ДЕО Ⅰ: Инфламаторни процес модулира експресију и локализацију ВТ1 у подоцитима што доводи до оштећења бубрега
Mar 23, 2022
Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com
МАРИЕЛА АРЕЛЛАНО-РОДРИГЕЗ, ПАБЛО ЗАПАТА-БЕНАВИДЕС И ДР.
Увод
Вилмов тумор-1 ген(ВТИ) је један од главних гена укључених у преживљавање подоцита и неефикасну бубрежну филтрацију. Инфламаторни процеси доводе добубреганеуспеха ово би се могло десити кроз модулацију ВТ1(Вилмов тумор-1 ген). ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) кодира фактор транскрипције, протеин цинковог прста који има четири главне изоформе алтернативним спајањем у егзону 5(17АА±) и егзону 9(КТС±)(1). КТС-изоформа има већи афинитет за ДНК, КТС плус се ко-локализује са протеинима сплицеосома у цитоплазми (2, 3).ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) игра пресудну улогу у ембриогенези, првенствено у гонадама ибубрегаразвој; код одраслих, његова експресија је ограничена на специјализоване висцералне ћелије убубрега(подоцити) и неопходан је за одржавање и модулацију неколико гена, као што су подокаликсин, нефрин (НПХС1) и транскрипциони фактор упарене кутије (4-6). Мутације или смањење експресије ВТл могу довести до смањене експресије нефрина и подокаликсина и повезано је са нефропатијама као што је гломерулосклероза(5, 7-10).
Нефротски синдром је најчешћи бубрежни синдром у детињству, његова хистолошка класификација је Минимална нефротска промена, фокална сегментна гломерулосклероза и дифузна мезангијална склероза, а према степену одговора на стероиде класификован је као осетљив и резистентни нефротски синдром (11) .
ефекти цистанцхеа: против запаљења
Мутација ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) се обично јавља код деце са нефротским синдромом отпорним на стероиде, ретком болешћу која погађа 10-15 процената пацијената са нефротским синдромом(12,13). Око 80 процената све деце са спорадичним нефротским синдромом реагује на терапију стероидима, међутим, нису пронађене мутације у ВТ1 (Вилмов тумор-1 ген) у великој кохортној студији (14). Смањење експресије нефротског синдрома отпорног на стероиде иу мањој мери код пацијената са нефротским синдромом осетљивим на стероиде (15). У мишјем моделу системске инфламације изазване липополисахаридом (ЛПС), 24 х након примене ЛПС, ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) је пребачен у цитоплазму и био је повезан са смањењем експресије нефрина, кључне компоненте за одржавање прорезане дијафрагме у подоцитима и која је неопходна за исправну гломеруларну филтрацију, показујући на тај начин ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) делује као транскрипциони фактор за регулацију гена за нефрин (16).
У ћелијама рака плућа А459 третираним фактором некрозе тумора-алфа (ТНФа), транслокација ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) примећен је протеин у цитоплазми, што сугерише да инфламаторни стимулус може да промени његову интрацелуларну локализацију и транскрипциону функцију (17). Фосфорилација може играти улогу у модулацији транскрипционе регулаторне активности ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) ометањем нуклеарне транслокације, као и инхибицијом ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) Везивање ДНК(18) фосфорилацијом Сер-365 и Сер-393 посредованом протеин киназом у домену цинковог прста (19).
Сепса је резултат системског инфламаторног одговора и карактерише је ослобађање про- и антиинфламаторних цитокина изазваних инфекцијом. Акутна повреда бубрега је честа код критично болесних пацијената у присуству акутне упале и има јаку везу са прогресијом хроничног оштећења бубрега (20,21). Постоје докази да запаљење игра важну улогу у оштећењу различитих органа, укључујућибубрези(22). У овом раду смо проценили ефекат проинфламаторних цитокина на модулацију ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) експресија и њена транслокација у цитоплазму.
корист цистанцхе тубулоса: анти-цнцер и анти-тумор
Материјали и методе
Животињски модел. Женке БАЛБ/ц мишева (старе 8-10 недеља) добијене су из Харланд Мекицо-а (Мексико Сити, Мексико). Мишеви су држани у кавезима под контролисаном собном температуром, влажношћу и светлошћу (12/12 х светло-тамни циклус) са водом и храном ад либитум. ЛПС Есцхерицхиа цоли О111:Б4 (Сигма Алдрицх, Толуца, Мексико Сити, Мексико) и један ињекција ЛПС-а је примењена у дози од 8 мг/кг интраперитонеално(16); физиолошки раствор је коришћен за контролне, нетретиране мишеве. Мишеви су жртвовани интраперитонеалном ињекцијом од 200 мг/кг раствора натријум пентобарбитала у 12,24,36,48 и 72 х, са н=5 у свакој временској тачки, а затимбубрегаприкупљено је ткиво и крв. Урин је сакупљен пре жртвовања животиња.
Два миша забубрегаексплантима је ињектирано 1 мг/кг ЛПС свака 2 дана да би се изазвала хроничнабубрега повредакао позитивна контрола (21). Сви експерименти су спроведени у складу са претходним одобрењем Комитета за институционалну негу и употребу животиња Факултета биолошких наука (ЦЕИБА-2016-034).
Бубрегексплантати. ОдбубрегаБАЛБ/ц мишева, резови ткива дебљине 250-300 ум су припремљени са Крумдиецк секачем за ткиво (Алабама Ресеарцх анд Девелопмент, Мунфорд, АЛ, САД) на 4 степена са константним протоком пуфера Кребс Хенселеит бикарбоната (КБ) која је газирана са 5 процената ЦО2. Кришке су сакупљене у КБ пуферу на 4 степена.Бубрегекспланти су постављени у плоче са 12-бунарићима са Дулбеццо-овим модификованим Еаглеовим медијумом/Ф12 медијумом допуњеним са 10 процената феталног говеђег серума и 5 процената антибиотика-антигљивичног агенса, и инкубирани на 37 степени Ц, са 5 процената ЦО и мешањем на 25 рпм. Експланти су третирани са 10 нг/мл ТНФа (Р&Д Системс, Миннеаполис, МН, САД), 20 нг/мл интерлеукина 1 (ИЛ1; Р & Д Системс) и 100 нг/мл ЛПС и анализирани на 6, 12 и 24 х касније.
Уринарни протеин. Узорци урина су прикупљени у свакој временској тачки изнад. Концентрација протеина је мерена коришћењем ДЦ Протеин Ассаи кита (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД), а албуминурија је процењена помоћу електрофорезе натријум додецил сулфат-полиакриламид гела и на основу величине траке албумина говеђег серума (16).
Проинфламаторни цитокини. Нивои ИЛ6, ИЛ1 и ТНФа мерени су коришћењем сендвич комплета за имуносорбентне тестове везане за ензиме (ПепроТецх, Мексико Сити, Мексико).
Квантитативна ланчана реакција полимеразе (кПЦР). Укупна РНК је изолована из бубрежних ткива коришћењем Тризолв реагенса (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА) према упутствима произвођача. Једноланчана цДНК је синтетизована реверзном транскрипцијом коришћењем комплета за реверзну транскрипцију цДНК високог капацитета (Апплиед Биосистемс, Фостер Цити, Калифорнија, САД) у складу са упутствима произвођача. ПЦР у реалном времену је изведен коришћењем 7500 Реал-Тиме ПЦР система (Апплиед Биосистемс) са ТакМан тестовима експресије гена. Упоредни ПЦР тестови у реалном времену су изведени за сваки узорак у три примерка. Прајмери за ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) су прослеђени:5-ТЦТГЦГГ АГЦЦЦААТАЦАГ-3'; реверс:5-ЦАЦАТЦЦТГААТГЦЦТЦТ ГААГА-3';и сонда ФАМ:5-ЦАЦЦГТГЦГТГТГТАТТ-3'НФК;протокол је изведен за 95 степени током 10 минута и 40 циклуса на 94 степена за 30 с и 64 степена Ц за 30 с. Релативни израз ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) ген је израчунат коришћењем једначине 2-ААЦТ(23) са геном за глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназу (ГАПДХ) (Апплиед Биосистемс) који се користи за нормализацију.
лечење болести бубрега екстракт цистанцхе
Експресија мРНА нефрина је одређена са 3 уг цДНК и следећим прајмерима: Напред: 5'-ЦЦЦЦААЦАТЦГ АЦТТЦАЦТТ-3'и обрнуто:5'-ГГЦАГГАЦАТЦЦАТГТАГАГ-3'на 94 степена током 30 с,60 степен степена за 30 с и степен степена 72 степена за 30 с током 30 циклуса (372 бп)(16). За експресију ГАПДХ, коришћени су прајмери: напред:5'-АЦЦАЦАГТЦЦАТГЦЦАТЦАЦ-3', реверс:5'- ТЦЦАЦЦАЦЦЦ ТГТТГЦТГТА-3', са следећим условима реакције: 94 степена за 40 с, 60 степени за 30 с и 72 степена за 40 с за 35 циклуса (452 бп). Израз ВТ1(Вилмов тумор-1 ген):Напред 5'-ЦАЦАТГАГАГАААЦГЦЦЦЦЦТТЦАТГТГ-3', обрнуто 5'-ТТТГАГЦТГГТЦТГААЦГАГААА-3'на 94 степена за 40 с, 64 степена за 30 с и 72 степена за 30 с за 30 б/с).(165 бп). Израз ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) изоформе КТС± и 17 АА±(Ф2-Р2 прајмери за детекцију 17 АА плус /-и Ф3-Р3 за детекцију КТС плус /-сплајсинг изоформе) изведено је конвенционалним ПЦР према Оји ет. .ал.(24). Одређивање експресије -актина извршено је према Лаукет ал. (25). Производи су посматрани коришћењем електрофорезе 10% полиакриламидног гела за КТС±изоформу и 2% агарозног гела за 17АА±изоформу.
Имунофлуоресценција. Тхебубрезиод мишева третираних ЛПС-ом и контроле су фиксиране у 10 посто формалина и обрађене за бојење хематоксилином и еозином, имунохистохемију и имунофлуоресценцију.
Да бисте одредили локацију ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) код мишева третираних ЛПС-ом, коришћени су пресеци бубрежног ткива {{0}}ум дебљине постављени на микроскопске плочице. Узорци су очишћени од воска, пермеабилизовани са Тритон Кс-100 [0,1 проценат Тритона са 1 процентом натријум цитрата у физиолошком раствору пуферованом фосфатом (ПБС)], и испрани три пута са ПБС. Ткива су блокирана са 20 процената феталног говеђег серума у ПБС-у током 30 минута и инкубирана на 4 степена преко ноћи са моноклонским антителом на ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) сц{{0}}(Ф-6) (Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, Калифорнија, САД) разблажен 1:100 у 10 процената феталног говеђег серума у ПБС. После испирања са ПБС, присуство везаног антитела је идентификовано бојењем козјим анти-мишјим ИгГ Текас Ред сц-2979(Санта Цруз Биотецхнологи). Слајдови су обојени 4',6-диамидино-2-фенилиндолом. Коначно, дијапозитиви су монтирани и квалитативно испитани коришћењем конфокалног микроскопа Олимпус БКС61В1 са објективом за урањање у воду од 40× и софтвером Флуовиев 4.0а (Олимпус, Токио, Јапан).
Имунохистоцхемистри. За одређивање фосфорилисаног (п)-ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) у подоцитима мишева третираних ЛПС, поликлонска антитела на п-ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) коришћени су серин 393,сц-12933 и 363,сц-12934-Р (Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, УСА). Слајдови који садрже 4- μм делове бубрежног ткива су девоскани и пермеабилизовани . Имунохистохемија је обављена коришћењем Универсал Куицк Кит (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА, УСА) према протоколу произвођача. Слајдови су прегледани помоћу светлосног микроскопа са објективом за урањање у уље од 100× (Примо Стар, Царл Зеисс, ГмбХ, Немачка) .
Вестерн блот. Укупни протеин је изолован са 200 ул пуфера за лизу (1 проценат Тритон, 150 мМ НаЦл, 25 мМ Трис-ХЦл пХ 7,6), а концентрација је мерена коришћењем ДЦ Протеин Ассаи кита (Био-Рад). Протеин (50 уг) је одвојен коришћењем електрофорезе 12% натријум додецил сулфат-полиакриламид гела и анализиран вестерн блотингом са ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) [Ф6] антитело сц-7585(Санта Цруз Биотецхнологи). Узорци су нормализовани коришћењем анти-ГАПДХ (АБ2302; Сигма, Сан Луис, МО, САД). Протеини су визуелизовани коришћењем Луми-Лигхт Вестерн Блоттинг система сц-2048(Санта Цруз Биотецхнологи).
корист од цистанцхе: заштитити бубреге
Резултати
Индукција офбубрегаоштећењакод БАЛБ/ц мишева помоћу ЛПС. Добро је утврђено да је повреда подоцита повезана са повећаном протеинуријом. Албумин и укупни протеин у урину одређивани су електрофорезом натријум додецил сулфат-полиакриламидног гела и ДЦ Протеин Ассаи китом (Био-Рад). Значајно повећање (п=0.001) албумина у урину примећено је 12 х након ЛПС третмана, са максималним повећањем на 24 х (215,87±1,41 уг/мл) у поређењу са контролном (15,53). ±5,0 уг/мл）(Слика 1А) Примећено је да концентрација укупног протеина у урину достиже максимум на 36 х (26,02±2,43 мг/мл) и била је значајно већа у поређењу са контролном (п=0.01) као што је приказано на слици 1. Оштећење бубрега изазвано ЛПС-ом анализирано је хистолошком анализом.24 х након третмана, уочен је фокални гломерулонефритис у ткиву бубрега, а највеће оштећење је нађено 36 х, повећавајући величину гломерула, са мезангијалним 48 х после, примећен је постепени опоравак гломерула до 72 х, као што је приказано на слици 1Ц.
Слика 1. Утицај системске инфламације на бубрег.Концентрације уринарног албумина (А) и протеина у урину (Б) као маркера оштећења бубрега код мишева третираних липополисахаридом. Ц: Репрезентативна слика бубрежне хистологије миша (хематоксилин и еозин бојење) у различито време (12,24,36,48 и 72 х) након ињекције липополисахарида, са поређењем модела хроничне упале, увећање 100×. Значајно другачије на: *н<><0,0]><0.00>
Производња проинфламаторних цитокина ТНФа и ИЛ1 у серуму од мишева третираних ЛПС. Да би се потврдило да је оштећење бубрега изазвано ЛПС, нивои проинфламаторних цитокина су измерени ензимским имуносорбентним тестом. Повећање ТНФа и И1 примећено је после 12 х (3,6±0,9 нг/мл, 11,9±5нг/мл) и до 36х(4,44±0.1 нг/мл,18 ±0.9 нг/мл, респективно) третмана ЛПС-ом, који почиње да опада након тога (Слике 2А и Б). Експресија ИЛ6 је повећана на 12 х (49,5 нг/мл) и 36 х (23,5 нг/мл) након третмана, што је значајно више од контроле (Слика 2Ц).
Слика 2. Временски ток нивоа проинфламаторних цитокина фактор некрозе тумора-алфа (ТНФа).(А), интерлеукин 1 (ЛЛ1)(Б) и ИЛ6(Ц) у серуму мишева након интраперитонеалне примене липополисахарида. Значајно различито на: *п Мање или једнако 0.05,**п Мање или једнако 0.01 и ***п Мање или једнако 0,001 .
Експресија ВТИ гена у ткиву бубрега код мишева третираних ЛПС. Да бисмо одговорили на наше централно питање да ли је ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) је модулисан инфламаторним процесом, а то је имало ефекте на бубреге, укупна експресија ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) одређен је у узорцима бубрега мишева са системском инфламацијом у различито време у току упале. ВТ1(Вилмов тумор-1 ген) мРНА је била нижа све време анализирано у односу на контролу, са најнижом релативном експресијом 36 х и највишом 12 х након индукције системске упале као што је приказано на Слици 3А. Поред тога, утврђено је да ли је третман са ЛП индукована модификација експресије егзона5(17 АА±) изоформе и КТС±ВТИ помоћу ПЦР. Подаци су показали да није дошло до дерегулације експресије ових изоформа јер је уочено исто понашање као контролна група без третмана током целог системског инфламаторног процеса изазваног ЛПС (Слика 3Б). Вестерн блотинг је показао да се протеин ВТ1 смањује током инфламаторног процеса, са благим опоравком 36 х након третмана, међутим, количина ВТ1 је била мања од оне у нетретираној контроли (Слике 3Ц и Д).
Слика 3. Ефекат липополисахарида (ЛПС) на експресију гена Вилмсовог тумора И (ВТ1) у ткиву бубрега код мишева са системском инфламацијом.А: Релативна експресија ВТИ мРНА.Б: Релативна експресија изоформа КТС± и 17ИАА±ВТ1.Ц: Нивои ВТИ протеина имуноблотингом након ЛПС третмана и Д: Густина имуноблотинга за ВТ1. Значајно различита на:**п Мање веће или једнако 0.01 и ***п мање или једнако 0,001,
Фосфорилација и локализација ВТИ у биопсијама бубрега мишева третираних ЛПС. Важан догађај у посттранслационој модулацији ВТИ протеина је фосфорилација аминокиселине 393, која индукује измештање протеина у цитоплазму. Одређена је фосфорилација и локализација ВТ1 у узорцима бубрега мишева третираних ЛПС. Фосфорилација ВТ1 је анализирана хистохемијом, што указује на присуство фосфорилисаног ВТ1 у цитоплазми ћелија у деловима бубрежног ткива почевши од 12 х након индукције системске упале и одржава се до 72 х. као што је приказано на слици 4А. Локација ВТ1 протеина је анализирана имунофлуоресценцијом. Локација ВТ1 у подоцитима у узорцима бубрега мишева третираних ЛПС била је углавном цитоплазматска, док је у подоцитима из контролних узорака локација била нејасна (Слика 4Б).
Слика 4. Фосфорилација и локализација Вилмсовог тумора И (ВТИ) у узорцима бубрега мишева третираних липополисахаридом.О: Имунохистохемијско бојење за фосфорилисани (п)-ВТИ које показује повећање фосфорилисаног код серина 393 и 363 почевши од 12 х након примене ЛПС (увећање 100× на светлосном микроскопу). Б: Локализација ВТИ имунофлуоресценцијом у бубрегу; примери који показују мању нуклеарну локализацију ВТ1(квадрата)36 х након примене липополисахарида (увећање 40× на конфокалном микроскопу).ДАП1:4,6-Диамидино-2-фенилиндол.
Модулација експресије ВТИ и нефрина у бубрезима код мишева третираних ЛПС. Локација ВТ1 у ћелији утиче на њену биолошку активност. Пријављено је да цитоплазматски ВТ1 не испољава транскрипциону активност; из тог разлога, експресија ВТ1 и мРНК нефрина је анализирана ПЦР-ом у узорцима бубрега мишева третираних ЛПС-ом (Слика 5А). ПЦР је показао смањење мРНК нефрина са 24 на 48 х, уз повећање на 72 х (Слика 5Б). ), док се експресија ВТИ мРНА повећала за 12 х, а затим је опала током критичних сати упале и оштећења бубрега (24 и 36 х) и (Слика 5Б).
Слика 5. Анализа експресије нефрина (НПХС1) и Вилмсовог тумора 1(ВТ1)мРНК.О: У анализи експресије мРНА, НПХСИ и ВТИ су се смањили 24, 36 и 48 х након индукције системске инфламације применом липополисахарида. Б: Квантификација трака приказаних у А дензитометријом и нормализованих експресијом на глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназу.
Експлантати бубрега третирани ТНФа и ИЛ1 модулирају експресију ВТИ и нефрина. Да би се утврдило да ли цитокини модулирају експресију ВТ1, бубрежни експланти су култивисани и третирани цитокинима ТНФа и ИЛ1 током 6, 12 и 24 х да би се анализирала експресија ВТ1 и нефрина помоћу ПЦР-а. Експресија мРНК нефрина је смањена, а експресија мРНК ВТИ повећана за 24 х код бубрежних експлантата третираних ТНФа и ИЛлб (Слика 6).
Слика 6.Анализа експресије мРНК нефрина (НПХС1) и Вилмсовог тумора 1 (ВТ1) у експлантату бубрега.А: Нивои експресије мРНА НПХСи и ВТИ у различито време у бубрежним експлантама изложеним 10 нг/мл фактора туморске некрозе-алфа (ТНФ) и 20 нглмл интерлеукина 16 (ИЛ16)Б: Релативна експресија добијена дензитометријском анализом сигнални производ. Траке су квантификоване нормализацијом на глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназу.
Локализација ВТИ код бубрежних експлантата имунофлуоресценцијом. Да би се утврдило да ли су ТНФа и ИЛ одговорни за промену локализације протеина ВТ1, експлантације бубрега миша су третиране са ТНФа и Л1 и ЛПС током 24 сата. Код експлантата третираних са ИЛ1б и ЛПС, очигледна је нуклеусна/цитоплазматска локализација ВТ1 протеина, а код експлантата третираних са ТНФа, примећена је цитоплазматска локализација ВТ1 протеина; у међувремену, у нетретираним контролама, примећена је углавном нуклеарна локализација ВТ1 (Слика 7).
Слика 7. Локализација Вилмсовог тумора 1(ВТИ) протеина имунофлуоресценцијом коришћењем црвеног ТКС (ВТ1) и 4',6-диамидино-2-фенилиндола (ДАПИ)(нуклеус) у подоцитима из третираних експлантата бубрега са л0 нг/мл фактора туморске некрозе-алфа (ТНФа), 20 нг/мл интерлеукина 16(Л1Б) и липополисахарида (ЛПС).Смањена нуклеарна локализација ВТас приказана у експлантатима третираним са ТНФа у поређењу са нуклеарном/цитоплазматском локализацијом ВТИ под третманима ИЛ1 и ЛПС. Увећање, 40×.
