Део 5: Мапирање епигеномске и транскриптомске међусобне игре током формирања памћења и опозива у ансамблу хипокампалног енграма
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Проширени подаци Слика 2: Стабилни ДАР-ови су претежно обогаћени за ознаке појачивача
(а) Ток рада за дисекцију проточне цитометрије различитих неуронских популација из хипокампуса, токоммеморијаформирање и проналажење. Репрезентативни ФАЦС графикони који показују експресију целокупне популације (лева табла). Даља селекција је направљена на појединачним језгрима и НеуН плус /ДАПИ плус популацији (средњи панел). На крају, селекција је извршена на затвореној подпопулацији; ГФП плус (подешен на ~2,5 процената од свих ћелија), АРЦ плус /ГФП плус (~0.15 процената од свих ћелија) и језгра су сортиране у 1,5 мл Еппендорф епрувете обложене са 200 ул 1 проценат ПБС.
Кликните да бистеЦистанцхе екстракт у праху побољшава памћење
(б) Венов дијаграм (лево) и табела (десно), илуструју преклапање између ДАР-ова идентификованих у различитим поређењима у паровима токоммеморијаформирање и опозив.
(ц) Статистичка анализа заснована на поновном узорковању извршена је да би се утврдило да ли су обогаћивања стања хроматина у односу на емисије ЦхромХММ (уочене) статистички значајна. Очекивано обогаћивање је израчунато извођењем 10,000 рандомизираних скупова преклапања (пермутација) између локуса „свих доступних локација“ и „свих локација за модификације хистона (тј. све емисије)“ и представљено као хистограм у фигура. Величина узорка сваког рандомизованог скупа одређена је величином ДАР-ова из сваке државе. Израчуната је средња вредност и стандардна девијација узорка (додатна табела 3). Број уочених преклапања између ДАР-ова и сваке емисије је израчунат и представљен као линије. з-сцоре је израчунат као угар; З=(уочене вредности (Кс) – средња вредност узорка (μ))/(стандардна девијација узорка (σ)). з-сцоре Басал вс. Еарли; СЕ 10.5, ВЕ 6.9. Стабле; СЕ 16.9, ВЕ 12.7, све п < 0.0001,="" з-сцоре="" рано="" наспрам="" касно;="" сп="" 91.7,="" вп="" 38.7.="" касно="" наспрам="" реактивираног;="" сп="" 26.8,="" вп="" 28.9,="" све=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">
(д) Кружни графикон приказује проценат различитих стања појачивача, за све стабилне регионе. Преклапање сваког стабилног региона је извршено са претходно објављеним подацима Х3К4ме1 и Х3К27ац ЦхИП-сек, добијеним 1 сат након ФС21. Стања појачивача су класификована као 'примед' – преклапање са регионима означеним само са Х3К4ме1, 'активна' – са Х3К4ме1/ Х3К27ац или 'латентна' – без преклапања.
(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5кб из ТСС). Величина круга означава проценат обогаћења (1–50 процената). Боја означава –лог(П-вредност).
Проширени подаци Слика 3: Координисано прајминг епигенетског стања токоммеморијакодирање и
(а) Својства интеракција откривених у Чикагу у свакој фази (Базална, Активирана – рано, Активирана – касно и Реактивирана). Подразумеване поставке и праг скора од 5 коришћени су у значајном позивању интеракције, обављеном заједно на свим репликама.
(б) Тортни графикон представља проценат свих интеракција откривених у Чикагу које су разграничене или Х3К27ац/Х3К4ме1 (67,5 процената појачивача оцена), Х3К4ме3/Х3К9ац (46,2 процената промотера) или Х3К27ме3 (1,1 проценат репресивних оцена).
(ц) Слика прегледача ВасхУ епигенома, која обухвата око 500 Кб региона око гена Еиф4е2. Лукови показују значајне уобичајене (црвени правоугаоник) и јединствене (стрелица) појачиваче који су у интеракцији са промотерима (плави правоугаоник).
(д) Примери интеракција које је назвао Чикаго. Графичке приказе које приказују све читане бројеве од мамца-отхер-енд (појачивача), унутар 500–700 кб (узводно и низводно) од Гринк3 и Ввц2 промотери. Значајне интеракције које је открио Чикаго (скор већи или једнак 5) су приказане црвеном бојом, а интеракције испод прага (3 мање или једнако скор < 5)="" су="" приказане="" плавом="" бојом.="" сиве="" линије="" показују="" очекивани="" број,="" а="" испрекидане="" линије="" горњу="" границу="" интервала="" поверења="" од="" 95="" процената.="" (е)="" анализа="" обогаћивања="" преклапања="" између="" појачивача="" у="" интеракцији="" и="" дар-ова,="" користећи="" процедуру="" пермутације="" на="" 10,000="" насумично="" одабраним="" скуповима="" доступних="" локација.="" хистограм="" представља="" дистрибуцију="" случајног="" узорковања="" доступних="" локација="" за="" свако="" стање="" (базално="" наспрам="" активирано="" -="" рано,="" активирано="" -рано="" наспрам="" активирано="" -касно,="" активирано="" -касно="" наспрам="" реактивирано,="" стабилно).="" број="" преклапаних="" локуса="" представљен="" је="" обојеним="" линијама="" од="" базалних,="" активираних="" -раних,="" активираних="" -касних="" и="" реактивираних="" неурона.="" дар-ови="" бас-а="" у="" односу="" на="" активирано="" -="" рано="" (з-сцоре;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" дар-ови="" активираног="" -рано="" у="" односу="" на="" активирано="" -касно="" (з-сцоре;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" дар-ови="" активираног="" -касно="" наспрам="" реактивираног="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" дар="" стабилан="" (з-сцоре;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">
Проширени подаци Слика 4: Промене хроматина које се јављају током ране фазе омогућавају
(а) Анализа преклапања између имена гена из диференцијалне анализе у паровима и претходно објављених података и) активираних ћелија ДГ гранула 1 х након новог излагања32 ии) 24 х након ФС20 и иии) након продужене стимулације (6 х) култивисаног кортикала миша неурона са КЦл33. Анализа је спроведена помоћу ГенеОверлап Р пакета.
(б) Егзоничко (црвено) и интронично (плаво) очитавање су квантификовано одвојено у свим условима и упоређено са транскрипционом активношћу мереном помоћу ДЕсек2. Читања су нормализована (РПКМ) и промене лог2ФЦ су представљене за свако стање. виолински заплет означава средњу вредност,
интерквартилни опсег, и минимум и максимум, једносмерна АНОВА (параметарска, неупарена), базална у односу на рани; Ф (5, 248)=389.9. Рано наспрам касно; Ф (5, 2374)=2183. Касно у односу на поново активирано. Ф (5, 1357) {{10}}.5, Сви Пс < 0.0001.="" бонферонијева="" вишеструка="" поређења.="" нс="није" значајно,="" ***п=""><>
(ц) Односи егзон/интрон су мерени у сваком кластеру у свим условима (Лог2ФЦ скала). дијаграм виолине показује средњу вредност, интерквартилни опсег и минимум и максимум, једносмерни АНОВА (параметарски, неупарени), Ф (5, 1143)=260.2, П<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">
(д) Анализа преклапања између ДАР-ова и ДЕГ-ова током различитихмеморијафазе. ДАР-ови на интергенским и интронским регионима су мапирани у њихове одговарајуће гене помоћу пц-ХиЦ интеракцијских мапа. Анализа преклапања је спроведена помоћу ГенеОверлап Р пакета. П-вредност (бројеви) и однос шансе (боја) из Фишеровог егзактног теста су представљени у топлотној мапи. нс – није значајно.
(е) Пирсонова корелација између лог2ФЦ вредности ДАР-а и лог2ФЦ ДЕГ-ова који су означени том региону (интергенски региони су мапирани преко пц-ХиЦ скупа података). Промене приступачности хроматина су упоређене са рашчлањеним егзонским читањима (црвена линија), интроничким читањима (плаве линије) и укупним променама транскрипције (и интроничним и егзонским читањима) мереним помоћу Деск2 (сива линија). Све р и п-вредности су наведене у додатној табели 9.
Проширени подаци Слика 5: Транскрипционе промене у активираним касним неуронима корелирају више
(а) Егзонска (црвена) и интроничка (плава) очитавања су квантификована одвојено у свим условима за сваки од кластера идентификованих на слици 5Б. Читања су нормализована (РПКМ) и промене лог2ФЦ су представљене за сваки кластер.
(б) Односи егзон/интрон су мерени у сваком кластеру у свим условима. Виолин дијаграм показује средњу вредност, интерквартилни опсег и минимум и максимум, н=3 биолошки независних узорака једносмерни АНОВА (параметарски, неупарени), Дв – касни кластер; Ж (3, 968)
652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">
Проширено Подаци Шипак. 6: Изразито временски транскрипциона програме су биће синхронизовано до
зависан начин у присуству тамоксифена. На десном панелу, репрезентативне ИХЦ слике ДГ. Зелена – ААВ-еИФП, црвена – ендогени лук. Линија скале представља 50 μм.
(б) Процена морфологије бодљи током различитихмеморијафазе. Десни панел приказује једну еИФП плус дендритичну осовину са различитим типовима бодљи (Стубби, Тхин, Мусхроом, Енларгед печурка). Линија скале представља 5 μм. бокплот показује средњу вредност, интерквартилни опсег и минимум и максимум, Активирано -рано: н=4 мишеви /5 секција по животињи, Активирано -касно: н=4 мишеви /4 секције по животињи, Реактивирано: н=4 мишева /2 секције по животињи. једносмерна АНОВА (параметријска, неупарена), Стубби; Ф (2, 36)=2.313, П=0.1135. Тхин; Ф (2, 36)=35.12, П<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">
(ц) репрезентативне ИХЦ слике и квантификација нивоа протеина два члана породице ЕИФ; (лево) Еиф2а и (десно) Еиф3е. Линија скале представља 10 μм. Подаци за дендритичну осовину су представљени као однос броја и дужине (μМ). н=4 мишеви /5 секција по животињи, боксплот показује средњу вредност, интерквартилни опсег и минимални и максимални, једносмерни АНОВА (параметријски, неупарени) са Бонферонијевим тестом вишеструких поређења, нс - није значајно, Еиф2а Схафт; Ф (2, 20)=4.484, П=0.0246. Сома; Ф (2, 21)=19.58, П < 0,0001.="" (активирано="" -рано="" наспрам="" активирано="" -касно="" *п="0.0142," активирано="" -рано="" наспрам="" реактивирано="" *п="">< 0,0001,="" активирано="" -касно="" наспрам="" реактивирано="" *п="0.0303)." еиф3е="" схафт;="" ф="" (2,="" 14)="1.983," п="0.1745." сома;="" ф="" (2,="" 23)="8.309," п="0.0019," (активирано="" -рано="" наспрам="" поново="" активирано="" *п="0.0057," активирано="" -касно="" наспрам="" поново="" активирано="" *п="" {{="">
(д) Тортни графикон представља проценат увећаних бодљи печурака (Дх већи од или једнак 3Дн) и печурака из Активираних -касних и Реактивираних неурона.
(е) Репрезентативне слике (леви панел) и квантификација (десни панел) нивоа Гриа1 мРНА, током различитих фазамеморија. Подаци су представљени као однос између неколико тачака и дужине дендритске осовине. Линија скале представља 10 μм. Н=4 мишева /5 секција по животињи, дијаграм приказује средњу вредност, интерквартилни опсег и минимум и максимум, Схафт; једносмерна АНОВА (параметријска, неупарена) Ф (2, 15)=10.41, П=0.0015. Бонферонијев тест вишеструких поређења, **П=0.0011. доњи панел - Сома; једносмерна АНОВА Ф (2, 12)=0.13, П=0.88.
Проширени подаци Слика 7: Интеракције са различитим комбинаторним појачивачима воде до усмерености
(а) Венов дијаграми показују проценат преклапања између приступачности хроматина (ДАР) у свиммеморијафазе (БАС вс. Активирано -рано, светлозелени мрежни круг; Активирано -рано вс. Активирано -касно, тамнозелени мрежни круг; Активирано -касно вс. Реактивирано, наранџасти мрежни круг) и укупне промене транскрипције из свих идентификованих кластера (Дв – касно, Уп-касно, Стабилно, Реактивација, плави мрежасти круг). Интергени и интронски ДАР-ови су мапирани у њихове одговарајуће гене помоћу пц-ХиЦ интеракцијских мапа. Проценат преклапања је израчунат из свих идентификованих ДЕГ-ова у кластерима (н=1095).
(б) Анализа преклапања између ДАР-ова (у паровима) и ДЕГ-ова из сваког кластера. Интергени и интронски ДАР-ови су мапирани у њихове одговарајуће гене помоћу пц-ХиЦ интеракцијских мапа.
Анализа преклапања је спроведена помоћу ГенеОверлап Р пакета. П-вредности и Јаццард вредности (боја) из Фишеровог егзактног теста су представљене на топлотној мапи (лево). Проценат преклапања је израчунат из свих идентификованих ДЕГ-ова у кластерима (десно).
(ц) Репрезентативна слика хроматина и транскрипционих промена локуса Габрб3 из кластера Дв-лате. Док су интеракције у раном стању биле између промотера и појачивача са транскрипционим активаторима (Ап1), интеракције у касном стању биле су са транскрипционим репресорима (Слуг). Трагови прегледача горњег ИГВ генома (љубичаста – базална, светло зелена – Активирана – рано, тамно зелена – Активирана – касно и наранџаста – Реактивирана) представљају промене транскрипције (нцРНА-сек), средњи трагови показују динамику приступачности хроматина (АТАЦ-сек) на промотер (црвени правоугаоник) и појачивачи (сиви правоугаоник). Значајне интеракције промотера и појачивача су представљене као лукови (траке ВасхУ претраживача). Доња трака представља мотиве који су идентификовани помоћу ХОМЕР алата (Слуг, Ап1 и Рест).
(д) Агрегације за појединачне мотиве. Вредности обогаћивања (мотиви по бп/ по пику) шест одабраних мотива (два репресора, два активатора и два бивалентна) процењене су око центра пикова (-/ плус 4000 бп) из сваког кластера.
Проширени подаци Слика 8: Предложени модел приступачности хроматина, интеракције промотера и појачивача и динамике транскрипције неурона хипокампалног меморијског енграма
региона, који носе мотиве активатора транскрипције. Ово репрограмирање промотера-појачивача резултира повећаном експресијом гена што вероватно омогућава стабилизацијумеморија. Подсетимо - реактивирани енграмски неурони су користили подскуп интеракција промотор-појачивача, што је повезано са транскрипционим променама укљученим у транспорт мРНК у синаптичке одељке и транслацију протеина. Транскрипциони фактор – ТФ, Е(1–3) – различити појачивачи који ступају у интеракцију са истим промотером, црвени – репресори транскрипције, плави – активатори транскрипције.
Додатни материјал
Погледајте веб верзију на ПубМед Централ за додатни материјал.
Признања
Захваљујемо Е. Ниедерст, Ј. Пеннеи, С. Баркер, РТ Стотт, М. Вицтор, А. Ватсон, Н. Дедић, Е. Лоцксхин и члановима Л.ХТ Лаб-а на корисним дискусијама и сугестијама. Захваљујемо се менаџерима лабораторије И. Зхоу, Е. МцНамара на одржавању колоније мишева. Захваљујемо се П. Аутиссиер-у (Вхитехеад Институте) на помоћи око ФАЦС-а. Финансирање: Ове радове су подржали НИХ ГРАНДС РФ1АГ062377, АФ1АГ054012, РФ1АГ064321, РФМАГ064321, РФМАГ064321, РФМАГ064321, Фондација ЈПБ-а, Алана Довн СИНДРОМЕ Ресеарцх Фондација за синдром Сондинг Сонг Довн Довн Сонг АЛЗХЕИМЕР-ове фондове Цонсортиум Цуре Алзхеимер-а, и Роберт А и Ренее Е. Породична фондација Белфер за ЛХ.Т. Овај рад је такође подржан и НИХ ГРАНСС Р01АГ058002, У01НС110453, Р01АГ062335, МК и ЛХ.Т и Р01АГ067151, Р01МХ109971, Р01МХ109509, Р01МХ119509, Р01МХГ008155, Р01ХГ009415О, У24ХГ009446 до МКВД-а подржава Аарф {-19-618751 Грант у АРЗХЕИМЕР-овом удружењу . ХСМ подржава Бурроугхс Веллцоме Фунд и УНЦФ-Мерцк постдокторска стипендија. Ц. А подржава ЈПБ фондација. РМР подржава НИХ Т32 грант 5Т32ХД09806. Комплет за припрему Хи-Ц библиотека је примљен као великодушан поклон од ДоветаилТМ (в.1.03, Доветаил Геномицс, Чикаго, САД). Захваљујемо се тиму Доветаил на корисној дискусији и сугестијама.