Део 2: Вербаскозид штити ћелије панкреаса од ЕР-стреса
Mar 05, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Алесандра Гали 1, плус , Паола Марциани 1, плус , Алгерта Марку 1, Силвија Гисланцони 1, Федерико Бертуци 2, Рафаела Роси 3, Алесија Ди Ђанкамиљо 3, Микела Кастања 1 и Карла Перего 1,*
Молимо кликните овде назад на први део
3.4 Вербаскозид модулира - Митохондријална активност и динамика ћелија
Тестови одрживости МТТ указују на могући утицајвербаскозиддиректно на митохондрије што обезбеђује спрегу лучења инсулина са нутритивним стањем и опстанак ћелије у овом типу ћелије. Облик и мембрански потенцијал су маркери здравља митохондрија [42]. Прво смо проценили потенцијал митохондријалне мембране обележавањем ћелија са МитоСпив Оранге ЦМТМРос, пропусном бојом чија концентрација зависи од потенцијала унутрашње митохондријалне мембране, док је МитоСпив Греен ФМ коришћен за нормализацију података на митохондријалну масу (Слика 4А, Б). Мембрански потенцијал митохондрија увербаскозид-третиране ћелије су повећане у поређењу са контролом у базалним и стресним условима. Занимљиво,вербаскозидметаболити су испољили различите ефекте. Кафе киселина није побољшала митохондријски потенцијал, док је хидрокситиросол изазвао дозно-зависно оштећење митохондријалне функције, у складу са подацима о виталности ћелија, такав ефекат је био очигледнији након излагања Х2О2 (Слика С3).
Пошто је функција стриктно повезана са морфологијом, измерили смо Феретов пречник, површину и кружност митохондрија. Акутни оксидативни стрес подстиче екстензивну фисију митохондрија, што доводи до мањих, кружних митохондрија [42]. У условима Х2О2 стреса, митохондрије ћелија третираних вербаскозидом биле су издуженије и показале су повећану површину од контролних (Слика 4Ц, Д и Слика С4). Кружност митохондрија била је нижа у ћелијама третираним вербаскозидом него у контролама, а разлике су биле очигледније у ћелијама третираним Х2О2 (Слика С3), поново потврђујући заштитну улогу полифенола.
Способност ових органела да модификују свој облик као одговор на стања исхране или стресне услове је под контролом догађаја фузије и фисије и захтева покретљивост митохондрија [39]. Праћење кретања митохондрија довело нас је до израчунавања кумулативне пређене удаљености и анализа је открила значајно повећање динамике митохондрија у ћелијама третираним вербаскозидом у поређењу са контролом, већ у базалним условима (Слика 4Е, Ф и видео снимци С1-С4). Ефекат је био израженији након третмана Х2О2, заиста је предтретман вербаскозидом скоро потпуно поништио утицај оксидативног стреса на динамику митохондрија.
Узети заједно, ови подаци снажно подржавају кључну улогу вербаскозида у обезбеђивању динамике митохондрија која је кључна за промовисање брзог прилагођавања ове органеле на стресне услове.
3.5 Лангерхансов утицај вербаскозида на преживљавање и функцију људи
С обзиром на преводилачки потенцијал одвербаскозидприменом у људском здрављу, вериfiковали смо његов утицај на људска изолована Лангерхансова острва, релевантнији модел за физиопатолошке и фармаколошке студије на -ћелијама. Изолована острва су третирана са 16 уМ вербаскозида током 5 дана и процењен је потенцијал митохондријалне мембране. Као што је приказано на слици 5А, док је потенцијал органеле био угрожен у контролним људским острвцима након излагања Х2О2, потенцијал унутрашње мембране митохондрија у острвцима претходно третираним вербаскозидом није се значајно смањио, подржавајући хипотезу о заштитној улози вербаскозида против РОС-индукованог - дисфункција ћелија. Анализа експресије ЕР-стрес маркера показала је значајно смањење фракције П-еИФ2 у два различита препарата острваца одржаваних у 16 уМ вербаскозида, потврђујући смањење овог пута и код људских узорака (Слика 5Д). Корисни ефекти третмана полифенолом су поткрепљени повећаним садржајем инсулина примећеним у острвцима третираним вербаскозидом у поређењу са контролама (Слика 5Б). Дисперзија података у нашим експериментима није омогућила да се демонстрира било каква значајна разлика у лучењу инсулина стимулисаном глукозом (ГСИС) у острвцима третираним вербаскозидом, иако се чини да је позитиван тренд очигледан и под базалним и под стресним условима (Слика 5Ц).
4. Дискусија
Оксидативни стрес и инфламација су основа дисфункције ћелија која се јавља током Т2Д [43,44] као таква, функционална храна, нутрацеутици и фитокемикалије су истраживани као алати за превенцију дијабетеса типа 2 [45]. У овом раду смо се фокусирали на вербаскозид, за који је познато да има антиинфламаторне и антиоксидативне активности у неуронима [18]. Упркос високој структурној сложености, вербаскозид и изовербаскозид су пронађени у крвној плазми пацова храњених екстрактом Липпиа цитриодора заједно са неким метаболитима [20]. Поред тога, акумулација вербаскозида и вербаскозида у ћелијама је откривена у ћелијској линији рака дојке СКБР3 [23], а студије спроведене на Цацо-2 ћелијама показују да умерене количине вербаскозида и изовербаскозида остају нетакнуте и биодоступне након ин витро дигестије процес. Штавише, Цацо-2 може да преузме оба молекула брзим и линеарним транспортом у опсегу од 10 до 100 уМ [22]. Нису пријављени подаци о биорасположивости вербаскозида код људи, али горе наведене студије сугеришу да би могло бити изводљиво да неметаболизовани вербаскозид пређе цревну баријеру, циркулише у крвној плазми и испољава антиоксидативне ефекте на ендокрине ћелије панкреаса.
Пронашли смо заштитну улогу вербаскозида зависну од дозе (0.8–16 уМ) на клонске и људске ћелије, како у базалним тако и под стресним условима. Овај ефекат је последица самог вербаскозида, а не његових метаболита кофеинске киселине и хидрокситирозола, који се у концентрацији од 16 уМ заправо чине цитотоксичним. Концентрације које су доказане као активне у нашим експериментима су у складу са онима описаним код животиња храњених вербаскозидом [20].
Иако не знамо да ли вербаскозид делује екстрацелуларно везивањем за мембрански рецептор или се интернализује ендоцитозом и делује интрацелуларно, наши подаци потврђују да вербаскозид има антиоксидативна и антиинфламаторна својства и штити ћелије од ЕР-стресом повезаних дисфункција смањујући дисфункције. УПР и промовисање митохондријалне динамике.
Заиста, открили смо значајно смањење садржаја РОС у ћелијама третираним вербаскозидом, што је даље потврђено смањењем липидне пероксидације мерене преко експресије ХНЕ и акролеина. За разлику од већине биљних полифенола, активност уклањања РОС вербаскозида углавном следи индиректне (путем регулације ензима за уклањање РОС), а не директне путеве. У ствари, повећава транскрипцију гена неких антиоксидативних ензима кроз активацију пута Нрф2 (НФ-Е2-повезаног фактора 2) и путем механизма зависног од АхР (арил рецептора угљоводоника) [24,29]. Као такви, открили смо повећану експресију СОД1 у ћелијама третираним вербаскозидом.
РОС хомеостаза је изузетно релевантна у патологији ћелија. Због недостатка антиоксидативних ензима, повећана производња РОС-а се не може неутралисати и изазива се ЕР стрес који промовише погрешно савијање протеина. ЕР стрес доводи до смањења транскрипције и транслације инсулина кроз активацију УПР-а [44,46]. Овај пут има главну сврху обнављања функције ЕР кроз репрограмирање експресије гена, међутим, када је престимулисан, покреће апоптозу. Наши подаци сугеришу да је важно дејство вербаскозида да ублажи УПР, дозвољавајући модификације неопходне за поправку дисфункције ЕР, без изазивања апоптозе. Према овој могућности, експресија БИП, ХСП70 и ПЕРК протеина је смањена у ћелијама третираним вербаскозидом, а активација ПЕРК пута је ослабљена као одговор на ЕР стрес изазван туникомицином. Слично дејство је пријављено за тирозол у ћелијској линији инсулинома НИТ-1 [47].
Посебно је занимљива способност вербаскозида да модулира активацију ПЕРК огранка УПР-а. У -ћелијама овај пут је неопходан за одржавање базалне секреторне хомеостазе и преживљавања -ћелија, а код дијабетеса је озбиљно дерегулисан [41,48]. Још интригантније, уобичајене варијанте ПЕРК-а доприносе ризику од предијабетеса и рецесивних мутација у гену ЕИФ2АК3 (који кодира ПЕРК) леже у основи осетљивости на Волцотт-Раллисонов синдром који карактерише трајни неонатални инсулин-зависни дијабетес [49,50].
Смањење регулације ИКБ-НФКБ инфламаторног пута је такође откривено у нашем систему у присуству вербаскозида. НФКБ представља главни инфламаторни пут у ћелијама и његова трајна активација покреће каскаду догађаја који кулминирају смрћу ћелије. У ћелијама под стресом, смањење експресије НФКБ штити ћелије панкреаса од дијабетогених агенаса [27,51], додатно подржава примену вербаскозида у превенцији дијабетеса. Занимљиво је да ПЕРК сигнализација активира факторе транскрипције НФР2 (умешани у редокс хомеостазу) и НФКБ, објашњавајући на тај начин антиоксидативне и антиинфламаторне ефекте вербаскозида [40,52].
Наши подаци такође откривају важну улогу вербаскозида на митохондријалну активност и динамику.
Маркер оперативног квалитета митохондрија је њихова динамика, процес који карактеришу координирани циклуси догађаја фузије и фисије који регулишу митохондријски број, дистрибуцију, морфологију и мембрански потенцијал [39]. У складу са овом могућношћу, вербаскозид побољшава потенцијал тц3 митохондријалне мембране и под базалним и под стресним условима. Опет, ефекат је последица вербаскозида, а не његових метаболита, пошто кофеинска киселина не побољшава функцију митохондрија, а хидрокситиросол значајно смањује потенцијал органела. Повећана динамика митохондрија и промене у њиховој морфологији примећене су праћењем кретања митохондрија, што сугерише да вербаскозид промовише програм митоморфозе. Преобликовање ћелијске митохондријалне мреже утиче на склапање суперкомплекса респираторног ланца, мењајући тако не само метаболизам ћелије већ и њено редокс стање и омогућавајући ћелијама да се боље супротставе оксидативном стресу и упали [5,37,39].
Иако је молекуларни механизам још увек непознат, можемо претпоставити да вербаскозид, као и други полифеноли, штити митохондријалну ДНК смањењем концентрације РОС [53] и спречава отварање прелазних пора митохондријалне пермеабилности [54], обезбеђујући физиолошку митохондријалну активност. Још једна интригантна могућност је да је модификација динамике и активности митохондрија поново посредована дејством вербаскозида на УПР. Заиста, недавно истраживање на пољу митохондрија указује да места интеракције ЕР-митохондрија играју кључну улогу у контроли динамике и активности митохондрија као одговор на оксидативни стрес и ПЕРК је укључен у феномен [55]. Већина ин витро студија са полифенолима изведена је на ћелијским линијама, често туморског порекла, које се разликују од оригиналних ћелија у смислу метаболизма и производње РОС. Овде пружамо доказе да вербаскозид има заштитни ефекат и на људска изолована Лангерхансова острва, крајњу мету интервенције код дијабетеса. Занимљиво је да полифенол ублажава ПЕРК сигналну активацију већ у базалним условима, чиме се повећава садржај инсулина и спречавају митохондријалне дисфункције посредоване оксидативним стресом. Остаје да се разјасни да ли ефекат полифенола на садржај инсулина одражава способност једињења да спречи смрт ћелија, да ублажи ЕР стрес или да директно контролише експресију инсулинског гена, као што је показано за друга полифенолна једињења [56]. Ови подаци су посебно релевантни с обзиром на могућу употребу вербаскозида као комплементарне терапије у лечењу дијабетеса.
5. Закључци
Ин витро студије објављене овде на клонским и људским ћелијама показују да вербаскозид испољава заштитне ефекте против дисфункција повезаних са ЕР-стресом, ублажавајући активацију ПЕРК гране УПР-а и побољшавајући динамику митохондрија. Пошто поремећај хомеостазе ЕР изазива оштећење ћелија и дијабетес, ови подаци дају образложење за могућу употребу вербаскозида као нутрацеутика у превенцији и лечењу болести. Ипак, многа питања морају бити решена за ефикасну клиничку примену вербаскозида. Упркос обиљу лабораторијских студија, поуздане клиничке студије које потврђују здравствене ефекте вербаскозида ин виво су ограничене. Штавише, повећање његове стабилности и биодоступности је обавезно за будућу примену овог једињења у људском здрављу. Са ове тачке, вербаскозид је интересантан молекул јер његова скела има различита реактивна места која се могу модификовати комбинаторном хемијом. Очекујемо да ће информације добијене из ових студија отворити путеве за терапеутску модулацију оксидативног стреса и инфламације у патолошким стањима коришћењем природних једињења.
Додатни материјали: Следећи материјали су доступни на мрежи на хттп://ввв.мдпи.цом/2227-9059/8/12/582/с1. Слика С1: Ефекти кофеинске киселине и хидрокситирозола на виталност ћелија. Слика С2: Ефекти вербаскозида на ЕР стрес изазван туникамицином. Слика С3: Ефекти кофеинске киселине и хидрокситирозола на потенцијал митохондријалне мембране. Слика С4: Квантитативне анализе слике митохондрија у ћелијама третираним кофеинском киселином и хидрокситирозолом. Видео С1, С2 Видео снимци: динамика митохондрија снимљена у базалним условима, у одсуству (С1) или присуству (С2) вербаскозида. Видео С3, С4: Динамика митохондрија снимљена у условима оксидативног стреса, у одсуству (С3) или присуству (С4) вербаскозида.
Доприноси аутора: Концептуализација, АГ, ПМ и ЦП; курирање података, АГ и ПМ; формална анализа, АГ и ПМ; прибављање средстава, ЦП; истрага, МЦ; методологија, АМ и СГ; ресурси, ФБ, РР и АДГ; надзор, КП; валидација, АМ, СГ и МЦ; визуелизација, АГ и АМ; писање—оригинални нацрт, АГ; писање—рецензија и уређивање, ПМ, АМ, ФБ, РР, АДГ, МЦ и ЦП Сви аутори су прочитали и сложили се са објављеном верзијом рукописа.
Финансирање: Ово истраживање није добило спољно финансирање.
Признања: Желели бисмо да се захвалимо Царлу Цорину и Марију Делл'Аглију на реагенсима и корисној дискусији.
Сукоб интереса: Аутори изјављују да нема сукоба интереса.
Референце
1. Цхо, НХ; Схав, ЈЕ; Каруранга, С.; Хуанг, И.; да Роцха Фернандес, ЈД; Охлрогге, АВ; Маланда, Б. ИДФ Диабетес Атлас: Глобалне процене преваленције дијабетеса за 2017. и пројекције за 2045. Диабетес Рес. Цлин. Працт. 2018, 138, 271–281. [ЦроссРеф]
2. Леслие, РД; Палмер, Ј.; Сцхлотт, НЦ; Лернмарк, А. Дијабетес на раскршћу: Релевантност класификације болести за патофизиологију и лечење. Диабетологиа 2016, 59, 13–20. [ЦроссРеф] [ПубМед]
3. Токарз, ВЛ; МацДоналд, ПЕ; Клип, А. Ћелијска биологија системске функције инсулина. Ј. Целл Биол. 2018, 217, 2273–2289. [ЦроссРеф] [ПубМед]
4. Перего, Ц.; Да Далт, Л.; Пирилло, А.; Галли, А.; Цатапано, АЛ; Нората, ГД Метаболизам холестерола, функција ћелија панкреаса и дијабетес. Биоцхим. ет Биопхис. Ацта (ББА) Мол. Басис Дис. 2019, 1865, 2149–2156. [ЦроссРеф] [ПубМед]
5. Галли, А.; Алжир, М.; Марциани, П.; Сцхулте, Ц.; Леонарди, Ц.; Милани, П.; Мафоли, Е.; Тедесцхи, Г.; Перего, Ц. Обликовање диференцијације и функционисања ћелија панкреаса: Утицај механотрансдукције. Ћелије 2020, 9, 413. [ЦроссРеф]
6. Асхцрофт, ФМ; Рорсман, П. Диабетес меллитус анд тхе Целл: Тхе Ласт Тен Иеарс. Целл 2012, 148, 1160–1171. [ЦроссРеф] [ПубМед]
7. Росенгрен, АХ; Браун, М.; Махди, Т.; Андерссон, СА; Траверс, МЕ; Схигето, М.; Зханг, Е.; Алмгрен, П.; Ладенвалл, Ц.; Акелссон, АС; ет ал. Смањена егзоцитоза инсулина у људским ћелијама панкреаса са варијантама гена повезаним са дијабетесом типа 2. Дијабетес 2012, 61, 1726–1733. [ЦроссРеф] [ПубМед]
8. Полонски, КС Динамика секреције инсулина код гојазности и дијабетеса. Инт. Ј. Обес. 2000, 24, С29–С31. [ЦроссРеф]
9. Роден, М.; Схулман, ГИ Интегративна биологија дијабетеса типа 2. Природа 2019, 576, 51–60. [ЦроссРеф]
