Део Ⅰ Ефекти нивоа протеина и влакана у исхрани на перформансе раста, појаву гихта, заједнице цревних микроба и имунорегулацију у оси гуслинга

Апстрактан

Садашња студија је процењивала ефекте нивоа протеина и влакана у исхрани на перформансе раста, појаву гихта, цревне микробне заједнице и имунорегулацију у оси црева и бубрега код гусака. Потпуно рандомизовани факторски дизајн од 2 £ 3 је усвојен са 2 нивоа ЦП (180 [18ЦП] и 220 [22ЦП] г/кг) и 3 нивоа сирових влакана (ЦФ) (30 [низак ЦФ], 50 [средњи ЦФ], и 70 [високи ЦФ] г/кг). Дијета са високим ЦП или ниским ЦФ предиспонирала је гуске на гихт. Дијета са високим садржајем протеина погоршала је функцију бубрега; концентрације УА и Цр у серуму, као и активност КСОД код 9-дневних гушчара храњених храном са 22 процента ЦП су значајно повећане. Иако нивои ЦФ од 3 до 7 процената нису директно утицали на здравље бубрега, повећање нивоа ЦФ могло би убрзати повећање пробиотика у цекуму гушчића и задржати злонамерне бактерије, ублажавајући дисбиозу црева узроковану исхраном са високим садржајем протеина. Анализа микробиоте цекалног црева путем секвенцирања 16Ср РНК открила је да је бројност ентерокока у 22ЦП групи била већа од оне у групи са 18ЦП, али се смањивала са повећањем нивоа ЦФ на д 9. Обиље Лацтобациллуса се повећавало са повећањем нивоа ЦФ. Поред тога, веће концентрације ЛПС-а и проинфламаторних цитокина у серуму и повећани нивои експресије мРНК у ткивима цекалног црева, крајника и бубрега указују на то да исхрана са високим садржајем протеина може да активира ТЛР4/МиД88/НФкБ пут и индукује и цревну и бубрежну упалу код младих гушчара. Утврђено је да се концентрације ЛПС у серуму на д 9 смањују са повећањем ЦФ, иако промена нивоа ЦФ у исхрани није директно утицала на серумске имунолошке индексе гушара. У закључку, исхрана са високим ЦП је имала негативан ефекат на појаву гихта, микробне заједнице и имунорегулацију у осовини црева и бубрега код гушара, док је адекватно повећан ниво дијеталних влакана помогао у одржавању равнотеже црева и смањењу концентрације ЛПС у серуму. Предлажемо исхрану од 18 процената ЦП упарен са 5 процената ЦФ као оптималну комбинацију за храну за гуске.

Кључне речи

сирова влакна, протеини, гихт, цревне микробне заједнице, осовина црева и бубрега,Предности Цистанцхеа.

Кликните овде да сазнатекакви су ефекти Цистанцхеа на бубреге

Увод

Гуске, које су биљоједи, зависе од дијеталних влакана за обављање нормалних активности. Познато је да умерени нивои сирових влакана (ЦФ) у исхрани повећавају отпорност на болести и подстичу раст живине модулацијом цревне микроеколошке равнотеже и јачањем имунолошких функција (Јха и Мисхра, 2021) Вилс-Плотз ет ал. (2013). известили су да је укључивање пектина у исхрани повећало експресију ИЛ- 12 у илеалној слузокожи и повећало производњу интерферона-г у слепим крајницима. Неколико студија је показало да исхрана са малом ЦФ смањује микробну разноврсност, као и релативно обиље корисне микробиоте код гусака на д 70, чиме негативно утиче на перформансе раста, искоришћеност хранљивих материја и имунитет цревне слузокоже ових гусака (Ли ет ал., 2017; Ли ет ал., 2018а). ЦФ у исхрани може помоћи у одржавању функције цревне баријере јачањем структуре и функције слузокоже, као и повећањем популације и разноврсности комензалних бактерија у гастроинтестиналном тракту. Што је још важније, младе птице су наводно осетљивије на промене хранљивих материја и цревних микробних заједница од одраслих (Гао ет ал., 2017). Међутим, студије о утицају нивоа ЦФ у исхрани на микробиоту црева и отпорност на болести код гусака су ретке.

Учинак раста код птица је мање осетљив на промене у нивоу протеина него на промене у енергији у исхрани у храни да би се задовољила њихова првобитна вољна природа (Схи ет ал., 2006). Пријављено је да није примећена значајна разлика у повећању телесне тежине код гусака са нивоом протеина у исхрани у распону од 16 до 22 процента, што се чини превише уопштеним по обиму (Суммерс ет ал., 1986). Насупрот томе, концентрације протеина у исхрани имају снажан утицај на равнотежу цревне флоре и отпорност на болести код живине (Лее ет ал., 2020). Висцерални гихт, који се јавља углавном код птица, је метаболичка болест узрокована оштећеном функцијом бубрега, праћеном акумулацијом кристала урата у различитим органима (Зханг ет ал., 2018). Наша претходна студија је показала да су исхране са високим садржајем протеина биле умешане у повреде бубрега и дисбиозу цревне микробиоте повезане са гихтом код гушара (Кси ет ал., 2020а). Резултати ове студије су показали да су, у поређењу са гушћима храњеним дијетом са 16 и 18 процената сирових протеина (ЦП), гушчићи храњени исхраном са 22 процената ЦП претрпели повреду епителних ћелија црева и дисбиозу микробиоте цекума, што је довело до повреде бубрега или чак гихта. Чини се да микробиота гастроинтестиналног тракта и њени метаболити играју централну улогу у јачању имунитета осовине црева и бубрега код живине (Де Цесаре ет ал., 2019; Кси ет ал., 2020б). Стога, идентификовање одговарајућег програма исхране, који се фокусира на ефекте нивоа ЦФ и ЦП у исхрани, може помоћи да се минимизира инциденца гихта и побољша имунитет одржавањем цревне микроеколошке равнотеже и побољшањем релативне имунолошке регулације код гусака.

Интестинални микробиом има дубок утицај на регулацију имунитета црева, што утиче на системски имунитет и доприноси имунолошкој равнотежи. Промене у саставу исхране, укључујући нивое ЦП и ЦФ, утичу на састав и метаболичке активности микробиоте које се прилагођавају цревном окружењу (Лиу ет ал., 2014). Код живине, сваки поремећај микробиома може изазвати неравнотежу у системском имунитету, доприносећи смањењу отпорности на болести. У нашој претходној студији, открили смо да дисбиоза цревне микробиоте повећава ризик од висцералног гихта код гусака повећањем упале, као и транслокацијом липополисахарида добијеног из црева (ЛПС) у осовини црева и бубрега. У овој сложеној каскади, ЛПС лигација активира нуклеарни фактор, капа-појачивач лаких ланаца активираног пута Б ћелија (НФ-кБ) и производњу проинфламаторних цитокина, као што су интерлеукин 1б (ИЛ1б) и фактор некрозе тумора а (ТНФа), чиме се промовише развој имунолошке толеранције и у цревима и у бубрезима гушчара (Кси ет ал., 2019). Ова студија се фокусирала на истраживање микробних заједница које насељавају цекум гусака храњених различитим нивоима ЦП и ЦФ у исхрани, и мерила је промене у појави гихта анализом имунорегулације и инфламаторних одговора индукованих у оси црева и бубрега.

Стандардизед Цистанцхе

материјали и методе

1. Етичко одобрење

Студију је одобрио Истраживачки комитет Јиангсу академије пољопривредних наука и спроведена је у складу са прописима Управе за послове у вези са експерименталним животињама (Наредба бр. 63 Јиангсу академије пољопривредних наука од 8. јула 2014). Сви експерименти су спроведени према смерницама АРРИВЕ (Анимал Ресеарцх: Репортинг оф Ин виво Екпериментс).

2. Експериментални дизајн

Ова студија је спроведена од 2. до 17. новембра 2020 у Центру за експерименталне животиње Академије пољопривредних наука Јиангсу (Нањинг, Кина). Укупно 1,620 једнодневних Таизхоу гусака (Ансер доместица, 100 проценат ,), које је испоручило Тианзхијиао Бреединг Геесе Лимитед Цомпани (Чузжоу, Кина), насумично је додељено 6 експерименталних група. Сваки третман је имао 6 понављања, а свака реплика је садржала 45 птица. За експеримент је коришћен потпуно рандомизовани факторски дизајн од 2 £ 3. Припремљено је шест дијета са 2 нивоа ЦП и три нивоа ЦФ (Табела 1). 2 нивоа ЦП су била 180 (18ЦП) и 220 (22ЦП) г/кг, а три нивоа ЦФ су била 30 (низак ЦФ), 50 (средњи ЦФ) и 70 (висок ЦФ) г/кг. Сви гушчари су узгајани у термостатској кућици са кавезима од нерђајућег челика идентичне величине (1,20 £ 1,00 £ 0,50 м3, 9 гусака по кавезу, густина насада: 7,5 јединки/м2), који су постављени 0,50 м изнад земље. Гушчићи су храњени под стандардним условима управљања храном за пелете и водом ад либитум. Број висећих хранилица и појилица за брадавице у сваком кавезу био је довољан током читаве студије. Температура околине је одржавана на 30 степени од д 0 до 3, 29 степени од д 4 до 6, 28 степени од д 7 до 9 и 26 степени од д 10 до краја експеримента. Релативна влажност током 21-д експерименталног периода била је приближно 60 процената. Извори светлости (бело светло, 400 -760 нм) су изједначени са осветљеношћу од 15 § 0,3 лукса на нивоу птичије главе, са светлосним распоредом од 22 х светлости од д 0 до 3, 18 х светлости од д 4 до 14 и 16 х светлости од д 15 до 21 у циклусу 24-х.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 проценат свеже хране) случајно добијених са 5 локација помешано је за анализу. ЦП и ЦФ су мерени према ГБ/Т6432 (Кинески национални стандард: Одређивање сирових протеина у храни за животиње) и ГБ/Т6434 (Кинески национални стандард: Одређивање сирових влакана у храни).

АДФИ и БВ (жива тежина) гусака су забележени коришћењем електронске ваге (ИП60001, Хенгји, Шангај, Кина) пре храњења током теста, а АДГ и однос конверзије хране (ФЦР) су израчунати на крају експеримента. Поред тога, кумулативни морбидитет гихта свих реплика (свака реплика је садржала 45 птица) међу различитим третманима је збирна након експерименталног периода. Стандард селекције за гихт је дефинисан као гушчић који показује велике лезије бубрега и концентрацију серумске мокраћне киселине (УА) изнад граничне вредности презасићености урата (мужјак, 416 ммол/Л и женка, 357 ммол/Л). Типичне преовлађујуће велике лезије бубрега су бледе, шарене и отечене, а бубрежни тубули и уретери су проширени вишком урата (Кси ет ал., 2020а).

Херба Цистанцхе

3. Мерење метаболита у серуму

Тридесет и шест гушчара (н=6 гушчића/третман) је насумично одабрано за тренутно узимање крви (5 мЛ/гушчић), након декапитације, преко епрувета за прикупљање крви без антикоагуланса на д 9 и 18, респективно. Сви узорци крви су инкубирани на 37 степени 2 х након сакупљања и центрифугирани на 1,5{{10}0 £ г током 15 минута. Добијени серуми су чувани у Еппендорф епруветама од 0,6 мЛ на 80 степени до даље анализе. Нивои УА у серуму одређени су колориметријом фосфоволфрамне киселине. Концентрације креатинина (Цр) и азота урее (УН), као и активност ксантин оксидазе (КСОД) одређене су ензимском колориметријом коришћењем спектрофотометра за микроплоче (Промега Цорпоратион, Мадисон, ВИ). Ове комплете је испоручио Институт за биоинжењеринг Јианцхенг (Нањинг, Кина); кодови су били Ц012 (УА), Ц011-2 (Цр), Ц013-2 (УН) и А002 (КСОД). Концентрације ИгМ, ИгА и ИгГ у серуму код експерименталних гусака мерене су коришћењем ЕЛИСА комплета за имуноглобулин за гуске купљене од Схангхаи Ј&И Биотецхнологи Цо., Лтд (Шангај, Кина). Имуни комплекси који циркулишу у серуму (ЦИЦ), ИЛ-1б и концентрација ТНФ-а су одређени коришћењем комерцијалног ЕЛИСА комплета за гуске (Јианцхенг Биоенгинееринг Институте, Нањинг, Кина). Активност диамин оксидазе (ДАО) мерена је ензимском колориметријом коришћењем аутоматског биохемијског анализатора (Хитацхи, Токио, Јапан). ЛПС у серуму је мерен коришћењем традиционалног Лимулус теста (Лимулус Ассаи Биотецхнологи Цомпани Лтд., Ксиамен, Кина). Опсези детекције ЛПС-а у тесту Лимулус кретали су се од 0,015 до 0,6 ЕУ/мЛ. Сви материјали коришћени за прикупљање крви и мерење ендотоксина су били без пирогена. Сви тестови су обављени према упутствима произвођача. Узорци серума су тестирани у три примерка. Коефицијенти варијације унутар и међу тестовима за тестове су били<10% and <15%, respectively.

4. Хистоморфолошко посматрање

Слепе ћелије (дужине {{0}} цм) од 36 гушчића (н=6 гушчића/третман) су сакупљене након узимања узорака крви на д 9 и 18 за хистолошку анализу. Узорци сакупљени од гушчара фиксирани су у 4 процента параформалдехида, уклопљени у парафин и изрезани (дебљина кришке: 3 мм; 4 кришке по гуску). Патолошке промене на цекуму (отприлике 7 цм дистално од пилорицног сфинктера) испитиване су под светлосним микроскопом (ОЛИМПУС, Токио, Јапан) након бојења хематоксилином и еозином (ХЕ). Висина ресица и дубина крипте цекума мерене су коришћењем софтвера ИмагеЈ (верзија 1.8.0; Национални институт за здравље, Бетхесда, МД). Снимљено је осам мерења различитих интактних ресица по резу (8 мерења у 3 узастопна видна поља). Статистичке анализе хистолошких мерења вршене су на основу просечно 32 мерења по гуску (4 кришке по гуску и 8 мерења по кришку). Густина пехарастих ћелија је израчуната као број пехарастих ћелија подељен са одговарајућом дужином ресица, која је затим усредњена и изражена као број пехарастих ћелија на 100 мм дужине ресица.

Цистанцхе тубулоса

5. 16С рРНА Секвенцирање садржаја цекума

Садржај слепог црева гусака (6 гусака/третман £ 6 група £ узорковање два пута=72 гусака) је сакупљен на д 9 и д 18 у 2 мЛ стерилне криогене бочице са унутрашњим навојем и одмах похрањен у течном азоту за анализу 16С рДНК . ДНК из узорака садржаја цекума је екстрахована коришћењем МицроЕлуте Геномиц ДНК комплета (Д3096-01, Омега Биотек Инц., Норцросс, ГА) пратећи упутства произвођача. Празни узорци који се састоје од неискоришћених брисева су обрађени екстракцијом ДНК и проверено је да не производе 16С ампликон. Укупна ДНК је елуирана у 50 мЛ пуфера за елуирање коришћењем модификоване процедуре коју је описао произвођач (КИАГЕН, Дусселдорф, Немачка) и чувана на 80 степени.

Користећи укупну ДНК узорака као шаблон и 16С рДНК прајмере (343Ф - 50 - ТАЦГГРАГГЦАГЦАГ -30; 798Р - 50 - АГГГТАТЦТААТЦЦТ-30), појачали смо В3-В4 регион бактеријске 16С рРНА. Све реакције су изведене у мешавини од 25 мЛ (укупне запремине) која је садржала 25 нг екстракта геномске ДНК, 12,5 мЛ ПЦР премикса, 2,5 мЛ сваког прајмера и воду за ПЦР да би се подесила запремина. ПЦР производи су нормализовани коришћењем АкиПреп Маг ПЦР нормализатора (Акиген Биосциенцес, Унион Цити, ЦА), што је омогућило да се прескочи корак квантификације, без обзира на ПЦР запремину поднету за секвенцирање. Базени ампликона су припремљени за секвенцирање коришћењем АМПуре КСТ перли (Бецкман Цоултер Геномицс, Данверс, МА; изводи ОебиоТецх Цо., Лтд, Шангај, Кина). Величина и количина ампликонске библиотеке су процењени коришћењем ЛабЦхип ГКС (Перкин Елмер, Валтхам, МА) и Капа библиотечког квантификационог комплета за Иллумина (Капа Биосциенцес, Вобурн, МА), респективно. ПхиКс Цонтрол библиотека (в3) (Иллумина) је комбинована са библиотеком ампликона (очекивано 30 процената). Библиотека је груписана при густини од приближно 570 К/мм2. Библиотеке су секвенциониране на 300ПЕ МиСек серијама, где је једна библиотека секвенционирана са оба протокола коришћењем стандардних прајмера за секвенцирање Иллумина, чиме је елиминисана потреба за трећим (или четвртим) читањем индекса. Очитавања су филтрирана коришћењем квантитативних увида у филтере квалитета микробне екологије (КИИМЕ;). ЦДХИТ цевовод је коришћен за одабир оперативних таксономских јединица (ОТУ) припремањем ОТУ табеле. Секвенце са 97 посто сличности додељене су ОТУ-овима. Репрезентативне секвенце су изабране за сваки ОТУ, а таксономски подаци су затим додељени свакој репрезентативној секвенци коришћењем класификатора пројекта Рибосомалне базе података (РДП). ГенБанк приступни број ових ОТУ нуклеотидних секвенци је САМН21014082. Да би се проценила алфа разноврсност, ОТУ табела је разређена и израчунате су следеће 4 метрике: метрика Цхао1 за процену богатства; метрика посматране врсте као број јединствених ОТУ пронађених у узорку; Шенонов индекс; и Симпсонов индекс.

6. ПЦР у реалном времену

(н {{0}} гушчића/третман) су прикупљени на д 9 и 18 за ПЦР анализу у реалном времену (РТ-ПЦР). Укупна РНК је екстрахована из ткива, коришћењем ТРИзол реагенса (Лифе Тецхнологиес, ​​Гранд Исланд, НИ) и реверзно транскрибована коришћењем комплета за нивое реверзне транскрипције (ТаКаРа, Далиан, Кина), у складу са протоколом произвођача. б-актин је коришћен као непроменљива контрола. Прајмери ​​су дизајнирани коришћењем софтвера Пример Премиер 5.0 и њихове секвенце су наведене (Табела 2). РТ-ПЦР је изведен коришћењем СИБР Премик Ек Так (Роцхе, Базел, Швајцарска). Сви РТ-ПЦР су изведени у три примерка. Релативни нивои експресије циљних гена су одређени коришћењем 2 ДДЦт методе.

7. Анализа података

Експериментални подаци изведени из 6 понављања по третману анализирани су коришћењем програма ИБМ СПСС Статистицс 16 (ИБМ Цорпоратион, Сомерс, НИ). Свака реплика је разматрана као експериментална јединица, а коришћена статистичка процедура је била мултиваријантна анализа варијансе коришћењем процедуре општег линеарног модела (ГЛМ). Када су утврђене значајне разлике, средства третмана су раздвојена и упоређена коришћењем Дунцан-овог теста вишеструког опсега. Двострани тест се сматра статистички значајним при нивоу вероватноће мањем од 5 процената (П < 0.05).

Иуменг Кси *, Иуанпи Хуанг, и Иуе Ли *, Иунмао Хуанг #, Јунсху Иан * и Зхендан Схи *.

* Кључна лабораторија за интегрисану пољопривреду и сточарство Министарства пољопривреде и руралних послова, Институт за сточарство, Академија пољопривредних наука Јиангсу, Нањинг 210014, Кина;

# Цоллеге оф Анимал Сциенце, Зхонгкаи Университи оф Агрицултуре анд Енгинееринг, Гуангзхоу 510000, Кина.