Неуропротективни ефекти и механизми процијанидина ин витро и ин виво, део 1

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан:Ова студија је процениланеуропротективниефекти и механизми процијанидина (ПЦ). Ин витро, ћелије феохромоцитома пацова (ПЦ12 ћелије) биле су изложене ПЦс (1,2 или 4 уг/мЛ) или Н-ацетил-Л-цистеин (НАЦ) (20 μМ) током 24 сата, а затим инкубиране са 200 μМ Х, О, 24 х. У поређењу са самим Х2О2, ПЦ-ови су значајно повећали антиоксидативне активности (нпр. глутатион пероксидаза (ГСХ-Пк), супероксид дисмутаза (СОД), каталаза (ЦАТ), смањен ниво реактивних врста кисеоника (РОС) и малондиалдехида (МДА) и повећан нуклеарни фактор-еритроид 2-акумулација фактора 2(Нрф2) и повећана експресија кинон оксидоредуктазе 1(НКО1), хем оксигеназе 1 (ХО-1), подјединице модификатора глутамат-цистеин лигазе (ГЦЛМ) и каталитичка подјединица глутамат-цистеин лигазе (ГЦЛЦ). Ин виво, ларве зебрице (АБ сој) 3 дана након оплодње (пдф) биле су изложене НАЦ (30 уМ) или ПЦс (4, 8 или 16 уг/мЛ) у одсуству или присуство 300 μМ Х, О, током 4 дана. У поређењу са само Х, О, рачунари побољшаниантиоксидансактивности (нпр. ГСХ-Пк, ЦАТ и СОД), смањени нивои РОС и МДА, и побољшана активација Нрф2/ антиоксидативних елемената одговора (АРЕ) и повећани нивои експресије НКО1, ХО-1, ГЦЛМ и ГЦЛЦ .У закључку, ови резултати су показали да ПЦ-и испољавају неуропротективне ефекте путем активације Нрф2/АРЕ пута и ублажавања оксидативног оштећења.

Кључне речи:процијанидини; неуропротективни; зебрафисх; ПЦ12 ћелије; Нрф2/АРЕ пут

Кликните овде да бисте сазнали више

1. Представљање

Неуродегенеративна болест се односи на спору и постепену дегенерацијунеуронау људском мозгу, што доводи до разних моторичких и/или когнитивних проблема и на крају доводи до смрти неурона[1]. Са повећањем броја старијих особа, стопа инциденције сенилних неуродегенеративних болести убрзано расте [2,3]. Иако су основни механизми неуродегенерације још увек нејасни, значајни докази показују да оксидативни стрес изазван прекомерном производњом реактивних врста кисеоника (РОС) и/или оштећењем антиоксидативног одбрамбеног система игра кључну улогу у овим болестима [4-6]. У процесу неуродегенерације, постоји неравнотежа између производње интрацелуларних РОС и способности антиоксидативног одбрамбеног система да очисти РОС и/или поправи оштећења посредована РОС 7]И. Прекомерна производња РОС-а доводи до макромолекуларног оштећења. Дакле, акумулација ћелијског макромолекуларног оштећења доводи до некрозе [8,9. Сходно томе, додатак антиоксидансима за уклањање вишка РОС може помоћи у превенцији неуродегенеративних болести. Природна биоактивна једињења су безбедна са мало или без нежељених ефеката. Стога се све већа пажња посвећује откривању антиоксидативних једињења из природних ресурса.

Цистанцхе може побољшати имунитет

Процијанидини (ПЦ) су природна фенолна једињења флавоноида и садрже олигомере мономера катехин иепикатехин[10-12]. ПЦ су природни хранљиви састојци и антиоксиданси, а њихови антиоксидативни ефекти су јачи од оних витамина Ц и витамина Е [13]

Међутим, неуропротективни ефекти и механизам ПЦ-а у погледу оксидативног оштећења ин виво и ин витро остају нејасни.

Зебрафисх су слатководне тропске ципринидне рибе ограничене на Индију. Занимљиво је да је отприлике 87 процената гена повезаних са људским болестима повезано са хомологним генима код зебрица [14]. У односу на експерименталне моделе миша, коришћење зебрице као модела система је повезано са краћим експерименталним периодима, смањеним трошковима и приступачнијим генским манипулацијама[15]. У смислу ин витро модела, пацовфеохромоцитомћелије (ПЦ12 ћелије) су сличне неуронима у погледу морфологије, структуре и функције [16]. Њихове карактеристике су веома конзистентне са карактеристикама примарно култивисаних неурона и имају експерименталне предности у смислу лаког и стабилног одржавања у култури [17]. Штавише, ПЦ12 ћелије су широко коришћене као ин витро модели за проучавање нервних ћелија [18-20]. Водоник-пероксид (Х, О2) је тип РОС који може да продре кроз ћелијске мембране и да изазове оксидативни стрес [21]. Бројни извештаји су показали да се ХО може користити за успостављање модела оксидативног стреса [22-24]. У овој студији, проценили смо неуропротективне ефекте и механизме ПЦ-ја у ПЦ12 ћелијама и зебри.

2. Резултати

2.1.Ефекти рачунара на оштећење ПЦ12 ћелија третирано Х2О2-

ПЦ12 ћелије су биле изложене 200 μМ Х, О током 24 сата, а виталност ћелија је смањена на 56,5 процената (Слика ла). Предтретман ћелија само са ПЦ-има при 1,2 или 4 уг/мЛ није имао утицаја на виталност ћелије, док је третман ПЦ-а од 1,2 и 4 уг/мЛ значајно заштитио ПЦ12 ћелије од Х2О2-третиране цитотоксичности побољшањем виталност ћелије (слика 1б,ц,стр<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">

2.2.Ефекти рачунара на оксидативни стрес ПЦ12 ћелија третираних са Х2О2

Нивои РОС и малондиалдехида (МДА) указују на озбиљност оксидативног оштећења. ПЦ12 ћелије изложене 200 μМ Х2О2 током 24 сата подигле су нивое РОС и МДА, а предтретман ПЦ од 2 и 4 уг/мЛ инхибирао је нивое РОС и МДА (Слика 2а-ц, п<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">глутатионактивности пероксидазе (ГСХ-Пк), каталазе (ЦАТ) и супероксид дисмутазе (СОД), и приметио да третман Х, О потискује активности ГСХ-Пк, ЦАТ и СОД. Међутим, ефекти изазвани Х2О2- су спасени претходним третманом са рачунарима при 2 и 4 уг/мЛ (слика 2д-ф,п<0.05 versus="" h2o2-treated="">

2.3.Ефекти рачунара на нуклеарни фактор-еритроид 2-повезани фактор 2(Нрф2)/АРЕ пут у Х2О2-третираним ПЦ12 ћелијама

Открили смо да је ниво Нрф2 повећан и да је експресија Кеапл смањена након претходног третмана ПЦ (2 и 4 уг/мЛ) пре третмана са ХО, у поређењу са овим нивоима у групи изазваној ХО (Слика 3а-ц ,п<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore,="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Слика 3. Ефекти ПЦ-ова на Нрф2/АРЕ пут у ћелијама ПЦ12 третираним Х, О2-. (а) Нивои протеина Нрф2 и Кеап1, утврђени Вестерн блот-ом; (б) релативна експресија Нрф2/ГАПДХ протеина (однос према контроли); (ц) Кеап1/ГАПДХ релативна експресија протеина (однос према контроли); (д) нивои експресије протеина нуклеарног Нрф2 и цитоплазматског Нрф2, као што је одређено Вестерн блоттингом; (е) релативна експресија нуклеарног Нрф2/ЛаминБ протеина (однос према контроли); (ф) релативна експресија протеина Нрф2/ГАПДХ у цитоплазми (однос према контроли); (г) нивои протеина ХО-1, НОО1, каталитичке подјединице глутамат-цистеин лигазе (ГЦЛЦ) и ГЦЛМ, као што је утврђено Вестерн блотингом; (х) ХО-1/ГАПДХ релативна експресија протеина (однос према контроли); (и) релативна експресија протеина НКО1/ГАПДХ (однос према контроли); (ј) релативна експресија ГЦЛЦ/ГАПДХ протеина (однос према контроли); (к) Релативна експресија ГЦЛМ/ГАПДХ протеина (однос према контроли). Подаци су изражени као средња вредност ± СД. Сви експерименти су спроведени три пута. Вредности са различитим словима изнад се значајно разликују (стр<0.05, one-way="">

2.4. Нрф2/АРЕ сигнализација је одговорна за антиоксидативне ефекте посредоване рачунарима

Као што је приказано на слици 4а, б, Нрф2 сиРНА је инхибирала експресију Нрф2. У међувремену, третман Нрф2 сиРНА елиминисао је заштитне ефекте ПЦ-ја против оксидативног оштећења третираног Х2О2-, што је доказано смањеном вијабилношћу ћелија у групи трансфицираној Нрф2-сиРНА (Слика 4ц). Истовремено, дејства ПЦ-ја на садржај МДА и активност СОД су преокренута Нрф2 нокдауном у условима Х2О2-лезије (слика 4д,е).

Слика 4. Нрф2/АРЕ сигнализација је одговорна за ПЦ-посредована антиоксидативна дејства у ПЦ12 ћелијама третираним Х2О2-.(а) Ефикасност нокаутирања је откривена одређивањем експресије Нрф2 протеина применом Вестерн блоттинг-а;(б)Нрф2/ Релативна експресија ГАПДХ протеина (однос према контроли); (ц) виталност ћелије; (д) нивои МДА; (е) активност СОД. Подаци су изражени као средња вредност± СД. Сви експерименти су спроведени три пута. Вредности са различитим словима изнад се значајно разликују, (стр<0.05, **p="" <="" 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">

2.5.Ефекти рачунара на покретљивост ларви Зебрафисх након третмана Х2О2

Оксидативно оштећење изазвано Х2О2-смањило је укупну удаљеност пливања ларви зебрице. Третман рачунарима (4, 8 и 16 уг/мЛ) је спасио Х2О2-индуковане локомоторне дефиците, о чему сведочи повећана удаљеност кретања у односу на Х2О2 групу (Слика 5а,б,п<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">

Слика 5. Ефекти ПЦ-а на покретљивост ларви зебрице третираних Х2О2-. (а) Типични обрасци трагова пливања ларви зебрице у свакој групи; (б) просечна укупна удаљеност ларви цебрице у свакој групи. Подаци су приказани као средња вредност ± СД. Сви експерименти су поновљени три пута. Вредности са различитим словима изнад се значајно разликују (стр<0.05, one-way="">

2.6.Ефекти рачунара на оксидативни стрес ларви зебрајиша третираних са Х2О2

Третман ПЦ (4,8 и 16 уг/мЛ) на ларве зебрице смањио је повећање интрацелуларног формирања РОС изазвано Х2О2- (Слика 6а,б, п<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally,="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e,f,p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Слика 6. Ефекти ПЦ-а на оксидативни стрес у ларви зебрице третираних Х2О2-. (а) Репрезентативне флуоресцентне фотомикрографије ларви зебрице; (б) Нивои РОС су мерени помоћу софтвера за снимање; (ц) нивои МДА; (д) активност ГСХ-Пк; (е) ЦАТ активност; (ф) активност СОД. Подаци су изражени као средња вредност ± СД. Сви експерименти су спроведени три пута. Вредности са различитим словима изнад се значајно разликују (п < 0.05,="" једносмерна="">

2.7.Ефекти рачунара на Нрф2/АРЕ путеве у Х2О2-третираним Зебрафисх Лароае

Заштитни ефекти третмана ПЦ-а у ларвама зебрице третираних Х2О2- сугеришу да су можда били укључени путеви Нрф2/АРЕ. Нивои експресије Нрф2, ХО-1, НКО1, ГЦЛЦ и ГЦЛМ (Слика 7а-е,п<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">

Figure 7. Effects of PCs on the Nrf2/ARE pathway in H>О, третиране ларве зебрице. (а) нивои Нрф2; (б) нивои ГЦЛЦ; (ц) нивои ГЦЛМ; (д) нивои ХО-1; (е) нивои НКО1. Подаци су изражени као средња вредност ± СД. Вредности са различитим словима изнад се значајно разликују (стр<0.05, one-way="" anova="">

Овај чланак је извучен из Молецулес 2021, 26, 2963. хттпс://дои.орг/10.3390/молецулес26102963 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/молецулес