за више информација:ali.ma@wecistanche.com

Дискусија

Молекуларна основа формирања енграма била је област од великог интересовања. Овде користимо предности ТРАП модела миша да бисмо разјаснили динамику приступачности хроматина, 3-Д геномске архитектуре и експресије гена током животног века ћелије енграма. Прво, ми то директно показујемомеморијакодирање има огроман и дуготрајан ефекат на доступност хроматина. Једном када се успостави ово стање хроматина, наредни догађаји као нпрмеморијачини се да консолидација и опозив имају мањи утицај на пејзаж хроматина. Могуће је да одабрана временска тачка за опозив можда неће у потпуности обухватити догађаје хроматина реактивираних ћелија и накнадне промене хроматина могу бити повезане самеморијапоновно консолидовање или гашење8. Важно је да у складу са претходним публикацијама12, 13,23, наши подаци то сугеришумеморијаформирање је у великој мери феномен вођен појачивачем.

Кликните на Цистанцхе УК за памћење

Друго, наша студија пружа први свеобухватан пејзаж архитектуре 3Д генома током различитих фазамеморијаформирање, јер смо показали ре-локализацију великих сегмената хроматина и специфичне интеракције промотор-појачивач динамичне унутар ових одељења које омогућавају фино подешавање различитих транскрипционих програма. Штавише, показујемо да промотери гена који су наниже регулисани чешће интерагују са појачивачима који садрже репресоре транскрипције и обрнуто.

На крају, наш рад пружа прве доказе за догађај функционалног прајминга, који се карактерише почетним повећањем приступачности појачивача током кодирања, без очекиваних промена транскрипције. Наша анализа је открила да са реактивацијом, неурони енграма користе подскуп интеракција деновопромотер-појачивача, где се примарни појачивачи доводе у контакт са својим одговарајућим промоторима да би регулисали гене укључене у транспорт мРНА и локално превођење протеина у синаптичким одељцима. Ове промене су одговарале очекиваним морфолошким и функционалним променама. Заједно, чини се да су ћелије енграма обележене на епигенетском нивоу и да интеракција између доступности хроматина, архитектуре 3Д генома и интеракција промотера-појачивача описује добро координиран систем који доводи до одложеног транскрипционог скока током реактивације енграма.

Као и код сваког рада, студија је имала неколико ограничења. Употреба ТРАП мишева зависних од тамоксифена омогућава привремену резолуцију, али отвара прозор за означавање од око 12 сати што може довести до неспецифичног означавања неурона који нису део искуства са ЦФЦ. Штавише, као што је раније сугерисано37, неурони означени луком могу бити хетерогени и укључују различите ансамбле који регулишу обамеморијадискриминација и генерализација. Поред тога, било која временска тачка пре 1,5–2 сата (рано), неће бити довољна за снимање транскрипционих и транслационих догађаја изазваних рекомбинацијом ДНК, односно експресије Цре рекомбиназе и коначне експресије еИФП гена5. Стога верујемо да су пропуштени многи рани пролазни кластери ДЕГ-а, јер је раније показано да се многи ИЕГ враћају на основне нивое након 2 сата (осим Арц46). На крају, иако се наша студија фокусирала на хипокампус, структурна и синаптичка пластичност су повезане са дуготрајним складиштењем информација у другим регионима мозга, као што је префронтални кортекс, амигдала2. Будуће студије би требало да утврде да ли ове епигенетске промене могу представљати глобални критични процес укључен у дугорочно формирање и задржавање сећања или је то јединствено за кола хипокампуса.

Методе

Мишеви и понашање

Као што је претходно описано6, АрцЦреЕРТ2( плус) мишеви су узгајани са хомозиготном линијом Р26Р-СТОП-флоксед-жутог флуоресцентног протеина (еИФП). ~140 наредних мушких потомака је генотипизовано коришћењем протокола генотипизације Јацксон Лаборатори. Мишеви су смештени четири до пет по кавезу у просторији за колонију од 12 сати (06:00–18:00) на 22 степена са 40–60 процената влаге. Храна и вода су давани ад либитум. Тестирање понашања је вршено током светлосне фазе. 1 х пре теста понашања, мишеви су примили једну дозу 4-Хидрокитамокифена (4- ОХТ, Х6278, Сигма-Алдрицх), што отвара ~12-часовни прозор за означавање5. Да би се минимизирала неспецифична еИФП ознака, један дан пре задатка понашања (нпр. ЦФЦ), мишеви су били појединачни смештени у 24-часовној мрачној/мрачној просторији. Поред тога, да би се смањио ниво анксиозности, кавезу је додата цев за склониште и гнежђење. Следећег дана, мишевима је убризган ТАМ 1 х пре ЦФЦ-а. Након задатка понашања, мишеви су или еутаназирани након 1,5-2 х, а мозгови су сакупљени. или стављен назад у мрачну комору на следећих 48 сати. Након што су мишеви извучени из мрака, враћени су у нормалан циклус од 12 сати (06:00–18:00) светло-тамно, у истој просторији. 3 дана касније (укупно 5 дана након ЦФЦ), половина кохорте мишева је еутаназирана и мозак је сакупљен, док се друга половина вратила у собу за тестирање, где су били изложени знаку који изазива страх (тон и контекст) . Сав рад на мишу је одобрен од стране Комитета за негу животиња Одељења за компаративну медицину на Технолошком институту у Масачусетсу. Цистанцхе се може побољшатимеморија.

Цистанцхе може побољшати памћење

Контекстуално условљавање страха

Апарат за условљавање контекстуалног страха (ЦФЦ) и програм аквизиције били су из ТСЕ-Система. Мишеви су уведени у ЦФЦ комору, након 3 минута иницијалне хабитуације, тон од 3 килоХз са 8{6}} ДБ интензитета је представљен у трајању од 30 секунди и био је прекинут ударом стопала од 0,7 мА у трајању од 1 секунде. 70 посто изопропанола је коришћено између експеримената за чишћење кавеза. 5 дана касније мишеви су уведени у првобитни условљени контекст упарен са тоном и нивои смрзавања су мерени током 3 минута (подразумевани параметри ТСЕ софтвера који се користе за праћење понашања замрзавања), да би се проценило контекстуалномеморија. Контекст Б је био модификовани контекст А. Шипке од нерђајућег челика биле су прекривене белим пластичним уметком, спољни зидови комора су били прекривени облицима лепљиве траке да би се променио изглед коморе. Комора је била намирисана ванилијом, осветљење просторије је било много светлије и мишеви су транспортовани до апарата у колицима која нису у контексту А.

Дроге

Рекомбинација код АрцЦреЕРТ2 × Р26Р-СТОП-флокед-ЕИФП трансгених мишева је индукована коришћењем 4-Хидрокитамокифена (4-ОХТ, Х6278, Сигма-Алдрицх). 4-ОХТ је растворен у 2,5 мл ЕтОХ/100 процената и мућкан на шејкеру 30 мин. Затим је додато 5 мл кукурузног уља и мућкано на шејкеру 1 х. Коначно, епрувете су постављене на 30 минута на 60 степени да би се омогућило потпуно испаравање ЕтОХ. Појединачна ињекција од 50 мг/кг је убризгана интраперитонеално (ип).

Имунохистохемија (ИХЦ)

Мишеви су транскардијално перфузирани са ледено хладним 25 мл физиолошког раствора пуферованог фосфатом (ПБС), а затим са 40 мл 4 процента параформалдехида у ПБС. Мозгови су уклоњени и накнадно фиксирани у 4 процента ПФА преко ноћи на 4 степена и пребачени у ПБС до секције. Мозгови су постављени на вибратомски степен (Леица ВТ1000С) коришћењем суперлепка и исечени са дебљином пресека од 40 μм. Резови су испрани ПБС-ом и блокирани коришћењем 1% говеђег серумског албумина (БСА) припремљеног у ПБС-у који садржи 0,1% Тритон-Кс100 (ПБСТ) током 2 х на собној температури. Пуфер за блокирање је аспириран и кришке су инкубиране са одговарајућим примарним антителом (додатна табела 11) преко ноћи на 4 степена на шејкеру. Кришке су затим испране три пута по 15 минута са пуфером за блокирање, а затим су инкубиране са Алека Флуор 488, 594 или 647 коњугованим секундарним антителима током 2 х на собној температури. Након три испирања по 15 минута са пуфером за блокирање и једног последњег испирања са ПБС током 10 минута, резови су монтирани са флуромоунт-Г (Елецтрон мицросцопиц Сциенцес). Цистанцхе се може побољшатимеморија.

Хибридизација ин ситу (РНАсцопе®)

Узорци су припремљени на основу упутстава произвођача за РНАсцопе® мултиплекс флуоресцентни в2 тест (Адванцед целл диагностицс, САД), уз неколико модификација и комбиновани са протоколом имунохистохемије (ИХЦ). Прво, узорци су обојени на примарна (Арц и ГФП) и секундарна (Алека Флуор 488 и 594, респективно) антитела (као што је описано у ИХЦ протоколу изнад). Резови мозга су уграђени на стакло и

дехидрирано 30 мин на РТ. Затим је повучена баријера око сваког одељка са Иммедге™ хидрофобном оловком и узорци су третирани РНАсцопе® водоник пероксидом 10 минута на собној температури (није примењено узимање циља и третман протеазом). На основу упутстава произвођача, секције су подвргнуте хибридизацији сонде (РНАсцопе® Пробе-Мм-Гриа1, 26241, напредна ћелијска дијагностика), амплификацији и развоју сигнала ХРП-Ц1 коришћењем ТСА® Плус Цианине 5 канала. Цистанцхе може побољшати памћење.

Анализа слике

Слике су добијене коришћењем конфокалних микроскопа ЛСМ 710 или ЛСМ 880 (Зеисс) са објективима од 10×, 20×, 40× или 63× при идентичним поставкама за све услове. Слике су квантификоване коришћењем ИмагеЈ 1.42к или Имариск64 8.1.2 (Битплане, Цирих, Швајцарска). За свако експериментално стање, пет короналних пресека од најмање пет животиња је коришћено за квантификацију. Цистанцхе може побољшати памћење.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6 μМ) да би се уклонило неспецифично обележавање, квантификација двоструко позитивних ћелија је спроведена у ЦА1, ЦА3 и ДГ. Цистанцхе може побољшати памћење.

Квантификација Еиф и Гриа1 протеина/мРНА—Модул површина је коришћен за откривање и 3Д приказивање аксона неурона на основу ГФП сигнала. Позитивне тачке ЕиФ2а, Еиф4Е, Еиф3Е и Гриа{5}} су затим пребројане помоћу модула тачака. Коначно, покренут је модул Спотс Цлосе-То-Сурфаце Кстенсион како би се пронашао подскуп тачака које су ближе површинским објектима од дефинисаног прага од 1уМ, и искључење тачака које су изван овог опсега.

Морфологија кичме — Кичме су класификоване у три типа на основу дужине кичме (Л), пречника главе (Дх) и пречника врата (Дн). Дугачке бодље – Дн=Л, Танке бодље – Л > Дн и Дх веће или једнако Дн, печурке – Дх веће или једнаке 2Дн, Увећане бодље од печурака – Дх веће или једнако 2Дн.Цистанцхе може побољшати памћење.

Цистанцхе може побољшати памћење

Припрема ткива

Хипокампално ткиво је екстраховано и брзо замрзнуто. Након екстракције, узорци су одмах хомогенизовани у {{0}}.5 мЛ ледено хладног ПБС-а са инхибиторима протеазе (Пи) (11836170001, Роцхе ). Да би се смањио утицај сортирања што је више могуће, само у експериментима НЦ-РНАсек и цаптуре-ХиЦ, суспензија је фиксирана са 1 процентом (за НЦ-РНАсек/ХиЦ) или 2 процента (пц-ХиЦ) параформалдехидом током 10 минута, угашена са глицином 2.5М током 5 мин, и два пута испрана са 5 мЛ ПБС. Овај процес чува транскрипциони и хроматински пејзаж и минимизира пристрасност сортирања. За АТАЦсек, РНАсек и цаптуре-ХиЦ, суспензија је центрифугирана на 1200 г, 4 степена, 5 минута и пелета је ресуспендована у 5 мЛ НФ-1 хипотоничног пуфера (0,5 процената Тритон Кс-100/ 0,1 М сахароза/5 мМ МгЦл2/1 мМ ЕДТА/ 10 мМ Трис-ХЦл, пХ 8,0, Пи). Затим је суспензија хомогенизована (тучак А) са 30 потеза и тучак је испран са додатних 5 мЛ НФ-1 пуфера за комбиновано укупно 10 мЛ. Суспензија је сакупљена у конусној епрувети од 15 мЛ, филтрирана са 70 μм мрежастим филтером (08–771-2, Фалцон) и инкубирана на леду 30 мин. Пелетирана језгра (све центрифуге су биле 4 степена, 1.600 × г током 15 минута) су ресуспендоване у 10 мЛ ПБС плус 1 проценат БСА плус Пи и инкубиране на леду 1 х. Језгра су центрифугирана и пелета је ресуспендована у 1 мЛ ПБСТ плус 1 проценат БСА плус Пи и инкубирана са НеуН, Арц и ГФП примарним антителима преко ноћи на 4 степена. Невезана антитела су два пута испрана са 5 мЛ ПБС и коначно ресуспендована у 1 мЛ ПБС плус 1 проценат БСА плус Пи и секундарна антитела током 2-4 х на 4 степена. Након два испирања, језгра су ресуспендована у 0,5 мЛ (ПБС плус 1 проценат БСА плус Пи) и филтрирана са 40 μм мрежастим филтером за ФАЦС сортирање. 4′,6-Диамидин-2′-фенилиндол дихидрохлорид (ДАПИ) је додат директно у ФАЦС епрувете (1:5000, 10236276001, Сигма-Алдрицх). Цистанцхе се може побољшатимеморија.

Проточна цитометрија

За проточну цитометрију, језгра су прво затворена коришћењем параметара подручја пулса напредног и бочног распршења (ФСЦ-А и ССЦ-А) искључујући дебрис, након чега је уследило искључење агрегата коришћењем ширине импулса (ФСЦ-В и ССЦ-В). Затим је коришћено контролно бојење изотипа за постављање НЕУН плус, АРЦ плус и ГФП плус капија. Да би се обезбедила хомогена неуронска популација, НеуН плус популација је затворена пре него што је гејтована популација заснована на АРЦ плус и ГФП плус флуоресценцији. Разврстали смо четири различите популације из три различите временске тачке; Отприлике 1,5–2 сата након излагања ФС и) НеуН плус /ГФП плус ии) НеуН плус /ГФП-. После пет дана, у недостатку преузимања, прикупили смо иии) НеуН плус /ГФП плус. У другој кохорти, мишеви су поново изложени условљеном стимулусу. 1,5–2 сата након поновног излагања прикупили смо ив) НеуН плус /АРЦ плус /ГФП плус. Сва језгра су сортирана у 1,5 мЛ Еппендорф епрувете које садрже; 500 ул ПБС плус 1 проценат БСА плус Пи за АТЦАсек, 200 ул пуфера за варење (РецоверАлл™ комплет за изолацију укупне нуклеинске киселине за ФФПЕ, Цат. АМ1975, Инвитроген) за РНАсек, 500 ул свеже ледено хладне лизе пуфер (10 мМ Трис пХ=8, 10 мМ НаЦл, 0,2 процента Игепал ЦА-630, Пи и ПЦР вода) за Хи-Ц/цаптуре-ХиЦ. Анализа података је извршена са Фловјо (в10).

ЦхИП-кПЦР

Одмах након следећег сортирања, 10,000 ћелија је пелетирано на 4 степена, 1,600 × г током 15 минута, и ресуспендовано у СДС пуферу за лизу. ЦхИП је спроведен на основу упутстава произвођача за ЦхИП-ИТ Хигх Сенситивити® (ХС) комплет (каталошки број 53040, Ацтиве Мотиф, САД) коришћењем анти-Х3К4ме1 (Абцам, аб8895, 1:100) и анти-Х3К27ац (Абцам, аб4729, 1:100) антитела. ЦхИП тестови су изведени у Био-Рад ЦФКС96 цоннецт ПЦР јединици у реалном времену користећи мешавину реагенса СсоФаст™ ЕваГреен® кПЦР (Био-Рад, 172–5202). Узорци су анализирани у три примерка и резултати су нормализовани на улаз. Секвенце парова прајмера за ЦхИП-кПЦР тестове наведене су у додатној табели 12.

Цистанцхе може побољшати памћење

АТАЦ-сек

припрема библиотека—АТАЦ сек библиотеке су припремљене као што је претходно описано у49 са мањим модификацијама. 10,000 ћелије из сваке групе, извучене су из 8-10 различитих мишева и сматране су Н=1. За припрему библиотеке коришћене су 3–4 биолошке реплике (Н=3–4). Одмах након следећег сортирања, ћелије су центрифугиране (4 степена, 1.600 × г током 15 минута) и ресуспендоване у свежем пуферу за хладну лизу од 50 ул (0,15 процената НП-40 уместо Игпал) и љуљане на леду 10 минута . Затим је изведена реакција сегментације (Нектера ДНК припремни комплет 24 реакције, ФЦ-121–1030, Иллумина) у запремини од 25 ул (12,5 ул ТД, 1,25 ул ТДЕ1, 11,25 ул воде без нуклеазе), за 30 мин на 37ц уз лагано љуљање. Проширени фрагменти ДНК су амплификовани и кодирани помоћу ПЦР реакције (1 циклус; 5 мин – 72ц, 30 секунди – 98ц, 10 циклуса; 15 секунди – 98ц, 30 секунди – 60ц, 3 мин – 72ц). Пратећи протокол произвођача, амплификована ДНК је очишћена и пречишћена коришћењем 1,8к АМПуре перли (АмпуреКСП перле, Бецкман Цоултер, А63880). Након КЦ биоанализера за величину и дистрибуцију библиотеке, библиотеке су секвенциониране на платформи Иллумина Нектсек 550 у МИТ БиоМицро центру. Цистанцхе може побољшати памћење.

АТАЦ-сек анализа—Необрађени фастк подаци о 40-бп секвенцирању упарених крајева су усклађени са референтним геномом мм9 миша помоћу Бовтие 2.0 у режиму упареног краја50. Колекција Самтоолс51 коришћена је за сортирање, уклањање ПЦР дупликата (поцрвене), индексирање БАМ датотека (индекс) и израчунавање статистике библиотеке (флагстат, види додатну табелу 13). БАМ датотеке су смањене са правилно поравнатих, упарених и јединствених читања на 50М. Отворени врхови хроматина су анализирани коришћењем софтвера МАЦС252 Диффбинд в1.16.353 је идентификовао Диференцијално доступне регионе (ДАР) са подразумеваним параметрима и подешавањима за коришћење ДЕСек2 (гранична вредност; ФДР < 0,01;="" промене="" на="" преклоп=""> 1,5). Комплетна матрица нормализованих бројева (РПКМ54) је преузета пакетом ДиффБинд. За генерацију великих нумера, фајлови сигнала гомилања (нагомилавање фрагмената на милион читања) у биографском формату су направљени коришћењем МАЦС2 цалл пеак функције са -Б –СПМР заставицама. Затим је генерисано нормализовано обогаћивање преклопа (ФЕ) преко улазних ламбда стаза коришћењем бдгцмп функције МАЦС2 са поставком - м ФЕ. Затим су бедГрапх датотеке конвертоване у бигвиг формат. Цистанцхе може побољшати меморију

ИГВ55 алати су коришћени за визуелизацију великих фајлова. ЦхромХММ56 је коришћен за успостављање модела стања хроматина из две независне студије које су користиле масивно ткиво хипокампуса пре и после шока стопала21,22 и за одређивање понуде обогаћивања набора у односу на државни модел. Анализа обогаћивања мотива57,58 и анотација врхова обављени су помоћу ХОМЕР59 алата. Сви кодови су доступни у додатној софтверској датотеци