Нано комплекси млечних протеина и слузи: карактеризација и ефекат против рака, 2. део

За више информација контактирајтеtina.xiang@wecistanche.com

Кликните на линк да научите први део:хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/невс/нано-милк-протеин-муцилаге-цомплекес-цхарацте-55049142.хтмл

3. Материјали и методе

3.1. Материјали

Плантаго овата (подциљ) љуске и зрели плод Зизипхус Спина-Цхристи(Набек) купљени су из Гизе, Египат; Концентрат млечних протеина (МП, 81,3 одсто протеина) набављен је од компаније Фонтерра (Окленд, Нови Зеланд). Казеин и протеини сурутке у МПЦ су углавном у свом природном и сличном, мицеларном, облику онима који се налазе у млеку. Све коришћене хемикалије биле су аналитичке чистоће.

3.2. Припрема слузи Исабгол љуске (ИХМ) и Набег слузи (НабМ)

Слуз од Исабгол љуске (ИХМ) и Набек слуз (НабМ) су припремљени према методи коју су описали Ел-Максоуд ет ал. [5]. Укратко, суспензија исабгол љуске је припремљена растварањем 1,2 г у 100 мЛ дестиловане воде и пречишћена раствором ацетона. Добијени гел је чуван у фрижидеру (4-5 степен ) до употребе.

За НабМ, зрели плодови Набек-а су темељно опрани водом из славине да би се уклонила прљавштина. Свежи плодови су одвојени од семена и помешани са дестилованом водом у односу 1:10 (теж./запр.) након што су исечени на мале комаде. Смеша је измешана помоћу лабораторијског блендера (Тосхиба Микие, Јапан) и остављена да стоји 12 х у фрижидеру.

Слузави екстракт је затим центрифугиран на 2000 рпм током 30 минута и филтриран кроз крпу од муслина. Добијена вискозна растворљива слуз је исталожена ацетоном. Добијена сирова слуз је чувана у фрижидеру до употребе.

За аналитичке сврхе, слуз је сушена у ваздушној пећи на 40 степена и млевена у млину ММ400 (Ретсцх, Немачка). Измерен је хемијски састав праха слузи љуске псилијума (ПХМП) и праха слузи Набек (НабМП). Садржај влаге, протеина, масти, пепела, сирових влакана и укупних угљених хидрата био је 8,49, 0,34, 0,21, 2,13, 1,53 и 87,44 процената за ПХМП и 9,18, 4,72, 2,05, 2,69, 1,70 и 78 процената за Наб. , редом. Добијени прах је чуван на хладној температури (4-5 степени) до даље анализе.

Кликните да бисте сазнали више информација

3.3. Припрема комплекса млечних протеина и слузи (МПМЦ)

Комплекси млечних протеина (МП) са ИХМ и НабМ су припремљени према Морр ет ал. уз одређене модификације [44]. Концентрат млечних протеина је реконституисан у дестилованој води (10 проценат). Добијени колоид млечног протеина је помешан са ИХМ и НабМ у односу 1:3 (о/о). пХ смеше је подешен на 10 и остављен да одстоји 10 мин. Након тога, пХ је снижен на 3,5 употребом 0,1 Н ХЦл и остављен још 10 мин. пХ је затим подешен на пХ 4,6 коришћењем 0,5 М НаОХ да би се прикупио МПМЦ филтрацијом на филтер папиру: МП, као и резултујући МПМЦ, су сушени лиофилизацијом на -45 степени Ц током 24 сата користећи Новалипхе-НЛ500 лиофилизатор , Савант Инструментс, Холбрук, Њујорк, САД.

3.4. Физичко-хемијске и функционалне карактеристике

3.4.1.Мерење пХ вредности

пХ добијених производа у 10 процентном раствору је мерен коришћењем калибрисаног пХ метра (ХАННА, ХИ 902 м, Немачка).

3.4.2. Одређивање насипне густине (БД), густине изрезивања (ТД) и Царровог индекса

МПМЦ прах је сипан у мерни цилиндар од 50 мЛ до 25 мЛ, што одговара неискоришћеној запремини, а затим куцните 5-10 пута док се не примећује даља промена запремине праха која одговара испуштеној запремини.

Насипна густина, густина изрезивања и Царров индекс су одређени применом следећих једначина [45]:

(1)БД=маса/неискоришћена запремина

(2)ТД=маса/запремнина

(3)Каров индекс ( проценат )= (ТД-БД)/ТД×100

3.4.3. Индекс апсорпције воде (ВАИ) и индекс растворљивости у води (ВСД)

Растворљивост у води и индекси апсорпције воде МП и МПМЦ испитивани су према методи коју су описали Иагц и Гогус уз одређене модификације [46]. Узорци (0.5 г) су дисперговани у 10 мЛ дестиловане воде на 25 степени у епрувети за центрифугирање. Након стајања од 30 мин, са инверзијом епрувете сваких 5 мин, узорци су центрифугирани на 3500 рпм током 15 мин. Филтрат је пребачен на алуминијумску плочу и сушен 3 сата на 105 степени. Тежина преосталог гела је забележена и ВСИ и ВАИ су одређени на следећи начин:

(4)ВАИ(г/г)= Повећање тежине гела/суве тежине узорка

(5)ВСИ проценат=Тежина суве чврсте материје у супернатанту ×100/Сува тежина узорка

3.4.4. Пробављивост млечних протеина

Сварљивост протеина је одређена према Абд Ел-Гхани ет ал. [47]. Укратко, узорци МП и МПМЦ су дисперговани у дестилованој води у концентрацији од 6,38 мг/мЛ, а пХ је подешен на 8.0. Један милилитар свеже припремљеног основног раствора ензима (1,6 мг/мЛ трипсина, 3,1 мг/мЛ химотрипсина и 1,3 мг/мЛ ЕР амино пептидазе1

(ЕРАП1) је помешан са протеинском суспензијом на 37 степени. пХ је забележен након 10 минута, а активност ензима је одређена коришћењем казеина као референце. За израчунавање сварљивости протеина коришћена је следећа једначина [47]:

(6) проценат сварљивости=210.46-18.10 (пХ)

3.5.Фенолне фракције ПХМ и НабМ

Фенолна једињења узорака слузи применом ХПЛЦ анализе су спроведена према протоколу који су описали Елсаиед ет ал. [48]. Укратко, екстракт слузи је анализиран коришћењем ХПЛЦ система серије Агилент 1260 (Агилент Тецхнологиес Инц., Санта Цлара, Калифорнија, САД). Раздвајање је извршено помоћу Ц18 колоне (100 мм × 4,6 мм ид, 5 ум). Мобилна фаза је садржала (А) воду 0,2 процента Х3ПО4, (Б) метанол и (Ц) ацетонитрил при брзини протока од 0,6 мЛ/мин. Градијентно елуирање је било према следећој шеми: 0-11 мин (96 процената А., 2 процента Б);11-13 мин (50 процената А, 25 процената Б);13-17 мин (40 проценат А, 30 процената Б);17-20.5 мин (50 процената Б, 50 процената Ц); и 20.5-30 мин (96 процената А, 2 процената Б). Таласна дужина детекције (УВ детектор, 284 нм) је постављен на 284 нм. Величина ињекције је била 20 μЛ, а температура колоне је одржавана на 30 степени. Једињења су била позната поређењем њиховог времена задржавања са онима из аутентичних стандарда. Калибрационе криве су коришћене за процену количина једињења.

3.6. Укупни садржај фенола и флавоноида у МП и МПМЦ

Садржај полифенола је одређен Фолин-Циоцалтеу методом уз одређене модификације [5]. Укратко, 2,8 мЛ милли-Кводе која садржи 10 мг МП или МПМЦ помешано је са 2 мЛ 2% натријум карбоната и 0,1 мЛ 50% Фолин-Циоцалтеау реагенса. После 30 минута инкубације на собној температури, мерена је апсорпција реакционе смеше на 750 нм у односу на дејонизовану воду као бланко коришћењем спектрофотометра (Хитацхи, Модел 100-20). Гална киселина (ГА) је коришћена као стандардно фенолно једињење и конструисана је стандардна крива од седам тачака (0-200 мг/Л). Резултати су изражени као милиграм еквивалента галне киселине по граму протеина (ГАЕ/г).

Флавоноидисадржај је одређен методом алуминијум хлорида како су претходно описали Абеделмаксоуд ет ал. уз неке модификације [5]. Укратко, 2,8 мЛ милли-К воде која садржи 10 мг МП или МПМЦ помешано је са 0.1 мЛ 10 процената алуминијум хлорид хексахидрата и 0,1 мЛ 1 М калијум ацетата. После инкубације на собној температури током 40 минута, мерена је апсорпција реакционе смеше на 415 нм у односу на дејонизовану воду као бланко. Кверцетин је коришћен као стандард користећи стандардну криву од седам тачака (0-50 мг/Л). Укупни садржај флавоноида је изражен као милиграмски еквиваленти кверцетина (КЕ/г).

3.7. Антиоксидативна активност МП и МПМЦ

Укупни капацитет уклањања слободних радикала МП и МПМЦ је процењен коришћењем три различита антиоксидативна теста: стабилан 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил(ДППХ), азино-бис(3-етилбензотиазолин{{5 }} радикали сулфонске киселине (АБТС) и хидроксил радикала (ХС), као што су претходно описали Ел-Максоуд и сарадници [5].

3.8. Профил аминокиселина МП и МПМЦ

Узорци протеина су кисели хидролизовани коришћењем 6 Н ХЦл према Пекса ет ал. [49. За одређивање аминокиселина коришћен је аутоматизовани анализатор аминокиселина (ААА 400, ИНГОс Лтд.).

3.9. Реолошка својства

Узорци су припремљени као што је описао Барнс [50] уз неке модификације. Вискозитет раствора од 2,5% (в/в) при пХ7 је одређен на 25±1 степен коришћењем Броокфиелд вискозиметра (ДВ-ИИ плус Про, Рхеоцалц Софтваре, Немачка). Напон (σ) и вискозитет (н) су приказани као функција брзине смицања. Индекс конзистентности (К) и индекс понашања протока (н) модела степена су израчунати:

Вредност н је једнака 1 за Њутнове течности и варира од 0 до 1 за течности које се разређују смицањем и већа од 1 за течности које згушњавају смицање [51].

3.10.Диференцијална скенирајућа калориметрија (ДСЦ)

Термичка својства МП и МПМЦ су мерена коришћењем диференцијалног скенирајућег калориметра (ПеркинЕлмер, САД). Узорци (4-6 мг) су стављени у алуминијумску плочу и запечаћени. Сваки тигањ је затим загрејан на 350 степени са протоком сувог азотног гаса при 20 мЛ мин-И при брзини загревања од 10 степени мин-1. Из ендотермног врха ДСЦ термограма, процењена је температура почетка денатурације, максимална прелазна температура и тачка деградације [52]. Одређена је прелазна вредност енталпије (АХ) из области испод ендотермног пика на ДСЦ кривој, а као референца је коришћена празна алуминијумска посуда.

3.11. Инфрацрвена спектроскопија Фуријеове трансформације (ФТИР)

Инфрацрвени спектри између 600 и 3500 цм-И су мерени на 25 степени коришћењем ФТИР спектрофотометра (КФА Флек, УСА) методом пригушене укупне рефлексије користећи резолуцију од 4 цм-И и добијајући 10 скенирања у секунди.

3.12. Пренос електронска микроскопија

Микроструктура МП и МПМЦ је визуелизована коришћењем трансмисионог електронског микроскопа (ЈЕОЛ, ЈЕМ 1400 Фласх, Јапан) на 80 кВ. Примењена је крио-фаза у методи негативног бојења [53].

3.13.Биолошке студије о МП и МПМЦ

3.13.1.Ин витро антиканцерогена активност

Све ћелијске линије коришћене у овом експерименту су добијене из Америчке колекције типских култура (АТЦЦ, Манассас, ВА, САД). Две људске канцерогене ћелијске линије су коришћене у овом тесту: аденокарцином дојке (МЦФ{{0}}, АТЦЦХТБ-22ТМ) и хепатоцелуларни карцином (ХепГ2, АТЦЦ4 ХБ-8065ТМ). Не-канцерогене ћелијске линије фибробласта коже БЈ-1(АТЦЦ⑧ ЦРЛ-2522ТМ) и МЦФ-12Ф(АТЦЦ ЦРЛ-10782ТМ) епителне дојке су такође тестиране за поређење. Ћелијске линије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом медијуму Еагле (ДМЕМ/висока глукоза, ХиЦлонеТМ, САД) са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС, Гибцо, Бразил), 100 У/мЛ пеницилина, 100 уг/мЛ стрептомицина и 2 мЛ амфотерицина Б (Сигма, Оаквилле, ОН, Канада) и култивисан на 37 степени са 5 процената ЦО, у влажном инкубатору. Подлога за културу је замењена сваки други дан свежом подлогом. Када су ћелије достигле конфлуентност од 70 процената, оне су одвојене коришћењем 0,25 процената Трипсин-ЕДТА(1Кс) Гибцо, Канада, и пребачене у нову боцу за културу. После другог пролаза, ћелије су трипсинизоване и постављене на плочу са 96-бунарићем у концентрацији од 2×10* ћелија/бунарићу. После 24 х инкубације, медијум је декантиран, а ћелије су два пута испране ПБС-ом, а затим третиране са 200 μЛ медијума за културу који садржи различите концентрације узорака протеина (1, 5, 10 и 20 уг/мЛ). Доксорубицин ХЦл (4 уг/мЛ) је коришћен као позитивна контрола, док су ћелије третиране медијумом без додатака узете као негативна контрола. Плоче су инкубиране на 37 степени Ц током 24 х ипротив ракаактивност узорака је одређена коришћењем теста узимања неутралног црвеног према Репетто ет ал. [54]. Укратко, након периода инкубације, медијум је замењен са 150 уЛ неутралне црвене боје (100 мг/мЛ) раствореног у медијуму без серума, а ћелије су инкубиране на 37 степени Ц током 3 х. Затим су ћелије испране ПБС-ом и додато је 150 μЛ медијума за елуирање (ЕтОХ/АцЦООХ,50∶1), а затим лагано мућкање током 10 минута да би се обезбедило потпуно растварање. Апсорпција је мерена на 540 нм помоћу читача микротитарских плоча (БиоТек, 96 Велл Платес, ЕЛКС808, САД).

где је Ац апсорбанца контроле и Ас је апсорбанца узорка. Проценат смрти ћелија представљен као цитотоксичност (проценти) и концентрација која убија 50 процената ћелија (ИЦ50) је израчуната за сваки узорак.

3.13.2. Одређивање нивоа протеина п53, Бак, каспазе-3 и Бцл{5}}

Ћелијски нивои кључних маркера протеина апоптозе одређени су након 24 х након третмана са ИЦсо МП и МПМЦ. Укратко, ћелије Хеп Г-2, МЦФ-7, Бј-1 и МЦФ-12Ф су засејане са 5×10* ћелија/бунарићу у 6-бунарићу плоче. После 24 х инкубације са узорцима на 37 степени, ћелије су сакупљене и лизиране, а затим центрифугиране на 10,000рпм током 20 минута на 4 степена. Концентрација протеина је квантификована у супернатанту Брадфордовим тестом [55]. Активност каспазе-3 је анализирана коришћењем комплета за колориметријски тест (Абцам, аб39401) у складу са упутствима произвођача [56]. Укратко, 10 мг протеина је додато у 50 уЛ Цаспасе супстрата и коначна запремина је подешена на 200 μЛ коришћењем реакционог пуфера на 37 степени, а смеша је инкубирана 1 х у мраку након чега је мерена каспаза{{24} } концентрација на 405 нм.

Ниво про-апоптотичког маркера п53, повезаног Кс(Бак) и анти-апоптотичког маркера Б-ћелијског лимфома-2(Бцл-2) је одређен у ћелијском лизату коришћењем Симпле Степ Ензим-линкед Иммуносорбент Ассаи ЕЛИСА према упутствима произвођача (аб207225, аб119506 и аб199080; Абцам, САД), респективно [57,58].

3.13.3. Оштећење ДНК изазвано заштитом од оксидативног стреса

Тест оштећења ДНК је спроведен како су претходно описали Леба ет ал. [59] са незнатним изменама. Укратко, 3 μЛ плазмида инхибитора рибонуклеазе РНХ1（НМ_203387）Хуман Таггед ОРФ Цлоне 10 уг/μЛ помешано је са Фентоновим реагенсом (5 мМ Х2О2 и 0.3 мМ ФеСО4 и 0,6 мМ ЕДТА）, а коначна запремина је подешена на 25 μЛ коришћењем фосфатног пуфера (Х2ПОА, 8,3 мМ, пХ 7,4). Затим је раствор инкубиран 20 минута на 37 степени. Да би се проценио антиоксидативни заштитни капацитет МП и МПМЦ од оштећења ДНК изазваног Фентоновим реагенсом, 5 уг/мЛ МП/НабМ, МП/ИХМ и МП су додани пре инкубације. РНХ1 плазмидна ДНК (3 μЛ, 10 уг/μЛ) коришћена је као контрола заштите ДНК.

3.13.4. Тест оштећења геномске ДНК заснован на ПЦР-у

Ген за метилентетрахидрофолат редуктазу (МТХФР) хомо сапиенса је амплификован коришћењем ПЦР-а из генома крви који је претходно екстрахован из здравих узорака крви коришћењем стандардног комплета за екстракцију ДНК [60]. ДНК је инкубирана 10 минута са или без Фентоновог реагенса са додатком МП или МПМЦ. Фрагмент 198-бп је амплификован коришћењем прајмера унапред5'-ТГААГГААГГГТГТЦТГЦГГГА-3' и реверзног 5'-АГГАЦГГТГЦГГТГАГАГТГ-3'. Користећи 50 нг третиране ДНК, ПЦР амплификација је спроведена након следећег термоциклера (94 степена у трајању од 5 минута, након чега је уследило 25 циклуса денатурације, 30-их на 94 степена; жарење, 30-их на 60 степени; и екстензија, 30 с на 72 степена) за 25 циклуса и 1 завршни циклус продужења на 72 степена у трајању од 5 минута. Узорци ПЦР реакције су примењени за електрофорезу у агарозном гелу (2 процента).

3.13.5. Профилисање генске експресије помоћу РТ-кПЦР

Анализе генске експресије кључних про- и анти-апоптотичких маркерских гена спроведене су са ХепГ-2, МЦФ-7, Бј-1 и МЦФ-12Ф ћелијама изложеним ИЦ50 добијеним подаци (табела 3) за 72 х. Укратко, укупна РНК је екстрахована коришћењем комплета за пречишћавање укупне РНК (КИАГЕН., Тхоролд, ОН, Канада) према упутствима произвођача. цДНК

синтеза је спроведена како су претходно описали Абоул-Соунд ет ал. [61]. Програми амплификације и специфичност ПЦР ампликона су изведени и процењени коришћењем Ротор-Гене О 5-Плек ХРМ термалног циклуса (Киаген, Немачка) са Куанти-Тецт СИБР-Греен ПЦР комплетом (Киаген, Немачка) као што је претходно документовано пратећи стандардне протоколе [61]. Коришћени су следећи прајмери: Хс_П53_1 СГ КуантиТецт Пример тест (КТ00060235); Хс_ЦАСП3_1_СГ Куан-тиТецт Пример тест (КТ00023947); Б-ћелијски лимфом 2 Хс_БЦЛ2_1_СГ КуантиТецт Пример тест (КТ00025011);Бцл-2-попут протеина Хс_БАКС_1_СГ КуантиТецт Пример тест ( КТ00031192); и 18С рДНК ген за одржавање домаћинства (ХК) Хс_РРН18С_1_СГКуантиТецт Пример тест (КТ00199367). Програм термичког циклуса ПЦР и анализа експресије гена за одређивање промене набора у односу на 18С ген су у суштини изведени као што је претходно објављено [61].

3.14.Статистичка анализа

Добијени резултати су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. Статистика је постигнута коришћењем СПССсофтваре 11.5 (СПСС, Инц.Цхицаго, ИЛ, УСА). Данканов тест вишеструког опсега је коришћен за одређивање значајних разлика међу свим узорцима, а разлике су сматране значајним на п<>

4. Закључци

У закључку, ова студија је открила да мешање млечних протеина саполисахаридикроз диференцијацију раствора пХ је погодна техника за комплексирање. Добијени комплекси слузи млечних протеина (МПМЦ) имају значајно веће фенолне ифлавоноидисадржаја од протеина млека (МП).ДСЦ резултати су показали да комплексирање МП са полисахаридима значајно повећава термичку стабилност са померањем температуре денатурације. Урађене су ФТИР анализе да би се идентификовале функционалне групе, а испитано је и понашање протока припремљених комплекса. ВСИ и ВАИ млечних протеина су повећани комплексирањем са НабМ или ИХМ. ТЕМ је коришћен за визуелизацију микроструктуре припремљених комплекса. С друге стране, очекује се да ће добијени комплекси млечних протеина са слузом исабгол љуске (ХМ) или Набек слузи (НабМ) надмашити природне млечне протеине у антиоксидативном и антиканцерогеном ефекту. Укратко, МПМЦ је показао јединствена својства против рака против модела рака дојке и ћелијских линија карцинома јетре (МЦФ7 и ХЕПГ2, респективно), што је доказано тестом неутралног узимања црвене боје.

МПМЦ је побољшао обаантиоксиданси активност против пролиферације. Каспазе су кључни регулаторни протеини који су укључени у индукцију апоптозе. Повећање регулације протеина каспазе 3 и транскрипта мРНА (слика 9А, Б) контролише друге протеине на путу апоптозе, који се карактерише колапсом митохондријалне мембране са Бак-индукованим ослобађањем цитохрома ц и активацијом каспазе 9 што доводи до накнадног ангажовања каспаза 3. Уп-регулација Цасп3, п53 и Бак, заједно са смањењем експресије Бцл-2, открила је да МПМЦ индукована индукција апоптозе, где ће појачана регулација п53 стимулисати експресију Бак-а, што ће заузврат индуковати цитохром ц ослобађање, након чега следи каспаза-9 и-3 активација. Штавише, познато је да Бцл-2 инхибира ослобађање цитохрома ц. У нашој студији, показало се да регулација Бцл-2 изазвана МПМЦ-ом олакшава ослобађање цитокрома ц без отпора изазвано Баком и каснију апоптозу.

Антиканцерогено дејство протеинско-полисахаридних комплекса пружа даље просветљење применљивости ових комплекса за употребу у развоју приступачних и ефикасних терапија рака са минималним нежељеним ефектима.