Неуропротективни ефекти и механизми процијанидина ин витро и ин виво, 2. део

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

3. Дискусија

Бројне студије су показале да рачунари испољавају снажне активности уклањања радикала и антиоксиданата ]25-27И, и да оксидативни стрес изазван прекомерном производњом РОС и/или оштећењем антиоксидативног одбрамбеног система игра кључну улогу у неуродегенеративним болестима [ -6,28,29]. Међутим, неуропротективни ефекти и механизми ПЦ-а у вези са оксидативним оштећењем су још увек нејасни. Стога је ова студија истраживала ефекте и механизме ПЦ рачунара у неуропротекцији.

Кликните овде да бисте сазнали више

У овој студији, одговарајуће концентрације ПЦ-а су побољшале нивое антиоксидативних ензима, укључујући ГСХ-Пк, ЦАТ и СОД, али су смањиле нивое РОС и МДА у моделима оксидативног оштећења у поређењу са мерењима користећи само Х, О. Ови садашњи налази били су у складу са претходним студијама које су сугерисале да додатак са ниским садржајем ПЦ-а путем исхране може побољшати активности ГСХ-Пк, ЦАТ и СОД код одбијених прасади [30]. Друга студија је такође сугерисала да рачунари значајно повећавају ЦАТ и СОД активности и смањују садржај МДА, чиме се побољшава квалитет козје сперме [31].

Цистанцхе може побољшати имунитет

Нрф2/АРЕ пут је значајан антиоксидативни пут [32-34]. Нормално, Нрф2 се налази у цитоплазми, где је везан за инхибиторни протеин, Кеап135,36]. Након стимулације Х2О2, Нрф2 се дисоцира од Кеап1, покреће ендогени антиоксидативни одбрамбени систем, а затим се транслоцира у језгро [34,37,38]. Затим ступа у интеракцију са АРЕ да би активирао низ гена за заштиту ћелија и антиоксиданса, укључујући ГЦЛЦ, ГЦЛМ, НОО1 и ХО-139,40]. Као одговор на оксидативни стрес, слично променама које се виде током стимулације Х-О2, Нрф2 се дисоцира од Кеап1 у цитосолу и затим се транслоцира у језгро, везујући се за АРЕ секвенцу да би активирао транскрипцију криопротективних гена [41,42]. Приметили смо да су одговарајуће концентрације ПЦ-а олакшале нуклеарну локализацију Нрф2 под условима Х, О2- лезије у ПЦ12 ћелијама. Штавише, одговарајуће концентрације ПЦ-ја су значајно повећале нивое експресије НОО1, ХО-1, ГЦЛМ и ГЦЛЦ, од којих сви могу директно деловати на елиминацију слободних радикала и оксидативних молекула [43]. Дакле, ови резултати су показали да су одговарајуће концентрације ПЦ-а повећале нивое Нрф2/АРЕ пута. Затим, утишавање гена Нфр2 преко Нрф2 сиРНА је коришћено за даљу процену улоге активације Нрф2/АРЕ у неуропротекцији посредованој ПЦ-јем против оксидативног оштећења изазваног Х, О2-. Ћелије трансфициране Нрф2-сиРНА су показале значајно смањење експресије Нрф2. Истовремено, открили смо да је нокаут Нрф2 укинуо заштиту посредовану ПЦ-јем од оштећења виталности ћелија третираних Х2О, а Нрф2 нокаут је такође укинуо антиоксидативне ефекте ПЦ-а. Ови налази су у складу са претходном студијом која је сугерисала да побољшање активације Нрф2/АРЕ пута доприноси неуропротекцији [44]. Стога, садашњи резултати показују да пут Нрф2/АРЕ може представљати фармаколошку мету ПЦ за превенцију неуродегенерације.

4. Материјали и методе 4.1. Хемикалије и реагенси

Х2О2 је купљен од ХУСХИ (ХУСХИ, Шангај, Кина). ЦЦК-8, НАЦ је купљен од Беиотиме (Беиотиме, Шангај, Кина). ПЦс,2',7/-дихлорофлуоресцеин диацетат, МДА, ГСХ-Пк, СОД дијагностички комплети и ЦАТ дијагностички комплети су купљени од Соларбио (Соларбио, Пекинг, Кина).РНАи Плус, ПримеСцрипт РТ комплет реагенса са гДНК Ерасер и СИБР Премик Ек Таг ИИ су купљени од Такаре (Такара, Схига, Јапан). Нрф2-сиРНА, цонтрол-сиРНА и липофецтамине 2000 су добијени од ГенеПхарма (ГенеПхарма, Шангај, Кина). Следећа примарна антитела и одговарајућа секундарна антитела су добијена од Протеинтецх-а (Протеинтецх, Вухан, Кина): Нрф2, ХО-1, ГЦЛЦ, ГЦЛМ, НАД(П)Х: НКО1, ламин Б и ГАПДХ.

4.2. Ћелијска култура

ПЦ12 ћелије су добијене из Националне колекције провјерених ћелијских култура. Ћелије су одржаване у медијуму ДМЕМ са додатком 10 процената феталног говеђег серума и пеницилин-стрептомицина (100 У/мЛ; 100 уг/мЛ) у влажном инкубатору на 37 степени са 5 процената ЦО2.

4.3. Тестови виталности ћелија

ПЦ12 ћелије су засејане у 96- плоче са бунарима при густини од 1×104 ћелија/бунарићу. Ћелије су биле изложене различитим концентрацијама ПЦс или НАЦ (20 μМ) током 24 х, након чега су инкубиране са 200 μМ Х2О2, током 24 х. Затим је у сваки бунар додато 10 μЛоф ЦЦК-8 раствора и инкубирано 1 х, након чега је мерена апсорпција на 450 нм.

4.4. Одржавање рибе

Етичко одобрење за употребу животиња дао је Комитет за очување и употребу животиња Центра за експерименталне животиње на Универзитету Зхејианг (ЗЈУ20200125). Одрасле зебрице (Данио рерио, АБ сој) су добијене из центра за лабораторијске животиње Универзитета Зхејианг и одржаване на 28±1Ц у циклусу од 14/10-х светло/мрак [21Ј. Рибе су храњене Артемиа науплии два пута дневно. Да би се произвели ембриони, одрасле зебрице су стављене преко ноћи у резервоаре за размножавање у односу 1: 1, мужјак: женка. Мрешћење је покренуто у року од 2 сата након што су светла укључена следећег јутра. Ембриони су узгајани у ембрионској води на 28 степени [45].

4.5. РОС Меасурементс

Да би се измерила производња РОС ин виво, ларве зебрице (АБ сој), 3 дана након оплодње (пдф) биле су изложене НАЦ (30 μМ) или различитим концентрацијама ПЦ у одсуству или присуству 300 μМ Х,О, током 4 дана. Након тога, на 7 пдф, различите групе за третман су пребачене у 24- плочу (10 ларви зебрице по групи) третирану са 20 уМ раствора 2',7'-дихлорофлуоресцеин диацетата и инкубиране су 60 минута у мрак на 28,5 степени Ц[46]. Затим су ларве три пута испране ембрионским медијумом да би се уклонио вишак 2'7'-дихлорофлуоресцеин диацетата. Обојене ларве су затим посматране и снимљене под Олимпус ласерским конфокалним микроскопом. Интензитет флуоресценције сваке појединачне ларве је квантификован преко Имаге] софтвера.

Да би се измерила производња РОС-а ин витро, ПЦ12 ћелије су засејане у 6- плоче са бунарима при густини од 2×10* ћелија/бунарићу. Ћелије су биле изложене различитим концентрацијама ПЦс или НАЦ (20 уМ) током 24 х, а затим су инкубиране са 200 уМ Х2О, током 24 х. Ћелије су инкубиране са 10 μМ раствора 2',7'-дихлорофлуоресцеин диацетата у мраку 30 мин; након тога, раствор боје је уклоњен, а ћелије су испране три пута у физиолошком раствору пуферованом фосфатом. Ћелије су затим посматране и снимљене под Олимпус ласерским скенирајућим конфокалним микроскопом. Интензитет флуоресценције ћелија је квантификован преко Имаге] софтвера.

4.6. Процена МДА, ГСХ-Пк, СОД и ЦАТ

Ларве зебрице (АБ сој) ат3 пдф биле су изложене НАЦ-у (30 μМ) или различитим концентрацијама ПЦ-а у одсуству или присуству 300 уМ Х2О, током 4 дана. Зебрице од 7 дпф су анестезиране тетракаином и хомогенизоване након еутаназије на леду. МДА, ГСХ-Пк, ЦАТ и СОД су анализирани истовремено, према упутствима произвођача. Сваки експеримент је садржао 20 ларви, а сваки измерени индекс је поновљен у три примерка.

ПЦ12 ћелије су засејане у 6- плоче са бунарима при густини од 2×10* ћелија/бунарићу. Ћелије су биле изложене различитим концентрацијама ПЦс или НАЦ (20 уМ) током 24 х, а затим су инкубиране са 200 уМ Х2О, током 24 х. ПЦ12 ћелије су затим сакупљене и инкубиране са пуфером за лизу. Активности МДА, ГСХ-Пк, СОД и ЦАТ мерене су коришћењем одговарајућих комплета за анализу, према протоколима сваког произвођача. Сваки измерени индекс је поновљен у три примерка.

4.7. Укупна екстракција РНК, реверзна транскрипција и квантитативна ланчана реакција полимеразе у реалном времену

Ларве зебрице (АБ сој) на 3 дпф биле су изложене НАЦ (30 μМ) или различитим концентрацијама ПЦс у одсуству или присуству 300 уМ Х, О, током 4 дана. Након третмана, РНК је екстрахована коришћењем РНАисо, пратећи упутства произвођача. РНК је реверзно транскрибована коришћењем ПримеСцрипт РТ комплета са гДНК гумицом, пратећи упутства произвођача (Такара, Схига, Јапан). Квантитативни ПЦР у реалном времену је изведен са Апплиед Биосистемс Ви-7 ПЦР системом у реалном времену користећи СИБР Премик Ек ТакИИ -актин је коришћен као референтни ген, а релативна експресија гена је израчуната коришћењем 2-ААЦт методом. Коришћене секвенце прајмера наведене су у табели 1.

4.8. Трансфекција Нрф2 сиРНА

Нрф2-сиРНА је коришћена за обарање Нрф2. ПЦ12 ћелије су засејане у 6-плоче за културу бунара и затим су трансфектоване са Нрф2-сиРНА (80 нМ) или контролном сиРНК коришћењем Липофецтамине 2000, према упутствима произвођача.

4.9. Припрема целоћелијског, цитоплазматског и нуклеарног протеина

За екстракцију протеина целе ћелије, ћелије су сакупљене и инкубиране са РИПА пуфером за лизу који садржи 1 проценат ПМСФ и 1 проценат коктела инхибитора протеазе током 30 минута на леду. Ћелијски лизати су центрифугирани, а супернатант је сакупљен и ускладиштен. За припрему субцелуларног фракционисања, узорци ћелија су обрађени коришћењем комплета за екстракцију нуклеарног и цитоплазматског протеина. Садржај протеина је испитан коришћењем БЦА теста. 4.10.Вестерн блоттинг

Аликвоти протеина су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и пребачени на поливинилиден-дифлуоридне мембране. Мрље су затим инкубиране са следећим примарним антителима: Нрф2, Кеапл, ХО-1, НКО1, ГЦЛЦ, ГЦЛМ, Ламин Б или ГАПДХ. Мембрана је затим испрана ТБСТ током 5 минута; ово је поновљено 5 пута. Након тога, мрље су инкубиране у секундарним антителима коњугованим са пероксидазом. Коначно, протеинске траке су визуелизоване коришћењем ЕЦЛ-плус Вестерн блоттинг реагенса за детекцију.

4.11. Тест локомоторног понашања

Ларве зебрице (АБ сој) на 3 пдф-а биле су изложене НАЦ (30 μМ) или различитим концентрацијама ПЦ-а у одсуству или присуству 300 μМ Х О, током 4 дана. Након тога, на 7 пдф-а, ове третиране ларве су постављене у 24-плоче (једна риба по бунарчићу и 12 ларви по групи). Користили смо Ани-мазе 4.73 за мерење локомоторног понашања ларви зебрице и израчунали укупну пређену удаљеност за 10 минута [47].

4.12.Статистичка анализа

Подаци су приказани као средња вредност ± стандардна девијација (СД) најмање три независна експеримента. Једносмерна анализа варијансе (АНОВА) и Данканови тестови вишеструких опсега коришћени су за одређивање статистичке значајности, а разлике су сматране значајним када је п<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Закључци

У закључку, садашњи налази указују на то да ПЦ-ови испољавају неуропротективне ефекте путем активације Нрф2/АРЕ пута и његових низводних ензима за детоксикацију и антиоксидативних ензима. Узети заједно, рачунари могу имати заштитни ефекат на неуродегенеративне поремећаје.

Доприноси аутора:Концептуализација, ЈЦандЈЗ. (Јиајин Зху); методологија, ЈЦ; софтвер, ИЦ; валидација, ИЗ., ЈЗ(Јиавен Зхао) и ХИ; формална анализа, ЈЦ; истрага, ИЦ; ресурси, ЈЗ(иајин Зху); дата цуратион, ЈЦ; писање—припрема оригиналног нацрта, ЈЦ; писање—преглед и уређивање, ЈЗ.(иајин Зху); визуализација, ЈЦ; надзор, ДЛ; администрација пројекта, ЈЗ(Јиајин Зху); аквизиција финансирања, ЈЗ (Јиајин Зху). Сви аутори су прочитали и сложили се са објављеном верзијом рукописа.

Финансирање:Ово истраживање није добило спољно финансирање.

Изјава институционалног одбора за ревизију:Студија је спроведена у складу са смерницама Хелсиншке декларације, а одобрила ју је Етичка комисија Комитета за очување и употребу животиња Центра за експерименталне животиње на Универзитету Џеђианг (ЗЈУ20200125). Изјава о информисаној сагласности: Није применљиво.

Изјава о доступности података:Подаци су садржани у чланку. Сукоб интереса: Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Доступност узорка: Узорци једињења нису доступни од аутора.

Овај чланак је извучен из Молецулес 2021, 26, 2963. хттпс://дои.орг/10.3390/молецулес26102963 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/молецулес