Део 4: Мапирање епигеномске и транскриптомске међусобне игре током формирања памћења и опозива у ансамблу хипокампалног енграма
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Молимо кликните овде до 3. дела
РНА-сек
ул воде без нуклеазе), 30 мин на 37ц уз лагано љуљање. Проширени фрагменти ДНК су амплификовани и кодирани помоћу ПЦР реакције (1 циклус; 5 мин – 72ц, 30 секунди – 98ц, 10 циклуса; 15 секунди – 98ц, 30 секунди – 60ц, 3 мин – 72ц). Пратећи протокол произвођача, амплификована ДНК је очишћена и пречишћена коришћењем 1,8к АМПуре перли (АмпуреКСП перле, Бецкман Цоултер, А63880). Након КЦ биоанализера за величину и дистрибуцију библиотеке, библиотеке су секвенциониране на платформи Иллумина Нектсек 550 у МИТ БиоМицро центру.
Цистанцхе и Цистанцхес за побољшање памћења
АТАЦ-сек анализа—Необрађени фастк подаци о 40-бп секвенцирању упарених крајева су усклађени са референтним геномом мм9 миша помоћу Бовтие 2.0 у режиму упареног краја50. Самтоолс колекција51 коришћена је за сортирање, уклањање ПЦР дупликата (рмдуп), индексирање БАМ датотека (индекс) и израчунавање статистике библиотеке (флагстат, види додатну табелу 13). БАМ датотеке су смањене са правилно поравнатих, упарених и јединствених читања на 50М. Отворени врхови хроматина су анализирани коришћењем софтвера МАЦС252 Диффбинд в1.16.353 је идентификовао Диференцијално доступне регионе (ДАР) са подразумеваним параметрима и подешавањима за коришћење ДЕСек2 (гранична вредност; ФДР < 0,01;="" промене="" на="" преклоп=""> 1,5). Комплетна матрица нормализованих бројева (РПКМ54) је преузета пакетом ДиффБинд. За генерацију великих нумера, фајлови сигнала гомилања (нагомилавање фрагмената на милион читања) у биографском формату су направљени коришћењем МАЦС2 цалл пеак функције са -Б –СПМР заставицама. Затим је генерисано нормализовано обогаћивање преклопа (ФЕ) преко улазних ламбда стаза коришћењем бдгцмп функције МАЦС2 са поставком - м ФЕ. Затим су бедГрапх датотеке конвертоване у бигвиг формат.
ИГВ55 алати су коришћени за визуелизацију великих фајлова. ЦхромХММ56 је коришћен за успостављање модела стања хроматина из две независне студије које су користиле масивно ткиво хипокампуса пре и после шока стопала21,22 и да би се утврдило да се преклопи обогаћивање ДАР-а у односу на модел стања. Анализа обогаћивања мотива57,58 и анотација врхова извршена је помоћу ХОМЕР59 алата. Сви кодови су доступни у додатној софтверској датотеци за екстракцију РНК и припрему библиотеке—Одмах након фиксације и сортирања (погледајте припрему ткива), 4 ул протеазе је додато у пуфер за варење (РецоверАлл™ комплет за изолацију укупне нуклеинске киселине за ФФПЕ, Лифе Тецхнологиес, АМ1975) . Узорци су инкубирани у топлотним блоковима 15 минута на 50 степени, затим 15 минута на 80 степени. Затим је додато 0,75 мЛ Тризол ЛС (ТРИзол™ ЛС реагенс, Тхермо Фисхер Сциентифиц, 10296028) и 0,2 мЛ раствора фенола: хлороформа (фенол: хлороформ: изоамил алкохол, 1 фаза, ВВР), након чега је додат сваки узорак К169. снажно мућкање 5 мин на собној температури (РТ). Суспензија је стављена у тешке епрувете са Пхасе лоцк гелом (ПЛГ, 5 Приме, 2302830) и центрифугирана на 13,000рпм током 5 мин. Водена фаза са нуклеинским киселинама је екстрахована из епрувета у свежу Епендорфову епрувету са једнаком количином етанола 100 одсто. Пречишћавање РНК је спроведено Дирецт-зол™ РНА МицроПреп комплетом (Зимо Ресеарцх, Р2060) за пречишћавање РНК, према упутству произвођача. РНК је елуирана (10 ул, ДЕПЦ) и затим ускладиштена на -80 степени. СМАРТер Страндед Тотал РНА-Сек Кит в2 – Пицо Инпут Маммалиан (Цлонтецх, 635006) је коришћен за припрему библиотеке и амплификацију. 3 биолошке реплике (Н=3) су коришћене за припрему библиотеке. Библиотеке су припремљене према упутствима произвођача без додатног корака фрагментације (ФФПЕ, опција 2, види приручник), са исцрпљивањем рибозомалне цДНК и финалном ПЦР амплификацијом (15 циклуса). Библиотеке су секвенциониране на платформи Иллумина ХиСек 2000 у МИТ БиоМицро центру.
РНА-сек анализа—Необрађени фастк подаци су усклађени са референцом мм9 миша
геном користећи Бовтие 2.0. Мапирана очитавања са генских тела (укључујући ексоне и интроне) обрађена су помоћу Цуффлинкс 2.260 и ДЕсек261 са УЦСЦ мм9 референтним генским белешкама да би се проценила количина транскрипта. Диференцијална експресија гена и низводне анализе су изведене коришћењем ДЕсек2 и прилагођених Р скрипти. Релативно обиље транскрипата је мерено фрагментима по килобази егзона на милион мапираних фрагмената (ФПКМ).
За анализу транскрипционих програма, експресија сваког гена је процењена за различитемеморијафазе (Активирано -рано, Активирано -касно, Реактивирано) њиховом лог2 пута променом (лог2ФЦ) из базалног стања. 1095 диференцијално експримираних гена (ДЕГ) је прошло граничне критеријуме, у којима смо приметили бар у једном поређењу П-вредности< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Цистанцхе може побољшати памћење
Снимање конформације хромозома (Хи-Ц)
Језгра из фиксираних ћелија (погледајте припрему ткива) су сортиране у 1,5 мЛ Еппендорф епрувете које садрже 500 ул свежег ледено хладног пуфера за лизу (10мМ Трис пХ=8, 10мМ НаЦл, 0,2% Игепал ЦА{{ 9}}, Пи и ПЦР вода) и замрзнути на сувом леду и чувани на -80ц док се не користе. Хи-Ц библиотеке су припремљене од 100,000 ћелија/групи (сакупљене од две животиње) у две биолошке реплике, коришћењем приручника за Доветаил™ Хи-Ц комплет (в.1.03, Доветаил Геномицс, Чикаго, САД). Шест Хи-Ц библиотека је секвенционирано (упарени крај) на Иллумина Нектсек 500 платформи. ХОМЕР Хи-Ц цевовод је коришћен за филтрирање експерименталних артефаката као што су циркуларизација, самолигације и ПЦР дупликати. Филтрирана очитавања су поравната са референтним геномом миша (мм9) и даље обрађена помоћу ХОМЕР ХИ-Ц цевовода.
ХОМЕР-ови Хи-Ц алати су коришћени за извођење анализе главних компоненти (ПЦА) на Хи-Ц подацима за идентификацију субнуклеарних одељака (А и Б) у резолуцији од 50 Кб (погледајте додатни софтвер). За анализу прекидача одељка, прво смо одузели вредности ПЦ1 између група. Затим смо идентификовали горње БтоА прелазе као регионе са ПЦ1 променом изнад 90. перцентила и горње АтоБ прелазе као регионе са ПЦ1 променом испод 10. перцентила. Пошто су субнуклеарни одељци регулисани као јединице од неколико стотина килобаза, консолидовали смо узастопне АтоБ или БтоА сегменте од 50 Кб који су били на удаљености од 100 Кб један од другог. Одбацили смо консолидоване домене чија је укупна величина била мања од 200 Кб. Прекидач одељка је узет у обзир само ако је негативна вредност трансформисана у позитивну вредност (и обрнуто). Коначно, упоређене су позитивне и негативне вредности прве компоненте између све три популације неурона (Базална, Активирана - рано и Активирана -касно).
Промотер цаптуре Хи-Ц
Након фиксације и сортирања (погледајте припрему ткива) ћелије су сортиране у 1,5 мЛ Еппендорф епрувете које садрже 500 ул свежег ледено хладног пуфера за лизу (10мМ Трис пХ=8, 10мМ НаЦл, 0,2% Игепал ЦА{ {9}}, Пи и ПЦР вода), замрзнути на сувом леду и чувани на -80ц док се не користе. Хи-Ц библиотеке су припремљене од 10,000 ћелија /по групи (Н=3–4), као што је претходно описано62, уз извесне модификације. Узорци су центрифугирани (4 степена, 1,600 г током 20 минута) и пелета је ресуспендована у 400 ул 1,2к Цутсмарт пуфера (Нев Енгланд Биолабс,
САД). Прва рестрикциона дигестија је спроведена као што је описано у оригиналном протоколу са 1500 У ХиндИИИ (Р3104Л, Нев Енгланд Биолабс, САД), као 6-базним резачом (уместо БглИИ у оригиналном протоколу). Након обележавања биотином и везивања преко ноћи (за детаље погледајте оригинални протокол), узорци су центрифугирани (4 степена, 1.600 × г током 15 минута) и пелета је ресуспендована у 25 ул ПБС. Суспензија је инкубирана у 65ц са 3 ул протеиназе К током 12-16 сати. Пречишћавање Хи-Ц ДНК је спроведено као што је описано у оригиналном протоколу са 100 ул зрна стрептавидина (Динабеадс М-280–стрептавидин, Лифе Тецхнологиес, 11205Д). За други рестрикцијски ензим користили смо 4-базни резач Хпицх4В (10 У /по узорку, Р0620С, Нев Енгланд Биолабс, САД). После А-таилинг реакције (погледајте оригинални протокол за детаље), узорци су амплификовани коришћењем ПЦР-а (17 циклуса) и пречишћени АМПуре КСП перлама. Хи-Ц библиотеке су елуиране у 20 ул 10 мМ Трис-ХЦл (пХ 8,5). Дизајн система за хватање мамаца за Промотер Цаптуре Хи-Ц – Листа од 5000 промотера мишјих гена је добијена из претходно објављеног протокола у Сцхоенфелдеру. ет ал.29. Листа садржи само транскрипте са биотипом региона који кодирају протеине, са ХиндИИИ рестрикцијским фрагментима. Дизајниране су две сонде за хватање од 120 бп, по једна на сваком крају фрагмента. Сонде је синтетизовао Агилент Тецхнологиес према СуреСелецт систему за обогаћивање циља (Агилент Тецхнологиес).
Припрема и секвенцирање Хи-Ц библиотеке за хватање промотора - Да бисмо ухватили производе Хи-Ц лигације који садрже секвенце промотера, користили смо претходно објављени протокол29. Укратко, блокатори хибридизације (Агилент Тецхнологиес) додати су Хи-Ц ДНК библиотекама. Хибридизациони пуфер и РНК мамаца за хватање су припремљени према упутствима произвођача (СуреСелецт Таргет Енрицхмент, Агилент Тецхнологиес). Затим, блокатори ДНК/хибридизације Хи-Ц библиотеке су загревани 5 минута на 95 степени, пре него што су снижени на 65 степени. Хи-Ц библиотечка ДНК је помешана са хибридизационим пуфером (претходно загрејаним 5 минута на 65 степени), а затим са прилагођеним системом мамаца за хватање (претходно загрејаним 3 минута на 65 степени), који се састоји од 10,000 биотинилованих РНК циљане на крајеве рестрикционог фрагмента ХиндИИИ 5000 промотора мишјих гена (Агилент Тецхнологиес, погледајте Додатни материјал за дизајн мамаца за хватање). После 24 х на 65 степени у ПЦР машини, извршено је скидање биотина (МиОне Стрептавидин Т1 Динабеадс; Лифе Тецхнологиес) и испирања према СуреСелецт Таргет протоколу за обогаћивање (Агилент Тецхнологиес). Након коначног испирања, перле су ресуспендоване у 30 μЛ НЕБуффер 2 без претходног елуирања ДНК, а ПЦР након хватања (четири циклуса амплификације коришћењем универзалних прајмера илумине) је изведен на ДНК везаној за куглице преко биотиниловане РНК. Библиотеке Цаптуре Хи-Ц су секвенциониране упарени-крај (Нектсек 500, Иллумина).
Хи-Ц анализа промоторског хватања – ХиЦУП цевовод63 је употребљен за обраду необрађених очитавања брзог секвенцирања. Овај цевовод је коришћен за мапирање парова читања у односу на геном миша (мм9), за филтрирање експерименталних артефаката (као што су циркуларизована читања и поновне лигације) и за уклањање дупликата читања. За пц-ХиЦ податке, резултујуће БАМ датотеке су смањене узорковања и обрађене помоћу ЦХиЦАГО верзије 1.2.064, пратећи подразумевана подешавања за позивање значајних интеракција. Сви детаљи о овом цевоводу доступни су од Бабрахам Биоинформатицс
Цистанцхе може побољшати памћење
Стереотакиц Адено-ассоциатед Вирус Ињецтион
АрцЦреЕРТ2 мишеви су анестезирани са авертином и за инфузију вируса ААВ{{1}ЕФ1а-ДИО-хЦхР2-ЕИФП (Серотипе5, добијен из УНЦ вирусног језгра). Прво је направљена мала рупа у лобањи изнад дорзалног хипокампуса (у односу на Брегму: предње-задње -2.0 и медиолатерално ± 1,5), Хамилтон шприц са 33-иглом је спуштен. до -1,8 ДВ и 500 ηл вируса је инфундирано са брзином протока од 50 ηл у минути у оба хипокампуса. Игла је извучена, након периода од 10 минута након ињекције, а мишевима је остављено да се опораве 4 дана.
