (Мацаца фасцицуларис) тежине од 3 до 5 кг укључено је у студију која је обрађена у објектима НХП нивоа биолошке безбедности 3 (АБСЛ3) ИДМИТ-а („Модели заразних болести и иновативне терапије“ у ЦЕА „Цоммиссариат а л'Енергие, Атом. Фонтенаи-аук-Росес, Француска; број акредитације #Д92- 032-02). Протоколе је одобрио институционални етички комитет „Цомите д'Етхикуе ен Екпе риментатион Анимале ду Цоммиссариат а л'Енергие Атомикуе ет аук Енергиес Алтернативес“ (ЦЕтЕА #44) под бројем изјаве А14-026. Студију је одобрило „Министарство за истраживање, иновације и образовање“ под регистрационим бројем АПАФИС#720-201505281237660. Све животиње су биле негативне на СИВ, СХИВ, СТЛВ (мајмунски Тлимпхотропиц вирус), вирус херпеса Б, филовирус, СРВ-1, СРВ-2 пре студије и потврђено је да су серонегативне на инфекцију кламидијом. Сви експериментални поступци су спроведени према европским смерницама за негу животиња („Јоурнал Оффициел де л'Унион Еуропе енне“, директива 2010/63/ УЕ, 22. септембар 2010).

Протоколи вакцинације

30 макака су насумично подељени у 6 група са по 5 животиња у свакој. Различити режими примања вакцинације за 6 група су детаљно илустровани на слици 1. Током свих вакцинација, макаки су били седирани кетамин хлорхидратом (10 мг/кг телесне тежине интрамускуларно). ЦТХ522 (85 µг по животињи) је даван интрамускуларним (ИМ) путем са или ЦАФ{{20}}1 адјувансом (625 µг/125 µг) или АлОХ адјувансом (0.425 мг ), као што је приказано на слици 1. ИМ имунизације су обављене у запремини од 0,6 мл у десној бутини (М. куадрицепс) животиње. ЦТХ522 Интраназалне (ИН) имунизације (30 µг по животињи) су изведене помоћу Вакинатор уређаја спојеног на шприц од 1 мл са две узастопне примене од 0,25 мл, по једну у сваку ноздрву. ДНК-МОМП вакцина је примењена интрадермалним (ИД) путем са електропорацијом (ЕП) у кожу леђа. Убризгано је 6 поновљених запремина од 0,1 мл ИД (укупно 1 мг), а затим ЕП коришћењем Непаген™ система (подешавања: 6 квадратних импулса од 10 мс са интервалима од 90 мс на 110 В, (300- 700 мА)) . ХАд5-МОМП вакцина је примењена ИМ са дозом од 1011 вирусних честица у 1 мл по животињи. МВА-МОМП вакцина је примењена ИМ са дозом од 4 к 108 ПФУ по животињи у запремини од 0,5 мл**. Наивној групи није дата никаква вакцинација и сматрало се да је контролна група.

Узимање узорака

Током свих поступака узорковања, макаки су седирани кетамин хлорхидратом (10 мг/кг телесне тежине ИМ). Крв је сакупљена путем феморалне венепункције у седмици 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Цервиковагинална течност за детекцију антитела је сакупљена помоћу Вецк-Цел®спеарс (Медтрониц Опхтхалмицс, Јацксонвилле, ФЛ , САД) у недељи 4, 8, 16, 18, 20, 22 и 24. Цервиковагинални узорци за детекцију оптерећења хламидијом су сакупљени редовним равним брисевима (Маст Диагностиц - реф.: 552Ц/10). Након контакта са вагино-цервикалном слузокожом, брис је стављен у бочицу која садржи УТМ-РТ медијум (Маст Диагностиц – реф.: 330Ц/6) и држан на леду.

Вагинална изазовна инфекција са 5*107 ИФУ Ц. трацхоматис СвД

Животиње су седиране кетамин хлорхидратом (10 мг/кг ИМ), стављене у вентрални лежећи положај са подигнутим куковима и 1 мл инокулума је трауматски примењен директно на вагиналну слузокожу на прелазу вагино-цервикса користећи шприц од 1 мл. Свакој животињи је дата доза од 5 к 107 ИФУ. Животињи је дозвољено да остане у вентралном положају са подигнутим куковима кратко време након инокулације.

Ензимски имуносорбентни тест

ЦТХ522специфична антителау узорцима серума и брисева откривени су индиректном ЕЛИСА тестом. Макисорп® плоче (НУНЦ А/С, Роскилде, Данска) су обложене са ЦТХ522 (0.5 µг/мл) преко ноћи на 4 степена. Изотипови ИгГ и ИгА су детектовани ХРП коњугованим антителима специфичним против ИгГ нељудског примата (43Р-ИГ020ХРП, Фицџералд, Ектон, МА, САД, 1:75.{10 }}) и ИгА (43Ц-ЦБ1631, Фицџералд, САД, 1:50.{16}}). Реакције су визуелизоване са ТМБ ПЛУС супстратом (КемЕнТец, Тааструп, Данска) и заустављене са 0,5 М сумпорном киселином. Плоче су очитане на ЕЛИСА читачу на 450 нм са корекцијом на 650 нм. Позитивна контрола (серум из претходне студије) је коришћена као интерни стандард за корекцију варијација од плоче до плоче. Два бунара су рађена без супстрата као негативна контрола на свакој плочи. Титри антитела су израчунати као реципрочна вредност највећег разблажења са вредношћу оптичке густине (ОД) већом од граничне вредности. Граница је одређена од средње вредности узорка 0 дана плус 2*СД.

Пептидни низ и анализа

ЦТХ522 пептидни низ је дизајниран са три примерка имобилизованих 15мер пептида који се преклапају са 14 аминокиселина које су штампане на функционализованим стакленим плочицама и инкубиране са узорцима серума од стране ЈПТ Пептиде Тецхнологиес, ​​Берлин. Укратко, низ је инкубиран са узорцима серума прикупљеним 24. недеље и ИгГ пептидни комплекси су визуелизовани коришћењем биотинилованог козјег анти-мајмунског ИгГ и Алека Флуор® 647 Стрептавидина. Слајдови су скенирани скенером високе резолуције на 635 нм и подаци су пријављени као произвољне јединице флуоресценције. Одређена је средња вредност троструких вредности, ако је коефицијент варијације већи од 0.5, коришћене су само 2 најближе вредности. 10 процената сигнала максималног интензитета (65.535) коришћено је као гранична вредност запозитиван одговор, а средњим сигналима испод овог прага је додељена вредност која одговара половини вредности прага (3277).

Ин витро тест неутрализације

Тест неутрализације ин витро је изведен да би се тестирао капацитет серумских антитела изазваних вакцином да неутралишу инфекцију ХаК ћелија хламидијом ин витро. Анализа је углавном следила протокол који је претходно описан (44). Прво, узорци серума појединачних животиња су инкубирани на 56 степени током 30 минута да би се инактивирао комплемент. Залиха хламидије (СвД, СвЕ и СвФ) је помешана и инкубирана са серијским разблажењима инактивираног серума сваке вакцинисане животиње током 30 минута, а затим инокулисана на монослој ХаК ћелија у 96-плочама са равним дном бунара у дупликати. Након 30 сати инкубације, ћелије и инклузије су фиксиране и визуализоване поликлоналним зечјим анти-Цт043 серумом и флуоресцентно обележеним секундарним антителом (Алека Флоур 488, козји анти-зечји ИгГ, А11008, Лифе Тецхнологиес) у разблажењу1:500 . Бројање инклузија је извршено ручно у 20 видних поља при увећању од 40к (обрнути флуоресцентни микроскоп Олимпус ИКС71). Неутрализација је израчуната као процентуално смањење средњег броја ИФУ у поређењу са скупом серума животиња контролне групе (наивне).

Интрацелуларно ПБМЦ бојење цитокина и сродна цитометрија

ПБМЦ су изоловани и ({{0}} к 106) ресуспендовани у 150 µл комплетног медијума који садржи 0,2 µг сваког костимулаторног антитела ЦД28 и ЦД49б. Стимулација је изведена у 96 базенчића/плоча коришћењем 2 уМ сваког пептидног базена или СЕБ (као позитивна контрола) или самог медијума (као негативна контрола). Брефелдин А је додат у сваки бунар у коначној концентрацији од 10 µг/мл и плоча је инкубирана на 37 степени Ц, 5 процената ЦО2 преко ноћи. Ћелије су затим испране, обојене бојом за одрживост (љубичаста, флуоресцентна реактивна боја, Инвитроген), фиксиране и пермеабилизоване са БД Цитофик/Цитоперм реагенсом. Узорци пермеабилизованих ћелија су затим ускладиштени на -80 степени пре поступка бојења. Бојење антителом је изведено у једном кораку након пермеабилизације. Све коришћенеантителасу наведене у табели 1. После 30 минута инкубације на леду у мраку, ћелије су испране у БД Перм/Васх пуферу. Ћелије су пребројане помоћу ЛСР ИИ (БД) одмах након поступка бојења, а софтвер ФловЈо је коришћен за анализу података.

ТАБЕЛА 1 Антитела која се користе за бојење маркера имуних ћелија и интрацелуларних цитокина

Детекција вагиналне хламидијске ДНК квалитативним ПЦР-ом

Абботт РеалТиме ЦТ/НГ тест (АББОТТ, Рунгис, Француска) је ин витро тест ланчане реакције полимеразе (ПЦР) за директну, квалитативну детекцију плазмидне ДНК за ЦТ (Ц.трацхоматис) и НГ (Н. гоноррхоеае) геноме . Нуклеинска киселина је екстрахована из узорака УТМ (универзални транспортни медијум) на М2000СП, а амплификација је изведена на М2000СП, према упутствима произвођача. Резултати су изражени као праг циклуса (Цт).

Статистичка анализа

Све статистике су обављене помоћу софтвера ГрапхПад Присм (верзија 8.1.2). Подаци који нису нормално распоређени су анализирани непараметарским тестовима; Крускал–Волисов тест и Дунн-ови тестови вишеструког поређења да би се утврдила значајност разлике између група. Криве које показују проценат ПЦР негативних животиња упоређене су са статистичким тестом Лог-ранк (Мантел-Цок). Поређења су сматрана статистички значајним ако је вредност П била < 0.05 (П < 0.05). Даљи нивои значаја су означени звездицама *П < 0.05, **П < 0,01, ***П < 0,001.

Изјава о доступности података

Оригинални доприноси представљени у студији укључени су у чланак/допунски материјал. Даљи упити се могу упутити одговарајућем аутору.

Етичка изјава

Студију на животињама је прегледао и одобрио "Цомите д'Етхикуе ен Екпериментатион Анимале ду Цоммиссариат а л'Енергие Атомикуе ет аук Енергиес Алтернативес" (ЦЕтЕА #44) под бројем изјаве А14-026. Студију је одобрило "Министарство за истраживање, иновације и образовање" под регистарским бројем АПАФИС#720-201505281237660.

Прилози аутора

Осмишљени и осмишљени експерименти: ЈД, ФФ, ЕЛ, ПА, РГ, РС. Изведени експерименти: ВЦ, ДД, БД, СЛ, ЦД, ЦЈ, НД-Б, ЦБ, ББ, АТ. Произведене вакцине и антиген конструкти: ИР, ПМ, АО. Анализирали податке: ЈД, ЕЛ, ФФ, ИР, ХЈ. Израдио и уредио рад: ЈД, ЕЛ, ФФ. Сваки од наведених коаутора дао је значајан допринос раду кроз дизајн и концепцију, и/или прикупљање, анализу и интерпретацију података. Сви аутори су дали допринос чланку и одобрили достављену верзију.

Признања

Захваљујемо Фондацији Дормеур, Вадуз на донацији Јединици за вирусну еволуцију и трансмисију за лабораторијске инструменте релевантне за овај пројекат.

Сукоб интереса ФФ, ИР, ПА и АВО су ко-проналазачи на патентној пријави за вакцине против хламидије [ВО2014146663А1]. Сва права су додељена Статенс Серум Институту, данском непрофитном владином институту. Преостали аутори изјављују да је истраживање спроведено у одсуству било каквих комерцијалних или финансијских односа који би се могли протумачити као потенцијални сукоб интереса.

Напомена издавача Све тврдње изражене у овом чланку су искључиво ауторске и не представљају нужно оне њихових придружених организација, нити издавача, уредника и рецензената. Издавач не гарантује нити подржава било који производ који се може оценити у овом чланку или тврдње које може да направи његов произвођач.

Референце

1. Невман Л, Ровлеи Ј, Вандер Хоорн С, Вијесоорииа НС, Унемо М, Лов Н, ет ал. Глобалне процене преваленције и инциденције четири излечиве полно преносиве инфекције у 2012. на основу систематског прегледа и глобалног извештавања. ПЛоС Оне (2015) 10(12):е0143304. дои: 10.1371/јоурнал.поне.0143304

2. Лонгботтом Д, Цоултер Љ. Хламидиозе животиња и импликације зооноза. Ј Цомп Патхол (2003) 128 (4): 217–44. дои: 10.1053/јцпа.2002.0629

3. Хаггерти ЦЛ, Готтлиеб СЛ, Таилор БД, Лов Н, Ксу Ф, Несс РБ. Ризик од последица након гениталне инфекције цхламидиа трацхоматис код жена. Ј Инфецт Дис (2010) 201 Додатак 2: С134–55. дои: 10.1086/652395

4. Додет Б. Тренутне препреке, изазови и могућности за развој ефикасних вакцина против сполно преносивих болести: становиште произвођача вакцина, биотехнолошких компанија и финансијских агенција. Вакцина (2014) 32(14):1624–9. дои: 10.1016/ ј.ваццине.2013.08.032

5. Брунхам РЦ, Куо ЦЦ, Цлес Л, Холмес КК. Корелација имуног одговора домаћина са квантитативним опоравком Цхламидиа трацхоматис из људског ендоцервикса. Инфецт Иммун (1983) 39(3):1491–4. дои: 10.1128/иаи.39.3.1491- 1494.1983

6. Цоттер ТВ, Менг К, Схен ЗЛ, Зханг ИКС, Су Х, Цалдвелл ХД. Заштитна ефикасност имуноглобулина а (ИгА) и моноклонских антитела специфичног за протеин спољне мембране (ИгА) и ИгГ у мишјем моделу инфекције гениталног тракта цхламидиа трацхоматис. Инфецт Иммун (1995) 63(12):4704–14. дои: 10.1128/иаи.63.12.4704-4714.1995

7. Јоханссон М, Сцхон К, Вард М, Лицке Н. Студије на нокаут мишевима откривају да антихламидијска заштита захтева ТХ1 ћелије које производе ИФН-гама: да ли је то тачно за људе? Сцанд Ј Иммунол (1997) 46(6):546–52. дои: 10.1046/ј.1365- 3083.1997.д01-167.к

8. Гондек ДЦ, Оливе АЈ, Стари Г, Старнбацх МН. ЦД4 плус Т ћелије су неопходне и довољне да обезбеде заштиту од инфекције хламидијом трахоматисом у горњем гениталном тракту миша. Ј Иммунол (2012) 189(5):2441–9. дои: 10.4049/ јиммунол.1103032

9. Армитаге ЦВ, О'Меара ЦП, Харвие МЦ, Тиммс П, Вијбург ОЛ, Беаглеи КВ. Евалуација интра- и екстра-епителног секреторног ИгА код хламидијских инфекција. Имунологија (2014) 143(4):520–30. дои: 10.1111/имм.12317

10. Армитаге ЦВ, О'Меара ЦП, Харвие МЦ, Тиммс П, Блумберг РС, Беаглеи КВ. Дивергентни исходи након трансцитозе ИгГ циљаних на интрацелуларне и екстрацелуларне хламидијске антигене. Иммунол Целл Биол (2014) 92(5):417–26. дои: 10.1038/ицб.2013.110

11. Олсен АВ, Фоллманн Ф, Ернехолм К, Росенкрандс И, Андерсен П. Заштита од инфекције Цхламидиа трацхоматис и патолошких промена горњег гениталног тракта помоћу неутрализујућих антитела промовисаних вакцином усмерених на ВД4 главног протеина спољашње мембране. Ј Инфецт Дис (2015) 212 (6): 978–89. дои: 10.1093/инфдис/јив137

12. Нгуиен Н, Гулеед С, Олсен АВ, Фоллманн Ф, Цхристенсен ЈП, Диетрицх Ј. Тх1/Тх17 Т ћелијски имунитет резидентан у ткиву повећава заштиту, али није потребан у стратегији вакцинације против гениталне инфекције цхламидиа трацхоматис. Фронт Иммунол (2021) 12:790463. дои: 10.3389/фифимму.2021.790463

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел: плус 86 15292862950

Додајте цистанцхе додатак у корпу:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп