Део Ⅰ Метаболичко разумевање генетске дисрегулације у микроокружењу тумора карцинома бубрега бубрега

Апстрактан

Метаболичка дисрегулација је обележје карцинома укључујући КИРЦ, посебно узроковано променама у метаболичким генима. Тренутно постоји недостатак консензуса између метаболичких потписа у микроокружењу тумора. У овој студији, приметили смо значајне корелације диференцијално експримираних метаболичких гена (ДЕмГс) између КИРЦ-а и сродних нормалних узорака. Укратко, прикупили смо скупове метаболичких гена кроз РНА-сек податке КИРЦ-а и нормалних ткива из ТЦГА, након чега је уследило идентификовање ДЕмГ-ова повезаних са КИРЦ-ом. Затим, пацијенти су класификовани у три кластера, а користећи ВГЦНА, идентификовали смо метаболичке гене укључене у преживљавање међу различитим кластерима.

Даље, истражили смо преживљавање и клиничке параметре заједно са имунолошком инфилтрацијом у кластерима. У исто време, конструисали смо и потврдили модел предвиђања заснован на овим ДЕмГ. Ове анализе су откриле да су пацијенти са високом експресијом ДЕмГс показали лоше преживљавање, док је инфилтрација мање имуних ћелија била повезана са метастазом КИРЦ-а. На крају смо идентификовали НУДТ1 као хуб ген јер је показао значајно високу експресију у КИРЦ узорцима, као и повезан са преживљавањем и прогнозом пацијената. Даља анализа је открила онкогену улогу НУДТ1 у 786-О и АЦХН ћелијама. Стога закључујемо да би НУДТ1 могао бити потенцијални дијагностички и прогностички маркер за КИРЦ.

Кључне речи

Метаболичка дисрегулација; Диференцијално изражени метаболички гени (ДЕмГс); Степен опстанка; НУДТ1;Цистанцхе користи.

Кликните овде да сазнатеЦистанцхеови ефекти

Увод

Карцином реналних ћелија бубрега (КИРЦ) је врста карцинома бубрежних ћелија (РЦЦ), који се сматра једним од уобичајених карцинома који чини 70-80 процената случајева [1], рангиран као 16. најчешћи узрок смртности од рака широм света [2]. Карцином бубрежних ћелија (РЦЦ) је најчешћи тип рака бубрега и чини 90 процената случајева рака бубрега [3]. Недавно се широко користи идентификација потенцијалних маркера код карцинома заснована на биоинформатици, али је идентификовано само неколико поузданих биомаркера КИРЦ-а или већина маркера до сада није у потпуности валидирана. Дакле, биоинформатичке анализе заједно са експерименталним валидацијама су неопходне да би се разјаснио потенцијални механизам биогенезе и прогресије КИРЦ-а [4]. Дубоко истраживање микроокружења тумора и развој имунотерапије омогућили су проучавање интеракције између тумора и имуног система [5]. Ипак, многи од идентификованих биомаркера нису проучавани због њиховог утицаја на ћелијски фенотип и одговарајуће молекуларне механизме у КИРЦ-у [6]. Међутим, прогноза пацијената са КИРЦ-ом је слабо схваћена и укупно 5-годишње преживљавање је мање од 10 процената након прве дијагнозе [7, 8]. Генерално, нормална ткива претежно садрже високе нивое антиангиогених фактора. Поремећај нивоа ових фактора може активирати проангиогене факторе који даље повећавају деобу ћелија абнормалном брзином што доводи до формирања тумора [9]. У овом процесу туморске ћелије експримирају висок ниво проангиогеног фактора раста и овај ефекат подржава развој нових крвних судова у туморима [10]; тако почиње развој тумора. Дакле, многи други фактори су укључени у туморигенезу, укључујући инфилтрацију имуних ћелија и експресију различитих метаболичких гена. Добро је познато да присуство различитих типова имуних ћелија у микроокружењу тумора у великој мери утиче на прогресију тумора и имунотерапију; тако, промене гена повезаних са имунитетом такође утичу на пропорцију и функцију имуних ћелија у микроокружењу тумора [11]. На пример, инфилтрација имуних ћелија у микроокружење тумора значајно утиче на развој глиома [12]. Упркос недостатку интересовања за метаболичке гене који утичу на рак, тренутне студије су обновиле ту свест о раку као метаболичком поремећају [13, 14]. Ове студије пружају основу за укључивање метаболичког репрограма као новог обележја малигне трансформације [15]. Међутим, експресија свих метаболичких гена или путева међу различитим ткивима, укључујући туморе и нормална ткива, разликује се једни од других и углавном је неистражен, посебно у КИРЦ-у.

Све у свему, постоји мањи број поузданих биомаркера доступних за предвиђање прогнозе и имунотерапијских одговора у КИРЦ; стога је тешко постићи потпуни клинички успех. Стога, свеобухватне биоинформатичке студије заједно са експерименталним валидацијама могу разјаснити потенцијалне механизме биогенезе и прогресије КИРЦ-а. Дакле, тренутна студија има за циљ свеобухватну процену ефеката метаболичких путева на метаболичке транскрипционе профиле у КИРЦ-у у поређењу са њиховим одговарајућим нормалним ткивима. Овде смо успешно не само одвојили различите локације болести или различите молекуларне подтипове исте болести, већ смо такође предвидели одговор на терапију усмерену на метаболизам. Ово представља нови начин идентификације механизма којим су метаболички путеви поремећени у малигному и нуди нове мете за клиничке интервенције.

Стандардизед Цистанцхе

Материјал и методе

1. Прикупљање података.

Подаци о секвенцирању РНК (ФПКМ) релевантни за КИРЦ су директно преузети из Атласа генома рака (ТЦГА). Након тога, подаци су обрађени у складу са жељеним низводним апликацијама. Поред тога, клиничкопатолошки подаци за одговарајуће КИРЦ пацијенте, укључујући пол, расу, старост, локацију тумора, хистолошку класификацију, степен диференцијације, стадијум тумора и информације о преживљавању, добијени су од УЦСЦ Цанцер Бровсер. Да би се стекао увид у метаболичку хетерогеност пацијената са КИРЦ, скупови метаболичких гена су узети из претходних публикација [16, 17]. Графички сажетак ове студије приказан је на Додатној слици 1, а детаљан ток рада прикупљања података и студија процеса низводно приказан је на Додатној слици 2.

2. Идентификација диференцијално изражених метаболичких гена (ДЕмГс).

Скупови метаболичких гена су идентификовани пресеком два скупа података и коришћени за ДЕГ анализу између туморских и нормалних узорака. Касније смо такође идентификовали ДЕмГ користећи ВГЦНА, а на основу начина преживљавања, пацијенти су их класификовали у три кластера. Укратко, пацијенти су подељени у три кластера, и то кластер Ц1, кластер Ц2 и кластер Ц3. Да би се идентификовали ДЕГ, коришћени су линеарни модели коришћењем лимма пакета Р. Стопа лажног откривања (ФДР) прилагођена п-вредност < 0.05 у комбинацији са истовременом апсолутном вредношћу лог2 пута промене, логФЦ > 1 и логФЦ < -1 постављени су као праг за идентификацију ДЕГ. Вулканске парцеле су направљене помоћу ггплот2. Гени са логФЦ > 1 сматрани су високорегулисаним, а они са логФЦ < -1 су додељени као нискорегулисани гени.

3. Анализе функционалног обогаћивања и интеракција протеин-протеин.

Анализе обогаћивања ГО и КЕГГ терминима обављене су преко Р пакет Цлустер профила. Термини ГО су подељени у три категорије укључујући молекуларне функције (МФ), ћелијске компоненте (ЦЦ) и биолошке процесе (БП). Да бисмо утврдили значајне разлике и корелације ДЕмГ између тумора и нормалних ткива, користили смо рачунарски софтвер ГСЕА (анализа обогаћивања генског скупа). КЕГГ и ГО (Гене Онтологи) анализе обогаћивања ДЕГ-а су извршене да би се идентификовали потенцијални путеви и функције. Штавише, апликација цистоскопа је коришћена за конструисање мреже протеин-протеин интеракције (ППИ) ДЕмГ. Почетни ППИ је добијен из базе података СТРИНГ. Највиша граница поверења је постављена на 0.9.

4. Анализа преживљавања.

Диференцијално експримирани гени код пацијената са карциномом бубрега идентификовани су преко лимма пакета, а различито експримирани гени су анализирани коришћењем ВГЦНА пакета за коекспресију, да би се конструисала коекспресиона мрежа која је идентификовала укупно 6 модула.=5 и мрежа је мрежа без обима. Прогностички значај ДЕмГ идентификованих од стране ВГЦНА у режиму преживљавања одређен је Каплан-Меиеровим (КМ) дијаграмима са тестом лог ранга.

Цистанцхе пилуле

5. Анализа имунолошке инфилтрације.

Имунске и стромалне ћелије су израчунате коришћењем Р пакета, "кЦЕЛЛ; " узорци са п < 0:05 су одабрани за даљу анализу. Штавише, имуне ћелије које садрже биолошке маркере анализиране су помоћу Р пакета ГСВА. Штавише, да бисмо анализирали чистоћу тумора, користили смо алгоритам ЕСТИМАТЕ да проценимо стромалне и имуне резултате серије КИРЦ ткива.

6. Конструкција модела предвиђања.

Диференцијално експримирани метаболички гени су добијени из података секвенцирања РНК КИРЦ тумора са информацијама о преживљавању, а пацијенти су насумично подељени у кохорте за обуку и тестирање користећи Р пакет "царет;" затим је извршена униваријантна анализа преживљавања на ДЕмГс. Надаље, ЛАССО анализа је изведена помоћу Р пакета "глмнет;" а за оптимизацију модела предвиђања коришћен је постепени пропорционални модел опасности.

7. Ћелијска култура.

Ћелијске линије карцинома бубрега код људи 786-О и АЦХН су купљене од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ) (Манассас, ВА, САД). 786-О ћелијске линије су култивисане у медијуму РПМИ 1640 (кат. бр. 11875093, Инвитроген, Царлсбад, ЦА, Сједињене Државе) са додатком 10% феталног говеђег серума (кат. бр. 04-001- 1АЦС, Биолошка индустрија, Израел). АЦХН ћелијске линије су култивисане у МЕМ медијуму (кат. бр. 41500034, Инвитроген, Царлсбад, ЦА, Сједињене Државе) са додатком 10 процената феталног говеђег серума. Све културе су инкубиране на 37 степени Ц и 5 процената ЦО₂у влажном инкубатору.

8. Квантитативни ПЦР у реалном времену.

Укупна РНК из КИРЦ ћелијских линија и ткива изолована је коришћењем ТРИзола (кат. бр. 9109; ТаКаРа, Токио, Јапан) према протоколима произвођача. РТ-кПЦР је изведен коришћењем КуантиНова СИБР Греен ПЦР комплета (кат. бр. 208054, КИАГЕН, Дизелдорф, Немачка). Релативна експресија гена израчуната је помоћу 2^−ΔΔЦтметодом. Секвенце прајмера су наведене у додатној табели 1.

9. Тест виталности ћелије.

Цитотоксичност након трансфекције НУДТ1 сиРНА у 786-О и АЦХН је одређена коришћењем комплета за бројање ћелија-8 (ЦЦК-8) теста (кат. бр. Ц0038, Беиотиме Биотецхнологи Цо. Лтд., Кина). НУДТ1 сиРНА секвенце су дате у Додатној табели 1. Синтетизоване су од ГенеПхарма (Шангај, Кина). Укратко, обе ћелијске линије 786-О и АЦХН у логаритамској фази раста (24 х након трансфекције сиРНА) су сакупљене и распоређене у 96-плоче за културу ћелија (1000 ћелија/бунарић). Следећег дана, 10 ул ЦЦК-8 је додато у сваки бунар. Након инкубације на 37 степени Ц током наредна 2 х, оптичка густина (ОД) на 450 нм ћелија је детектована помоћу читача микроплоча (Био-Рад Лабораториес, Рицхмонд, ЦА, УСА).

10. Тест миграције ћелија, инвазије и апоптозе.

КИРЦ ћелије {{0}}О и АЦХН су трансфектоване за обарање НУДТ1 посредовано сиРНА. После 24 х од трансфекције, ћелије су засејане у 6- плоче са бунарима за тест зарастања рана. Након што су ћелије добиле 100% конфлуенције, ране су настале у ћелијама као монослој коришћењем врха пластичне пипете. Ћелије су затим испране ПБС-ом и култивисане још 48 х. Удаљеност затварања ране је визуелизована микроскопом и фотографисана за мерење ефекта НУДТ1 нокдауна на КИРЦ 786-О и АЦХН ћелије. Ћелијска миграција и инвазија су изведене коришћењем трансвелл 24-бунастих плоча (Цорнинг, Нев Иорк, НИ). Укратко, једнак број ћелија је култивисан у медијуму без ФБС у горњој комори, а миграција ћелија је примећена у доњој комори трансбула где је медијум допуњен са 10 процената ФБС. Трансвелл коморе су пажљиво испране и обојене са 0,2 процента кристално љубичасте боје, визуализоване и фотографисане; касније, разлике између мигрираних ћелија између негативне контроле и НУДТ1 нокауна су одређене једноставним бројањем ћелија. Тест апоптозе је изведен након 72 х трансфекције, ћелије су сакупљене, испране и ресуспендоване у ледено хладном ПБС. Ћелије су затим детектоване комплетом за детекцију апоптозе (кат. бр. КГА1013, КеиГен БиоТецх, Нањинг, Кина) према упутствима произвођача и испитане проточном цитометријом (ФАЦСцан; БД Биосциенцес). Сви експерименти су изведени у три примерка.

11. Статистичка анализа.

Све статистичке анализе су обављене на ГрапхПад призми (В7.0) и Р (3.6.4), Вилцок тест је коришћен за поређење инфилтрације имуних ћелија у нормално и туморско ткиво и хи-квадрат тест је урађено за проучавање корелације између инфилтрације имуних ћелија и патолошких параметара. Анализа варијансе је коришћена за поређење имунолошког скора, стромалног скора и чистоће тумора између три кластера. За анализу преживљавања, п-вредност је израчуната коришћењем теста лог ранга. П-вредност од<0.05 was considered statistically significant.

Цистанцхе суплементи

Референце

[1] В. Нерицх, М. Хугуес, Т. Наи, ет ал., "Клинички утицај циљаних терапија код пацијената са метастатским карциномом реналних ћелија чистих ћелија", Онцотаргетс анд Тхерапи, вол. 7, стр. 365–374, 2014.

[2] А. Знаор, Ј. Лортет-Тиеулент, М. Лаверсанне, А. Јемал и Ф. Браи, "Међународне варијације и трендови инциденције и морталитета карцинома бубрежних ћелија", Еуропеан Урологи, вол. 67, бр. 3, стр. 519–530, 2015.

[3] Б. Љунгберг, Л. Албигес, И. Абу-Гханем, ет ал., „Смернице Европског удружења уролога о карциному бубрежних ћелија: ажурирање за 2019.“, Еуропеан Урологи, вол. 75, бр. 5, стр. 799–810, 2019.

[4] В. Зхенг, С. Зханг, Х. Гуо, ет ал., "Мулти-омска анализа карактеристика туморске ангиогенезе и потенцијалних механизама епигенетске регулације код карцинома реналних ћелија," Ћелијска комуникација и сигнализација: ЦЦС, вол. 19, бр. 1, стр. 39, 2021.

[5] Ј. Галон и Д. Бруни, "Приступи лечењу имуних врућих, измењених и хладних тумора комбинованим имунотерапијама", Натуре Ревиевс Друг Дисцовери, вол. 18, бр. 3, стр. 197–218, 2019.

[6] В. ду, Л. Зханг, А. Бретт-Моррис ет ал., "ХИФ покреће таложење липида и рак у ццРЦЦ преко репресије метаболизма масних киселина," Натуре Цоммуницатионс, вол. 8, бр. 1, стр. 1769, 2017.

[7] А. Јемал, Р. Сиегел, Е. Вард, ет ал., "Цанцер статистицс, 2008," ЦА: А Цанцер Јоурнал фор Цлиницианс, вол. 58, бр. 2, стр. 71–96, 2008.

[8] И. Луцца, Т. Клатте, Х. Фајковић, М. де Мартино, и СФ Схариат, "Ерратум: Родне разлике у инциденци и исходима рака уротела и бубрега", Натуре Ревиевс Урологи, вол. 12, бр. 12, стр. 653, 2015.

[9] ИЈ Фидлер, "Ангиогенеза и метастазе рака", Цанцер Јоурнал, вол. 6, додатак 2, стр. С134–С141, 2000.

[10] Ц. Кут, Ф. Мац Габханн и АС Попел, "Где је ВЕГФ у телу? Мета-анализа дистрибуције ВЕГФ-а код рака", Бритисх Јоурнал оф Цанцер, вол. 97, бр. 7, стр. 978–985, 2007.

[11] Ф. Рен, К. Зхао, М. Зхао, ет ал., "Профилирање имунолошке инфилтрације код рака желуца и њихове клиничке импликације", Цанцер Сциенце, вол. 112, бр. 9, стр. 3569–3584, 2021.

[12] Кс. Ге, З. Ванг, Р. Јианг ет ал., "СЦАМП4 је нови прогностички маркер и повезан је са прогресијом тумора и имунолошком инфилтрацијом у глиому," Тхе Интернатионал Јоурнал оф Биоцхемистри & Целл Биологи, вол. 139, 2021.

[13] МГ Вандер Хеиден и РЈ ДеБерардинис, "Разумевање пресека између метаболизма и биологије рака", Целл, вол. 168, бр. 4, стр. 657–669, 2017.

[14] ДС Висхарт, "Да ли је рак генетска болест или метаболичка болест?" биомедицина, вол. 2, бр. 6, стр. 478-479, 2015.

[15] Д. Ханахан и РА Веинберг, "Обележја рака: следећа генерација", Целл, вол. 144, бр. 5, стр. 646–674, 2011.

[16] Кс. Пенг, З. Цхен, Ф. Фарсхидфар, ет ал., "Молекуларна карактеризација и клиничка релевантност подтипова метаболичке експресије код рака код људи," Целл Репортс, вол. 23, бр. 1, стр. 255–269.е4, 2018.

[17] С. Хаидер, А. МцИнтире, РГ ван Стипхоут, ет ал., "Геномске промене леже у основи метаболичке промене пан-канцера повезане са хипоксијом тумора", Геноме Биологи, вол. 17, бр. 1, стр. 140, 2016.

Јунвеи Ксие,1,2,3,4,5 Линганг Цуи,6 Схаоканг Пан,1,2,3,4,5 Донгвеи Лиу,1,2,3,4,5 Фенгкун Лиу,1,2,3,4 ,5 и Зхангсуо Лиу 1,2,3,4,5

1 Одељење за нефрологију, Прва придружена болница Универзитета Џенгџоу, Џенгџоу 450052, Кина

2 Истраживачки институт за нефрологију, Универзитет Џенгџоу, Џенгџоу 450052, Кина

3 Истраживачки центар за болести бубрега, Џенгџоу, 450052 Хенан, Кина

4 Кључна лабораторија за прецизну дијагнозу и лечење хроничне бубрежне болести у провинцији Хенан, Џенгџоу 450052, Кина

5 Основна јединица Националног клиничког медицинског истраживачког центра за бубрежне болести, Џенгџоу 450052, Кина

6 Одељење за урологију, Прва придружена болница Универзитета Џенгџоу, Џенгџоу 450052, Кина