Неуропротективни потенцијал изотиоцијаната у ин витро моделу неуроинфамације

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Тизиана Латроницо1 · Марилена Лароцца2 · Серафна Милелла1 · Анна Фасано1 · Роццо Россано2 · Гразиа Мариа Лиуззи1

Примљено: 10. јула 2020. / Прихваћено: 25. октобра 2020. / Објављено на мрежи: 16. новембра 2020.

© Аутор(и) 2020

Функција биљног праха Цистанцхе: има веома добарнеуропротективни ефекат

Апстрактан

Изотиоцијанати (ИТЦ), присутни као прекурсори глукозинолата у поврћу крсташа, показали суантиинфламаторно, антиоксидативно и антиканцерогено деловање. Овде смо упоредили ефекте три различита ИТЦ на производњу РОС и на експресију матрикс металопротеиназе (ММП)-2 и -9, који представљају важне патогенетске факторе различитих неуролошких болести. Примарне културе астроцита пацова су активиране ЛПС-ом и истовремено третиране различитим дозама алил изотиоцијаната (АИТЦ), 2-фенетил изотиоцијаната (ПЕИТЦ) и 2-сулфорафана (СФН). Резултати су показали да су СФН и ПЕИТЦ били у стању да се супротставе производњи РОС изазваној Х2О2. Зимографска анализа супернатаната ћелијске културе показала је да су ПЕИТЦ и СФН најефикаснији инхибитори ММП-9, док је само СФН значајно инхибирао ММП-2 активност. ПЦР анализа је показала да су сви коришћени ИТЦ значајно инхибирали експресију и ММП-2 и ММП-9. Истраживање сигналног пута протеин киназе активиране митогеном (МАПК) показало је да ИТЦ модулирају транскрипцију ММП инхибирајући активност екстрацелуларно регулисане протеин киназе (ЕРК). Резултати ове студије сугеришу да би ИТЦ могли бити обећавајући нутрацеутски агенси за превенцију и комплементарни третман неуролошких болести повезаних са укљученошћу ММП.

Кључне речиАнтиоксиданс · Анти-инфламаторно · Изотиоцијанат · Матрикс металопротеиназе · Неуродегенеративне болести

Увод

Неуроинфламација је сложен одговор на повреду мозга који укључује каскаду биохемијских догађаја који доводе до активације резидентних ћелија централног нервног система (ЦНС). Аберантна активација астроцита угрожава њихову неуропротективну улогу што доводи до ослобађања медијатора упале, као што су реактивне врсте кисеоника (РОС), азот оксид (НО), цитокини, хемокини и матрикс металопротеиназе

(ММП).

ММП су велика породица неутралних ендопептидаза зависних од Зн2 плус које имају као главне мете компоненте екстрацелуларног матрикса (ЕЦМ) као што су фибронектин, колаген, еластин и ламинин (Латроницо и Лиуззи 2017).

Тизиана Латроницо

tiziana.latronico@uniba.it

Одељење за бионауке, биотехнологију и биофармацеутику, Универзитет у Барију "Алдо Моро",

Бари, Италија

Одељење за науке, Универзитет Базиликата, Потенза,

Италија

У ЦНС-у, ММП су укључени у различите физиолошке одговоре, као што су морфогенеза, преокрет и ремоделирање ЕЦМ, ембриогенеза и поправка рана; међутим, када ММП побегну од регулаторних механизама, они постају штетни (Росенберг 2009; Агравал ет ал. 2008).

У том погледу, познато је да су промене у експресији и активности ММП кључни патогенетски догађаји у неколико неуролошких поремећаја (Латроницо и Лиуззи 2017; Мастроианни и Лиуззи 2007; Бркић ет ал. 2015). Експериментални докази сугеришу да су међу ММП, желатиназе А (ММП-2) и Б (ММП-9) посебно укључене у неуроинфламацију јер њихова регулација може да угрози интегритет крвно-мождане баријере (БББ). Ово доводи до повећаног регрутовања и инфилтрације имуних ћелија периферне крви у мождани паренхим, настављајући инфламаторни процес који је узрок прогресивног губитка неурона и поремећене неуронске функције (Ривест 2009). Неколико ин витро и ин виво студија показало је да је производња РОС један од фактора укључених у појачану регулацију експресије ММП-9 у можданим ћелијама путем механизама зависних од сигналног пута протеин киназе активиране митогеном (МАПК) (Хсиех и Јанг 2013).

На основу ових доказа, јасно је да смањење неуротоксичних фактора, што доводи до смањених неуроинфламаторних одговора, може представљати ефикасну терапијску стратегију за спречавање почетка или ублажавање прогресије болести мозга.

Последњих година, биомедицински интерес у неуролошкој области је све више фокусиран на истраживање природних једињења способних да модулишу процесе повезане са неуроинфламаторним одговорима. У том погледу, неколико студија је показало да фитокемијска једињења, као што су полифеноли, изотиоцијанати (ИТЦ) и други, имају неуропротективни потенцијал који такође произилази из њихове способности да инхибирају експресију ММП и да се супротставе производњи РОС (Динкова-Костова и Костов 2012; Лиуззи ет ал. 2007, 2011).

Изотиоцијанати су метаболити које производи неколико биљака које припадају породици Брассицацеае као систем одбране од напада патогена (Бонес и Росситер 2006). Они потичу од ензимске деградације глукозинолата (ГСЛ) ензимом мирозиназом. ИТЦ су присутни у обично конзумираном поврћу крсташа као што су броколи, прокулице, купус, репа, рен, келераба, сенф, ротквица, поточарка и кељ. Њихове количине у храни су веома променљиве и зависе од обраде и припреме хране.

Недавно се показало да ИТЦ поседују различите терапеутске ефекте, укључујући антиоксидативно, антибактеријско, антиинфламаторно и хемопревентивно дејство (Дуфоур ет ал. 2015; Марзоццо ет ал. 2015).

Заштитна активност ИТЦ-а се спроводи кроз модулацију различитих сигналних путева укључених у детоксикацију, упалу, апоптозу и регулацију ћелијског циклуса. Неколико доказа указује на то да се антиканцерогена и антиинфламаторна својства ИТЦ-а углавном могу приписати њиховој способности да активирају пут фактора 2 (Нрф2) повезан са нуклеарним фактором 2-. Нрф2 је транскрипциони фактор осетљив на редокс који се у присуству електрофилних агенаса и услова оксидативног стреса транслоцира у језгро где везује елементе антиоксидативног одговора (АРЕ), изазивајући експресију цитопротективних гена укључених у детоксикацију и модулацију оксидативних стања и инфламаторни процеси (Хеисс ет ал 2001). У том смислу, објављено је да су ИТЦ у стању да повећају антиоксидативни капацитет људских ћелија индукујући експресију ензима за детоксикацију фазе ИИ и повећањем производње ГСХ (Вагнер ет ал 2010). Штавише, пријављено је постојање унакрсног разговора између Нрф2 и пута нуклеарног фактора (НФ)-κБ који резултира модулацијом упале (Стурм и Вагнер 2017; Лее и Јохнсон 2004). У том погледу, различити експериментални ин витро и ин виво модели неуроинфламације су показали да су ИТЦ у стању да значајно смање транслокацију НФ-κБ са последичном инхибицијом проинфламаторних цитокина и ММП (Лее ет ал. 2015; Субеди ет ал. 2017).

У овом раду смо истраживали утицај три ИТЦ-а, тј. Алил изотиоцијаната (АИТЦ), 2- Фенетил изотиоцијаната (ПЕИТЦ) и 2- Сулфорафана (СФН) на ослобађање ММП-2 и -9, као и на производњу РОС-а од стране ЛПС-активираних астроцита. Наши резултати су показали да ПЕИТЦ, СФН и АИТЦ могу инхибирати ин витро експресију ММП-9 и ММП-2 у ЛПС-активираним астроцитима и да се супротставе производњи РОС изазваној Х2О2. Поред тога, показали смо да ИТЦ модулирају прекомерну експресију ММП са механизмима повезаним са инхибицијом активности екстрацелуларно регулисане протеин киназе (ЕРК). Ови резултати сугеришу да исхрана богата поврћем Цруцифероус може имати потенцијалне користи за превенцију и комплементарно лечење неуролошких болести.

материјали и методе

Хемикалије и реагенси

Дулбеццо-ов модификовани Орлов медијум (ДМЕМ), фетални говеђи серум (ФБС), пеницилин и стрептомицин обезбедио је ГИБЦО (Паислеи, Шкотска). Желатин, ДНаза 1, поли-Л-лизин

(ПЛЛ), трипсин, липополисахарид (ЛПС), Трипан Блуе и 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенилтетразолијум бромид (МТТ ), алил изотиоцијанат (АИТЦ) [цод. 377,430, чистоћа 95 процената (ХПЛЦ)], 2-фенетил изотиоцијанат (ПЕИТЦ) [цод. 253,731, чистоћа 99 процената )], 2-Сулфорафан (СФН) [цод. С6317, чистоћа већа или једнака 95 процената (ХПЛЦ)] су обезбеђени од Сигме (Сент Луис, МО, САД). 2′,7′-дихлорофлуоресцеин диацетат (ДЦФХ-ДА) је купљен од Цалбиоцхем-а. Стандардни протеини и Р-250 Цоомассие Бриллиант Блуе су из Био-Рад (Херцулес, ЦА, УСА). Анти-глијална фибриларна кисела протеина (ГФАП) антитела (РРИД: АБ_2294571) купљена су од Серотец-а (Окфорд, УК). Антитела против екстрацелуларно регулисаних протеин киназа (ЕРК) 1/2 и фосфорилисаног ЕРК 1/2 (п-ЕРК 1/2) су из Санта Цруз Биотецхнологи (Санта Круз, Калифорнија). Хибонд-П ПВДФ мембране, систем за Вестерн Блоттинг анализу побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ) и секундарно антитело против миша-ХРП су из ГЕ

Здравствене науке о животу (Литтле Цхалфонт, Бацкингхамсхире,

Уједињено Краљевство). Парови прајмера специфични за ММП-2, ММП-9 и 18С рРНА су из Сигма Геносис (Цамбс, УК). РНеаси мини комплет и КуантиТецт комплет за реверзну транскрипцију купљени су од компаније Киаген (Валенсија, Калифорнија, САД). Ецоно-Так ПЛУС ГРЕЕН 2Кс Мастер Мик реагенси за ПЦР су купљени од Луциген Цорпоратион (Миддлетон, ВИ, САД).

Етичка изјава

Експерименти на животињама спроведени су у складу са препорукама НИХ Водича за негу и употребу лабораторијских животиња и уз одобрење Институционалне комисије за негу и употребу животиња Универзитета у Барију, Италија (број дозволе: 23-98- А).

Припрема култура астроцита

Астроцити су припремљени из неокортикалних ткива {{0}}дневних Вистар пацова (РРИД: РГД_737960, Харлан Лабораториес срл, Удине, Италија). За припрему астроцита коришћено је 6 легла од 12 младунаца оба пола. Животиње су еутаназиране излагањем угљен-диоксиду (ЦО2) и убијене брзим одсецањем главе. Неокортикална ткива су сецирана и коришћена за пречишћавање примарних култура глијалних ћелија према методи коју су пријавили Латроницо ет ал. (2018). Укратко, након дисекције, мозгови пацова су осиромашени можданим овојницама и крвним судовима, механичким млевењем и дигестираним са 0.25 процената трипсина у присуству 0.01 процената ДНазе. Након центрифугирања и процене виталности ћелија, ћелије су постављене у боце обложене ПЛЛ (75 цм2) при густини од 1,5 × 107 ћелија/боци у ДМЕМ, 10 процената ФБС, 100 ИУ мЛ -1 пеницилина, 100 µг мЛ -1 стрептома , и одржавана на 37 степени у 5% ЦО2. После 7 дана, тиквице су протресане да би се уклонили олигодендроцити и микроглија. Чистоћа астроцита, добијених трипсинизацијом (0,25 процената трипсина/0,02 процената ЕДТА), процењена је имунолошким бојењем на ГФАП.

Третман ЛПС-активираних астроцита алил изотиоцијанатом, фенетил изотиоцијанатом или 2-сулфорафаном

Конфлуентни астроцити, засејани у плоче са 96 јажица, стимулисани су са 10 µг мЛ -1 ЛПС и истовремено третирани различитим концентрацијама алил изотиоцијаната (АИТЦ), 2-фенетил изотиоцијаната (ПЕИТЦ) или 2-сулфорафана (СФН) у ДМЕМ-у без серума. Астроцити у астроцитима без серума ДМЕМ и ЛПС-активираним астроцитима представљали су негативне и позитивне контроле, респективно. Поред тога, пошто су основни раствори АИТЦ (100 µМ), ПЕИТЦ (67 µМ) и СФН (56,4 µМ) направљени у ДМСО, крива доза-одговор на ДМСО, разблажен у медијуму културе у истој концентрацији растварача присутној у анализирани узорци су коришћени да би се проценила токсичност једињења. После 20 х инкубације на 37 степени, 5 процената ЦО2, супернатанти су сакупљени и ускладиштени на -20 степени до употребе, док су ћелије подвргнуте МТТ тесту да би се проценила виталност ћелија.

Тест виталности МТТ ћелија

Цитотоксичност АИТЦ, ПЕИТЦ и СФН на астроцитима је откривена коришћењем МТТ [{{0}}(4,5-диметилтиазол-2-ил)- 2,{{5 }}дифенил тетразолијум бромид] тест. Овај тест се заснива на редукцији МТТ митохондријалном сукцинат дехидрогеназом у живим ћелијама, до нерастворног плавог формазанског продукта који се може спектрофотометријски мерити. Укратко, након третмана од 20 сати са АИТЦ, ПЕИТЦ или СФН, медијум културе је уклоњен и ћелије су напуњене са 0, 5 мг мЛ-1 МТТ. После инкубације од 2 х на 37 степени, уклоњен је медијум са 5% ЦО2 и кристали формазана у ћелијама су растворени са 90% етанолом. После мућкања плоча у трајању од 15 минута да би се постигла потпуна солубилизација кристала, количина производа формазана је одређена оптичком апсорпцијом на 560 нм са референтном таласном дужином од 690 нм. Вијабилност ћелија је изражена као проценат контроле (ЦТРЛ), представљен нетретираним ћелијама, који је постављен на 100 процената. За свако једињење, добијена је крива виталности ћелије доза-одговор.

Детекција реактивних врста кисеоника

Детекција реактивних врста кисеоника (РОС) је извршена пуњењем астроцита са 10 μМ 2′,7′-дихлорофлуоресцеин диацетата (ДЦФХ-ДА) у ДМЕМ без фенол црвеног на 37 степени током 30 минута. Затим је ДЦФХ-ДА уклоњен из бунара и ћелије су третиране 1 х са АИТЦ (400 μМ), ПЕИТЦ (10 μМ) или СФН (25 μМ) у ДМЕМ без фенол црвеног у присуству Х2О2 у коначној концентрацији од 100 μМ . Ћелије третиране само са ДЦФХ-ДА или са Х2О2 представљале су негативну (ЦТРЛ) и позитивну контролу (Х2О2), респективно. После инкубације ћелије су испране са ПБС и лизиране са

Трис–ХЦл 10 мМ/НаЦл 150 мМ/Тритон Кс-100 0.5 процената, пХ 7,5,

затим центрифугиран на 10,000×г, 4 степена 10 мин. Супернатанти су сакупљени и њихова спектрофлуориметријска анализа је изведена на 525 нм уз ексцитацију на 485 нм. Резултати су нормализовани на укупан садржај протеина и производња РОС-а је изражена као релативни проценат интензитета фотолуминисценције (ПЛ) у односу на позитивну контролу.

Детекција желатиназа

Активност желатиназе у ћелијским супернатантима (СНс) је откривена зимографском анализом како су известили Латроницо ет ал. (2013). Укратко, количина СН, која одговара око 10 µг укупних протеина, растворена је са 30 µл Лаеммлијевог пуфера за узорке без -меркаптоетанола. Узорци су коришћени у 7,5% полиакриламидном гелу кополимеризованом са 0,1% (теж./в) желатина. Након електрофоретског рада, гелови су два пута испрани са 2,5 процената Тритон Кс-100/10 мМ ЦаЦл2 у 50 мМ Трис–ХЦл, пХ 7,4 и инкубирани 24 сата на 37 степени у 1 проценат Тритон Кс-100 /50 мМ Трис–ХЦл/10 мМ ЦаЦл2, пХ 7,4. Гелови су обојени Цоомассие бриллиант блуе Р-250 и обојени у метанол/сирћетна киселина/Х2О (4:1:5 в/в). Активност желатиназе је визуелизована као јасна трака варења на плавој позадини гела и квантификована је компјутеризованом дензитометријском анализом слике коришћењем софтвера Имаге ЛабТМ (Био-Рад Лабораториес). Желатиназа

активност је изражена као оптичка густина (ОД) × мм2, што представља подручје скенирања испод кривих које узима у обзир и осветљеност и ширину зоне лизе супстрата. Подаци су изражени коришћењем следеће једначине: проценат инхибиције=[100 − (ОД узорак/ОД позитивна контрола) × 100].

Ланчана реакција полимеразе реверзне транскрипције (РТ-ПЦР)

Астроцити, засејани у плоче са 6 бунарчића, активирани су са ЛПС (10 µг мЛ-1) и истовремено третирани ИТЦ у максималној нетоксичној концентрацији. После 20 х инкубације укупна РНК је екстрахована из астроцита коришћењем Киаген РНеаси мини комплета према упутствима произвођача. Комплементарна ДНК (цДНК) је синтетизована из 500 нг РНК коришћењем КуантиТецт комплета за реверзну транскрипцију према упутствима произвођача. Укупно 25 нг производа реверзне транскрипције је коришћено за амплификацију фрагмента од 591 бп коришћењем специфичних прајмера (сенсе 5′-ГТЦ АЦТ ЦЦГ ЦТГ ЦГЦ ТТТ ТЦТ ЦГ-3′; антисенсе 5′-ГАЦ АЦА ТГГ ГГЦ АЦЦ ТТЦ ТГА-3′) за ММП-2 секвенцу пацова и фрагмент од 541 бп користећи специфичне прајмере (сенсе 5′-ЦГГ АГЦ АЦГ ГГГ АЦГ ГГТ АТЦ 3′; анти-сенсе 5′-ААГ АЦГ ААГ ГГГ ААГ АЦГ ЦАЦ АТЦ 3′) за ММП-9 секвенцу пацова. Паралелно, извршена је амплификација фрагмента 18С рРНА пацова од 308 бп (сенсе 5′-ГЦЦТАГАТА ЦЦГЦАГЦТАГГА-3′; антисенсе 5′-ТЦАТГГЦЦТЦАГ ТТЦЦГАА-3′), релативно непроменљивог интерног референтног гена. . Сетови прајмера, који су већ потврђени у другим студијама (Латроницо ет ал. 2013; Лиуззи ет ал. 2004; Грамегна ет ал. 2011) специфично препознају само гене од интереса, што је назначено амплификацијом једне траке очекиване величине ПЦР-а производи. ПЦР амплификација је спроведена током 25 циклуса од којих се сваки састојао од денатурације на 94 степена, жарења на 59 степени и екстензије на 72 степена. Након амплификације, производи су анализирани у 1,5% агарозних гелова. Након дензитометријске анализе гелова, амплификација циљних гена је нормализована на експресију 18С рРНА, а резултати су изражени као проценат инхибиције у поређењу са позитивном контролом као што је пријављено за квантификацију желатиназе.

Детекција ЕРК 1/2 фосфорилације помоћу Вестерн блот анализе

ЕРК 1/2 су откривени имуноблот анализом као што је објављено у Латроницо ет ал. (2018). Укратко, конфлуентни примарни

астроцити постављени у {{0}} плоче са бунарима, стављени у мировање у медијуму без серума 24 х, претходно су третирани 1 х са АИТЦ (400 μМ), ПЕИТЦ (10 μМ), или СФН (25 μМ) у ДМЕМ-у без фенол црвеног. После стимулације од 2 сата са 10 уг мЛ-1 ЛПС, ћелије су лизиране са 20 мМ Трис-ХЦл, 150 мМ НаЦл, 2,5 мМ На-пирофосфата, 1 мМ -глицерофосфата 1 проценат Тритон Кс{19}}, фенилметилсулфонил фуорид, 20 уг/мЛ апротинина, 1 мМ ЕГТА, 1 мМ На-фуорид, 1 мМ На3ВО4, пХ 7,5. Шездесет уг укупних протеина сваког узорка је раздвојено електрофорезом 10% СДС-полиакриламидног гела, а протеини су затим имуноблотирани на мембране поливинилиден дифлуорида. Након блокирања преко ноћи на 4 степена са 0,05 процената Твеен 20, 1 проценат млека, 1 проценат говеђег серумског албумина у 150 мМ НаЦл, 20 мМ Трис–ХЦл (пХ 7,5), мембране су тестиране преко ноћи на 4 степена са моноклонским анти-п- ЕРК 1/2 антитело (1:500). Затим су мембране испране три пута са 0,05 процената Твеен 20 у физиолошком раствору пуферованом Трис, испитане са секундарним антителом против пероксидазе миша и хрена (1:20,000) током 2-х на 24 степена и детектоване са појачаном хемилуминисценцијом. Да би се проценила укупна количина ЕРК, мембране су скинуте и инкубиране са антителом специфичним за нефосфорилисани ЕРК 1/2 (1:500). Интензитет трака је квантификован дензитометријским скенирањем мрља, а нивои фосфорилације ЕРК 1/2 су нормализовани на нефосфорилисани ЕРК 1/2 и изражени као проценат у поређењу са позитивном контролом (астроцити третирани ЛПС), према следећа једначина:

проценат пЕРК 1/2=(ОД узорак/ОД позитивна контрола) × 100.

Статистичка анализа

Анализа података је извршена коришћењем ГрапхПад Присм 5.0 (ГрапхПад Софтваре Инц., Сан Дијего, Калифорнија, САД). Подаци су изражени као средње вредности ± СД. Статистичка анализа је спроведена коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА) праћено Дунеттовим пост хоц тестом вишеструког поређења.

Резултати

Утицај једињења изотиоцијаната на виталност астроцита

Изведени су прелиминарни експерименти да би се проценила цитотоксичност АИТЦ, ПЕИТЦ или СФН. У ту сврху, пречишћени астроцити су третирани током 20 х са ИТЦ једињењима у концентрацијама у распону између 5 и 400 µМ или са ДМСО разблаженим у медијуму културе као што је описано у одељку о методама. Као што је приказано на слици 1, ДМСО није био токсичан у свим коришћеним концентрацијама које одговарају онима у тестираним ИТЦ растворима. Међу истраживаним ИТЦ, АИТЦ

Слика 1 Вијабилност ћелија астроцита третираних једињењима изотиоцијаната. Конфлуентни примарни астроцити су третирани 20 х алил изотиоцијанатом (АИТЦ), 2-фенетил изотиоцијанатом (ПЕИТЦ) или 2-сулфорафаном (СФН) у назначеним концентрацијама, а затим су подвргнути МТТ тесту. Поред тога, пошто је у основним растворима растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО), крива доза-одговор на ДМСО, разблажен у медијуму културе у истој концентрацији растварача (процента) присутној у ИТЦ узорцима, вођена је у сваком експерименту да би се добило поуздана процена токсичности ИТЦ. Контрола (ЦТРЛ) је била пред-

намирисан из нетретираних астроцита у ДМЕМ-у без серума. Графикони представљају криве доза-одговор виталности ћелије, изражене као проценат преживљавања ћелија у поређењу са контролом. Као максималне нетоксичне концентрације изабране су дозе једињења које су одређивале виталност ћелија изнад 60 процената. Вредности су средња вредност ± СД од н=3 експеримената изведених на различитим популацијама ћелија. Микрограми показују репрезентативне резултате ћелијске морфологије посматране под фазно-контрастним микроскопом (увећање од 50к) након третмана различитим једињењима

био је мање токсичан за астроците. Посебно, АИТЦ није био токсичан за ћелије до 400 µМ, док су ПЕИТЦ и СФН били токсични при концентрацијама изнад 10 и 25 µМ, респективно. Микроскопско посматрање потврдило је резултате МТТ теста који показују да је при токсичним концентрацијама ПЕИТЦ и СФН број астроцита смањен, а они који су остали показују цитотоксичне промене у својој цитоплазми.

Заштитни ефекат ИТЦ једињења на производњу РОС у астроцитима третираним водоник-пероксидом

Да би се проценио заштитни ефекат ИТЦ према оксидативном стресу, астроцити су претходно третирани ПЕИТЦ, АИТЦ и СФН у максималној нетоксичној концентрацији, а затим стимулисани са Х2О2. Интрацелуларна производња РОС, индукована Х2О2, анализирана је помоћу ДЦФХ-ДА. Као што је приказано на слици 2, излагање Х2О2 појачало је флуоресцентни сигнал у

Слика 2 Производња реактивних врста кисеоника (РОС) у астроцитима третираним ИТЦ. Присуство РОС-а је испитано мерењем промена флуоресцентног сигнала 2′,7′-дихлорофлуоресцеина (ДЦФА) као што је наведено у одељку Материјали и методе. Астроцити, засејани у плоче са 6 бунарчића, претходно су третирани 30 мин са ДЦФА, а затим третирани 1 х са 10 μМ ПЕИТЦ, 400 μМ АИТЦ или 25 μМ СФН у присуству Х2О2 у коначној концентрацији од 100 μМ . Астроцити третирани само са ДЦФА (ЦТРЛ) или са 100 μМ Х2О2 представљали су негативну и позитивну контролу, респективно. Флуоресцентни сигнал детектован у ћелијским лизатима је мерен флуорометром на 525 нм под ексцитацијом на 485 нм. Производња РОС-а је изражена као проценат (проценти) интензитета фотолуминисценције (ПЛ) у поређењу са позитивном контролом. Вредности су средња вредност ± СД од н=3 експеримената изведених на различитим популацијама ћелија. Статистички значајно смањење у поређењу са Х2О2 означено је звездицама (једносмерна АНОВА праћена Дуннетовим пост хоц тестом; *п <>

астроцити у поређењу са контролом (ЦТРЛ). Као што је доказано смањењем интензитета флуоресценције ДЦФ, предтретман астроцита ИТЦ једињењима је супротставио генерисање РОС изазвано Х2О2. Међу тестираним ИТЦ-има, само ПЕИТЦ и СФН су били у стању да значајно смање производњу РОС-а за око 20 односно 24 процента, у поређењу са позитивном контролом (Х2О2).

Једињења изотиоцијаната инхибирају нивое ММП‑2 и ММП‑9 у астроцитима активираним ЛПС

Ефекат ИТЦ једињења на нивое ММП-2 и ММП-9 је процењен на астроцитима активираним са ЛПС, за који је познато да индукује експресију желатиназа (Готтсцхалл и Деб 1996), и истовремено лечени са АИТЦ, ПЕИТЦ, или СФН у опсегу концентрација које нису биле токсичне за ћелије. Као што је приказано на слици 3а, две јасне траке дигестије од 72 и 92 кДа су биле присутне на гелу који одговарају, респективно, ММП-2 и ММП-9. Активација астроцита са ЛПС повећала је нивое ММП-2 и изазвала синтезу ММП-9. Третман са АИТЦ (слика 3б), ПЕИТЦ (слика 3ц) или СФН (слика 3д) одредио је дозно зависну

смањење нивоа ММП-9, које је варирало у зависности од коришћеног једињења. Конкретно, међу коришћеним ИТЦ, СФН је био најефикаснији у инхибицији ММП-9 јер је одредио 70 процената инхибиције при дози од 10 μМ и 100 процената инхибиције при дози од 25 μМ. Поред тога, само СФН у максималној нетоксичној концентрацији био је у стању да значајно инхибира ММП-2 (слика 2д).

Једињења изотиоцијаната инхибирају експресију гена ММП-2 и ММП-9 у ЛПС-активираним астроцитима

Да би се утврдило да ли су проучавана ИТЦ једињења била у стању да инхибирају експресију ММП-2 и ММП-9, РТ-ПЦР је изведен на астроцитима активираним ЛПС-ом третираним максималном нетоксичном концентрацијом ИТЦ. Као што је приказано у репрезентативним геловима на слици 4а, третман ЛПС-активираних астроцита са појединачним ИТЦ био је у стању да се супротстави повећаном експресији ММП-2 и ММП-9 мРНА. Као што је приказано на Слици 4б, квантитативна анализа резултата је показала да, при максималној нетоксичној концентрацији, једињења ИТЦ, одређују статистички значајну инхибицију ММП-2 и ММП-9 експресије у поређењу на позитивну контролу (ЛПС). Конкретно, ПЕИТЦ и СФН испољавају исти проценат инхибиције на ММП-2 (85 процената) и ММП-9 (100 процената), док је АИТЦ био мање ефикасан од ПЕИТЦ и СФН у инхибицији ММП{{17} } (65 процената ) и ММП-9 (90 процената ) израза.

ЕРК 1/2 је укључен у инхибицију експресије ММП од стране ИТЦ

Пошто је ЕРК 1/2 главни пут сигналне трансдукције укључен у регулацију експресије ММП-2 и ММП-9 у астроцитима активираним ЛПС (Лее ет ал. 2003), ефекат ИТЦ једињења на тестирана је активација екстрацелуларно регулисаних протеин киназа (ЕРК) 1/2.

Као што је приказано на Слици 5, ЛПС је индуковао статистички значајно повећање нивоа фосфорилисаног ЕРК 1/2 (п-ЕРК) који је био супротстављен претходним третманом са ИТЦ једињењима.

Дискусија

Раширено је мишљење да се главне стратегије одбране од многих болести углавном састоје од избегавања фактора ризика и усвајања исправног начина живота. Постоје бројни научни докази који подржавају хипотезу да су неки природни метаболити, типично произведени од различитих врста воћа и поврћа, у стању да модулирају патолошке појаве као што су рак, неуролошке болести и друге мултифакторске болести. У овом сценарију, изотиоцијанати (ИТЦ) су изазвали велико интересовање с обзиром на њихов антифунгални, антибактеријски,

Слика 3. Утицај једињења изотиоцијаната на нивое ММП-2 и ММП-9 у астроцитима активираним ЛПС. У а је приказан репрезентативни зимографски гел за анализу супернатаната културе из астроцита активираних са ЛПС (10 уг мЛ-1) и истовремено третираних 20 х са АИТЦ, ПЕИТЦ или СФН у назначеним концентрацијама (μМ). Негативне и позитивне контроле су добијене из нестимулисаних и нетретираних астроцита у медијуму без серума (ЦТРЛ) и ЛПС-

активиране ћелије (ЛПС), респективно. Хистограми б–д представљају резултате (средња вредност ± СД) н {{0}} експеримената изведених на различитим популацијама ћелија, изражене као проценат инхибиције ММП у поређењу са ЛПС, израчунате након скенирања дензитометрије и компјутеризоване анализе гела . Статистички значајно смањење у поређењу са ЛПС је означено звездицама (једносмерна АНОВА праћена Дуннет-овим пост хоц тестом; *п < 0.05,="" **п=""><>

антиканцерогена, антимутагена, антиоксидативна и антиинфламаторна биолошка својства (Дуфоур ет ал. 2015; Марзоццо ет ал. 2015; Виг ет ал., 2009; Талалаи и Фахеи 2001). Изотиоцијанати потичу ензимском деградацијом глукозинолата (ГСЛ) који су секундарни метаболити присутни у 15 ботаничких породица из реда Цаппаралес и веома су заступљени у породици Брассицацеае (Фахеи ет ал. 2001). ГСЛ хидролизује мирозиназа (-тиоглукозид глукохидролаза е; ЕЦ 3.2.3.147) у различитим компонентама као што су ИТЦ, нитрити, тиоцијанати, епитионитрили, СФГате, глукоза и оксазолидини (Ли и Кусхад 2005). Иако су ИТЦ опсежно проучавани у хемотерапијском пољу (Грундеманн и Хубер 2018), мало је истраживања о њиховом терапеутском потенцијалу у неуролошким болестима упркос томе што је доказана способност СФН и АИТЦ да пређу БББ и акумулирају се у паренхим мозга. (Цларке ет ал. 2011; Јазва ет ал. 2011; Зханг 2010). У овом раду смо упоредили ефекте три ИТЦ-а,

присутан у неколико обично конзумираног поврћа крсташа, о производњи реактивних врста кисеоника (РОС) и експресији матриксне металопротеиназе (ММП) у ин витро моделу неуроинфламације представљеном астроцитима активираним липополисахаридом (ЛПС) или третираним Х2О2. Астроцити, најзаступљенији тип глијалних ћелија ЦНС-а, играју кључну улогу у одржавању хомеостазе мозга и представљају обележје различитих неуролошких болести (Цеканавициуте и Буцквалтер 2016; Цоломбо и Фарина 2016). Они се сматрају кључним регулаторима урођеног имунолошког одговора и њихов одговор на штетне увреде, као што је оксидативни стрес, може погоршати инфламаторне реакције и оштећење ткива или подстаћи поправку ткива. Добро је познато да активирани астроцити производе неуротоксичне факторе као што су ММП који имају кључну улогу у промовисању неуроинфламације и прогресивног губитка неурона код неуролошких болести (Хсиех и Ианг 2013). Према томе, модулација од

Слика 4. Ефекат ИТЦ једињења на експресију ММП-2 и ММП-9 у астроцитима активираним ЛПС. Астроцити, засејани у плоче са 6 бунарчића, активирани су са ЛПС (10 µг мЛ-1) и истовремено третирани 20 х са АИТЦ (400 μМ), ПЕИТЦ (10 μМ) или СФН (25 μМ), а затим подвргнути РТ-ПЦР. Репрезентативни агарозни гелови експресије ММП-2 и ММП-9 приказани су у (а). Хистограми у (б) представљају резултате (средња вредност ± СД) н=3 експеримената изведених на различитим ћелијама

догађаји који се јављају након активације астроцита могу ублажити инфламаторни одговор и оштећење неурона.

Резултати ове студије су показали да је међу проучаваним ИТЦ-има АИТЦ био мање токсичан јер није резултирао смањењем виталности ћелија при свим коришћеним концентрацијама. Насупрот томе, слично ономе што су приметили други аутори на различитим линијама глијалних ћелија, ПЕИТЦ и СФН су показали ћелијску токсичност при концентрацијама већим од 10 и 25 µМ, респективно (Лее ет ал. 2015; Ерен ет ал. 2018; Су ет ал. 2015).

У тренутној научној литератури постоји много контроверзних података о молекуларним механизмима који леже у основи ефеката ИТЦ-а на одрживост ћелија. У том погледу, већина студија сугерише да ИТЦ инхибирају апоптозу која индукује ћелијски раст, заустављање ћелијског циклуса, стварање РОС у ћелијама рака, али не и у нормалним ћелијама (Фофариа ет ал. 2015; Кин ет. ал 2018; Шестили и Фимогнари 2015). Открили смо да СФН и ПЕИТЦ, али не и АИТЦ, имају заштитну улогу против оксидативног стреса у астроцитима, заиста при максималним нетоксичним концентрацијама су били у стању да се супротставе производњи РОС изазваној излагањем Х2О2. ЦНС је посебно осетљив на оксидативни стрес због велике потрошње кисеоника, слабог антиоксидантног система и високог садржаја биомакромолекула подложних оксидацији. Верује се да је стварање РОС и оксидативног оштећења укључено у патогенезу неуролошких поремећаја као што су Алцхајмерова болест (АД), Паркинсонова болест (ПД), амиотрофична латерална склероза (АЛС) и мултипла склероза (МС) (Лее ет ал. 2015). Стога, иако су у нашим ин витро експериментима СФН и ПЕИТЦ умерено супротставили производњу РОС-а, могли бисмо претпоставити да ин виво продужена примена ИТЦ-а може довести до значајнијег смањења РОС-а што, током времена, може резултирати значајним за популације изражене као проценат инхибиције ММП у поређењу са позитивном контролом (ЛПС), израчунато након скенирања дензитометрије и компјутеризоване анализе гелова. Статистички значајно смањење експресије ММП-2 и ММП-9 у поређењу са ЛПС је означено звездицама (једносмерна АНОВА праћена Дуннет-овим пост хоц тестом; *п <>

превенцију и модулацију можданих болести. РОС делује као критични сигнални молекул за покретање каскаде инфламаторног одговора у ЦНС. У том погледу, добро је познато да РОС регулише експресију многих гена укључених у неуроинфламацију кроз активацију проинфламаторних транскрипционих фактора као што је нуклеарни фактор-κБ (НФ-κБ) (Лее ет ал. 2015; Цхиурцхиу ет ал. 2016; Марторана и др. 2019). У овом сценарију, важну улогу играју ММП чију експресију регулише РОС кроз активацију НФ-κБ (Иан и Боид 2007).

Пошто дисрегулација ММП доприноси патогенези бројних неуроинфламаторних и неуродегенеративних болести, њихова инхибиција представља важну терапијску стратегију. Из тог разлога, све веће интересовање је у последњој деценији усмерено на потенцијал лекова и природних једињења да инхибирају ММП. Бројне ин витро студије су показале да је антиинфламаторно и антиоксидативно дејство неколико лекова и биоактивних једињења присутних у поврћу и морским организмима повезано са њиховом способношћу да инхибирају експресију ММП (Латроницо ет ал. 2016, 2018; Ди Бари ет ал. 2015). У овој студији смо показали да су међу тестираним ИТЦ, СФН и ПЕИТЦ били најефикаснији у инхибицији нивоа ММП-2 и ММП-9 и експресије у астроцитима активираним ЛПС. Инхибиција ММП од стране ИТЦ је пријављена у другим ин виво и ин витро студијама. Конкретно, Ли ет ал. (2013) су показали да је СФН у стању да ублажи оштећење БББ инхибицијом експресије ММП-9 у ин виво моделу експерименталног аутоимуног енцефаломијелитиса. Други аутори су известили да је СФН био у стању да ублажи експресију ММП-9 након повреде кичмене мождине код мишева (Мао ет ал. 2010а). Поред тога, ин витро студије су показале да супресија миграције ћелија и

Слика 5 Екстрацелуларна сигнално регулисана киназа 1/2 (ЕРК 1/2) је укључена у инхибицију експресије ММП од стране ИТЦ једињења. Репрезентативни ауторадиографски филмови Вестерн блоттинг анализе лизата из астроцита претходно третираних 1 х са АИТЦ (400 μМ), ПЕИТЦ (10 μМ) или СФН (25 μМ), а затим активирани 2 х са ЛПС (10 уг мЛ){{ 13}}). Нетретиране и нестимулисане ћелије представљају негативну контролу (ЦТРЛ). Хистограм у (б) представља инвазију нивоа пЕРК1/2 у ћелијама глиома Ц6 била је повезана са инхибицијом експресије ММП-9 посредоване НФ-κБ (Лее ет ал. 2015).

Молекуларни механизми помоћу којих ИТЦ инхибирају ММП су нејасни и не постоје студије које би истраживале антиоксидативна и антиинфламаторна својства ИТЦ на примарним културама астроцита. Неколико студија подржава хипотезу да је инхибиторни ефекат ИТЦ-а последица њихове способности да блокирају НФ-κБ путем Нрф2 сигналног пута. У том погледу, ин виво студија је доказала да су Нрф2 нокаут мишеви били подложнији инфламаторном одговору кичмене мождине посредованом НФ-κБ и повећаном експресији гена зависних од НФκБ укључујући ММП-9 (Мао ет ал. 2010б ). Иако би путеви НФ-κБ и Нрф2 могли да се мешају, показали смо да се регулација НФ-κБ дешава и кроз модулацију молекуларних механизама који су независни од Нрф2. Заиста, открили смо да АИТЦ, ПЕИТЦ и СФН инхибирају активацију ЕРК1/2 који игра кључну улогу у каскади догађаја трансдукције сигнала који на крају регулишу транскрипцију ММП гена.

Међутим, експериментални докази да је СФН у максималној нетоксичној концентрацији у потпуности инхибирао и експресију и нивое ММП-9, док су АИТЦ и ПЕИТЦ максимално инхибирали експресију ММП-9, али су само смањили ММП{{3} } на око 50 процената, може сугерисати да ова једињења модулирају транскрипцију ММП-9 различитим механизмима деловања. У том погледу, објављено је да СФН, поред инхибиције ЛПС-индуковане активације НФ-κБ, омета везивање ЛПС-а за ТЛР4 рецептор (Коо ет ал 2013). Инхибицијски ефекат СФН-а на ТЛР4 могао би да спречи активацију астроцита помоћу ЛПС-а и то може довести до инхибиције експресије ММП{11}} узводно са последичним недостатком производње ММП{12}}.

добијено након дензитометријског скенирања ауторадиографских филмова и нормализације на нефосфорилисани ЕРК 1/2. Подаци представљају средње вредности ± СД од н=3 експеримената изведених на различитим популацијама ћелија. Звездице представљају вредности које се статистички разликују од позитивне контроле (астроцити активирани ЛПС), која је постављена на 100 процената (једносмерна АНОВА праћена Дуннеттовим пост хоц тестом вишеструког поређења; *п <>

Закључци

Укратко, наши подаци указују на то да третман астроцита са ИТЦ смањује формирање РОС и инхибира ослобађање ММП-2 и ММП-9 пружајући нови увид у антиоксидативна и антиинфламаторна својства ИТЦ на глијама ћелије. Ови резултати сугеришу да би ИТЦ могли бити обећавајући нутриционистички агенси за развој интервенција неуро-исхране, заснованих на употреби здраве хране, за превенцију и комплементарно лечење неуролошких болести.

Финансирање Финансирање отвореног приступа обезбеђено од стране Университа Дегли Студи ди Бари Алдо Моро у оквиру ЦРУИ-ЦАРЕ споразума.

Усклађеност са етичким стандардима

Сукоб интереса Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Отворени приступ Овај чланак је лиценциран под Цреативе Цоммонс Аттрибутион 4.0 међународном лиценцом, која дозвољава употребу, дељење, прилагођавање, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију или формату, под условом да дате одговарајуће признање оригиналном аутору (с) и извор, наведите везу до Цреативе Цоммонс лиценце и назначите да ли су измене направљене. Слике или други материјал треће стране у овом чланку су укључени у Цреативе Цоммонс лиценцу за чланак осим ако није другачије назначено у кредитној линији за материјал. Ако материјал није укључен у Цреативе Цоммонс лиценцу за чланак и ваша намеравана употреба није дозвољена законским прописима или премашује дозвољену употребу, мораћете да добијете дозволу директно од носиоца ауторских права. Да бисте видели копију ове лиценце, посетите хттп://цреативецоммонс.орг/лиценсес/би/4.0/.