Трећи део ДсбА-Л интерагује са ВДАЦ1 у митохондријском посредованој тубуларној ћелијској апоптози и доприноси прогресији акутне болести бубрега
Jun 14, 2023
7. Генерација ПТ-ВДАЦ1-КО мишева
Да бисмо истражили улогу ВДАЦ1 у АКИ, успоставили смо модел миша који садржи нокаут ВДАЦ1 у проксималним тубулима бубрега. Слика 7а приказује протокол размножавања који се користи за генерисање ПТ-ВДАЦ1-КО. РТ-ПЦР је коришћен за генотипизацију ПТ-ВДАЦ1-КО мишева; ово је урађено амплификацијом 416-бп ДНК фрагмента флоксираног алела и 370-бп ДНК фрагмента Цре гена (слика 7, б; траке 4 и 6). Мишеви дивљег типа (ПТ-ВДАЦ1-ВТ) нису имали Цре ген (слика 7, б, траке 2 и 3). Имуноблот анализа је показала да су нивои експресије ВДАЦ1 у кортексу бубрега ПТВДАЦ1-КО мишева били нижи од оних код ПТВДАЦ1-ВТ мишева након исхемијског или лажног третмана (Слике 7 ц и д). Ово је даље потврђено имунохистохемијским бојењем ВДАЦ1 (Слика 7е). Ови подаци су потврдили да смо успешно успоставили ПТ-ВДАЦ1-КО модел миша.
Слика 7. Креирање и карактеристике ПТ-ВДАЦ1-КО модела миша. (а, б) Протокол оплемењивања за генерисање ПТВДАЦ1-КО мишева и ПЦР детекција генотипа дивљег типа и флоксираних алела ВДАЦ1 и ПЕПЦК-Цре алела. (ц) Имуноблот анализа ВДАЦ1 и б-тубулина коришћењем кортикалног ткива бубрега ПТ-ВДАЦ1-КО и ПТ-ВДАЦ1-ВТ легла мишева после ИР повреде. (д) Анализа слике у сивим тоновима између њих. (е) Имунохистохемијско бојење ВДАЦ1 у кортикалним ткивима бубрега дивљег типа и ВДАЦ1 мишева након ИР повреде. Оригинално увећање к 400. Сцар Бар: 100µМ. Сваки експеримент (ц & е) је поновљен 6 пута независно са сличним резултатима. Једносмерна АНОВА је коришћена за поређења више група (д). # п<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.
Кликните овде да бисте сазнали које су предности Цистанцхеа
8. И/Р-индукована повреда бубрега, апоптоза тубуларне ћелије и оштећење митохондрија побољшани су код ПТВДАЦ1-КО мишева
У леглу ПТ-ВДАЦ1-ВТ и ПТ-ВДАЦ1-КО мишева лечена је исхемија (28 мин) праћена реперфузионом повредом (48 х). Затим смо узели узорке крви и ткива бубрега за даље испитивање. Открили смо да ПТ-ВДАЦ1-КО значајно потискује И/Р-индуковано повишење нивоа БУН и креатинина (Слика 8 а и б). Друго, хистолошке и ТУНЕЛ анализе су даље показале да је ПТ-ВДАЦ1-КО значајно ослабио оштећење ткива изазвано И/Р и апоптозу бубрежних ћелија (Слика 8 ц, д, ф и г). Треће, ЕМ анализе су откриле да је ПТ-ВДАЦ1-КО значајно ослабио оштећење митохондрија изазвано И/Р (Слика 8 е и х). Коначно, имуноблотирање је потврдило да су ПТ-ВДАЦ1-КО мишеви показали смањене нивое расцепљене каспазе-3, нижу акумулацију Бака у митохондријама и ниже стопе ослобађања Цит-ц у цитосол (Слика 8 И- о). Ови подаци указују да је ВДАЦ1 такође посредовао И/Р-индукованом АКИ.
Слика 8. Слабљење ИР-индуковане повреде бубрега, апоптоза тубуларне ћелије, оштећење митохондрија и експресија Бак, Цит-ц и цепане каспазе3 код ПТ-ВДАЦ1-КО мишева. Билатералне бубрежне артерије ПТ-ВДАЦ1-КО и ПТ-ВДАЦ1-ВТ мишева легла су стегнуте на 28 минута, а затим пуштене на 48 сати да би се успоставио ИР модел. (лепињи. (б) Креатинин у серуму. (ц) Бојење хематоксилином и еозином. (д) Репрезентативни делови ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (е) Детекција морфологије митохондрија електронским микроскопом. (ф) Оцена оштећења цеви. (г) Број ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (х) Резултат повреде митохондрија. (и) Имуноблотови анализирају експресију одцепљене каспазе3, ВДАЦ1 и ДсбА-Л, као и експресију БАКС и Цит-ц у митохондријалним и цитосолним фракцијама. б-тубулин и ГАПДХ су коришћени као контрола пуњења целог лизата или цитосола, респективно. ЦОКС ИВ је коришћен као контрола оптерећења митохондрија. (ј- п) Анализа слике у сивим тоновима између њих. Оригинално увећање к 400. Сцар Бар: 100 µМ у ц & д 20 µМ у е. Сваки експеримент (ц-е&и) је поновљен 6 пута независно са сличним резултатима. Једносмерна АНОВА је коришћена за вишеструка поређења група (а, б, ф- х&ј- п). # п<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.
Цистанцхе тубулоса
9. Прекомерна експресија ДсбА-Л погоршаног оштећења бубрега изазваног И/Р је ослабљена код ПТ-ВДАЦ1-КО мишева
ДсбА-Л током исхемијске повреде. Недељу дана пре него што је успостављен мишји модел ИР-а, убризгали смо у репну вену сваког миша ДсбА-Л плазмид (ињекција је извршена два пута током ове недеље). Прекомерна експресија ДсбА-Л погоршала је ИР-индуковано повећање БУН-а и експресије креатинина, оштећење бубрега и апоптозу бубрега; ови ефекти су ослабљени код мишева ПТВДАЦ1-КО (Слика 9 а-д, е и ф). Имуноблот резултати су даље показали да прекомерна експресија ДсбА-Л појачава ИР-индуковано повећање цепане каспазе-3, акумулацију Бака у митохондријима и ослобађање Цит-ц у цитосол; ови ефекти су смањени код ПТ-ВДАЦ1-КО мишева (слика 9 г и х-л). Заједно, ови резултати су даље показали да је ВДАЦ1 посредовао у ефекту ДсбА-Л током исхемијске повреде.
Слика 9. Прекомерна експресија ДсбА-Л погоршаног оштећења бубрега изазваног И/Р је ослабљена код ПТ-ВДАЦ1-КО мишева. ПТ-ВДАЦ1-КО и ПТ-ДсбА-Л-ВТ мишеви су третирани са или без ДсбА-Л плазмида, а затим је успостављен ИР модел. (лепињи. (б) Креатинин у серуму. (ц) Бојење хематоксилином и еозином. (д) Репрезентативни делови ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (е) Оцена оштећења цеви. (ф) Број ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (г) Имуноблотови су анализирали експресију одцепљене каспазе3, ВДАЦ1 и ДсбА-Л, као и експресију БАКС и Цит-ц у митохондријалним и цитосолним фракцијама. б-тубулин и ГАПДХ су коришћени као контрола пуњења целог лизата или цитосола, респективно. ЦОКС ИВ је коришћен као контрола оптерећења митохондрија. (х- н) Анализа слике у сивим тоновима између њих. Оригинално увећање к 400. Сцар Бар: 100мМ. Сваки експеримент (ц-е) је поновљен 6 пута независно са сличним резултатима. Једносмерна АНОВА је коришћена за вишеструка поређења група (а, б и ф-н). # п<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.
Цистанцхе додатак
10. Слабљење И/Р-индукованог оштећења бубрега код ПТДсбА-Л-КО мишева је смањено прекомерном експресијом ВДАЦ1
Да би се додатно потврдило да ли оштећење тубула посредовано ДсбА-Л зависи од ВДАЦ1, мишеви легла ПТДсбА-Л -ВТ и ПТ-ДсбА-Л -КО мишева су прво били изложени И/Р третману, а затим убризгани преко репне вене са плазмидом прекомерне експресије ВДАЦ1. И/Р-индуковано повећање нивоа БУН и креатинина је побољшано код ПТ-ДсбА-Л-КО мишева; међутим, овај ефекат је спречен прекомерном експресијом ВДАЦ1 (Слика 10 а и б). ХЕ и ТУНЕЛ бојење је показало да су релативни опсег оштећења бубрежног ткива изазваног ИР-ом и апоптозе бубрежних ћелија смањени код ПТ-ДсбАЛ-КО мишева и да су ови ефекти блокирани прекомерном експресијом ВДАЦ1 (Слика 10 ц-ф). Имуноблотинг је показао да су ПТ-ДсбА-Л -КО мишеви имали ниже нивое цепане каспазе-3, ниже нивое акумулације Бака у митохондријима и ниже стопе ослобађања Цит-ц у цитосол; међутим, ови ефекти су елиминисани прекомерном експресијом ВДАЦ1 (Слика 10 г-м). Ови подаци подржавају чињеницу да је ДсбА-Л промовисао исхемијску повреду на начин који је зависио од ВДАЦ1.
Слика 10. ПТ-ДсбА-Л-КО побољшана ИР-индукована повреда бубрега мишева је смањена прекомерном експресијом ВДАЦ1. ПТ-ДсбА-Л-КО и ПТ-ДсбА-Л-ВТ мишеви су третирани са или без ВДАЦ1 плазмида, а затим је успостављен ИР модел. (лепињи. (б) Креатинин у серуму. (ц) Бојење хематоксилином и еозином. (д) Репрезентативни делови ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (е) Оцена оштећења цеви. (ф) Број ТУНЕЛ-позитивних ћелија. (г) Имуноблотови су анализирали експресију одцепљене каспазе3, ВДАЦ1 и ДсбА-Л, као и експресију БАКС и Цит-ц у митохондријалним и цитосолним фракцијама. б-тубулин и ГАПДХ су коришћени као контрола пуњења целог лизата или цитосола, респективно. ЦОКС ИВ је коришћен као контрола оптерећења митохондрија. (хм) Анализа слике у сивим тоновима између њих. Оригинално увећање к 400. Сцар Бар: 100мМ. Сваки експеримент (ц, д и г) је поновљен 6 пута независно са сличним резултатима. Једносмерна АНОВА је коришћена за вишеструка поређења група (а, б, е, ф и х-м). # п<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.
Херба Цистанцхе
11. Повреда бубрега изазвана ЦЛП је ослабљена код ПТ-ДсбА-ЛКО или ПТ-ВДАЦ1-КО мишева
АКИ изазван сепсом је још један чест узрок АКИ у клиничкој пракси. Легла ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ-ВТ и ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ1-КО подвргнута су ЦЛП моделу и затим еутаназирана 18 х након операције. Резултати су показали да су ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ1- КО мишеви значајно смањили ЦЛП-индуковано повишење нивоа БУН и креатинина, као и повећан ниво оштећења бубрежног ткива и апоптозе бубрежних ћелија (Слике С1 и С2 а-ф ). Имуноблотинг је потврдио да су ПТДсбА-Л или ВДАЦ1-КО мишеви такође показали смањене нивое расцепљене каспазе-3, ниже нивое акумулације Бака у митохондријима и ниже стопе ослобађања Цит-ц у цитосол (Слике С1 и С2 г- н). Заједно, ови подаци су показали да су и ДсбА-Л и ВДАЦ1 посредовали у прогресији септичког АКИ.
12. Повреда бубрега изазвана ВАН-ом је ослабљена код ПТ-ДсбАЛ-КО или ПТ-ВДАЦ1-КО мишева
АКИ изазван ванкомицином (ВАН) је такође важан модел за АКИ. У леглу ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ1-ВТ и ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ1-КО интраперитонеално је убризгаван ВАН (600мг/кг) током 7 узастопних дана. Резултати су показали да су ПТ-ДсбА-Л или ВДАЦ1-КО мишеви значајно смањили ВАН-индуковано повећање нивоа БУН и креатинина, оштећење бубрежног ткива и апоптозу бубрежних ћелија (Слике С3 и С4 ан-ф). Имуноблот анализе су даље потврдиле да су ПТДсбА-Л или ВДАЦ1-КО мишеви такође показали смањене нивое расцепљене каспазе-3, мањи степен акумулације Бака у митохондријама и ниже стопе ослобађања Цит-ц у цитосол (Слике С3 и С4 г-м). Укратко, ови подаци су показали да су и ДсбА-Л и ВДАЦ1 посредовали ВАН-индукованом АКИ.
Екстракт Цистанцхе
13. ДсбА-Л посредована И/Р индукована апоптоза ХК-2 ћелија била је повезана са ВДАЦ1
Горњи резултат је открио да је ДсбА-Л био укључен у апоптозу БУМПТ ћелија, међутим, функција ДсбА у људским бубрежним тубуларним ћелијама остаје нејасна. ДсбА-Л сиРНА је трансфектована у ХК2 ћелије и затим изложена исцрпљивању АТП-а током 2 х и опоравку 2 х. Имуноблот резултати су показали да ДсбА-Л сиРНА значајно побољшава И/Р-индуковано повећање експресије цепане каспазе-3 и ВДАЦ1, повећану акумулацију Бака у митохондријима и повећану производњу Цит-ц у цитосол ( Слика С5 ан- х). Подаци такође сугеришу да је улога ДсбА-Л у апоптози ХК2 ћелија повезана са ВДАЦ1 током И/Р третмана.
14. ДсбА-Л посредована И/Р индукована апоптоза ХК-2 ћелија зависи од ВДАЦ1
Да би се даље проверило да ли улога ДсбА-Л у апоптози ћелија ХК2 зависи од ВДАЦ1. Прво, ХК2 ћелије су ко-трансфектоване са ДсбА-Л сиРНА плус са или без ВДАЦ1 плазмида, а затим изложене исцрпљивању АТП-а током 2 х и опоравку 2 х. Имуноблот резултати су показали да је ДсбА-Л сиРНА значајно ослабио И/Р-индуковано повећање експресије цепане каспазе-3 и ВДАЦ1, повећану акумулацију Бака у митохондријима и повећану производњу Цит-ц у цитосолу, овај ефекат је обрнут прекомерном експресијом ВДАЦ1 плазмида (слика С6а-х). Друго, ХК2 ћелије су ко-трансфектоване са ВДАЦ1 сиРНА плус са или без ДсбА-Л плазмида, а затим изложене И (2 х)/Р (2 х). Имуноблот резултати су показали да ВДАЦ1 сиРНА значајно побољшава И/Р-индуковано повећање експресије цепане каспазе-3 и ВДАЦ1, повећану акумулацију Бака у митохондријима и повећану производњу Цит-ц у цитосолу, овај ефекат није појачана прекомерном експресијом ДсбА-Л плазмида (слика С7а-х). Подаци су јасно потврдили да је ВДАЦ1 посредовао у про-апоптозној улози ДсбА-Л у ХК-2 ћелијама током И/Р третмана.
Ксиаозхоу Ли,а,б,1 Јиан Пан,а,б,1 Хуилинг Ли,ц Гуангди Ли,г Бохао Лиу,а,б Ксианминг Танг,а,б Ксиангфенг Лиу,ф Зхибиао Хе,а,б Зхениу Пенг,а ,б Хонглианг Зханг,а,б Лукианг Ванг,а,б Иијиан Ли,д Ксудонг Ксианг,а,б Ксиангпинг Цхаи,а,б Иунцханг Иуан,е Пеилин Зхенг,х и Донгсхан Зханг а,б *
Одељење за хитну медицину, Народна Република Кина
б Институт за хитну медицину и тешке болести, Друга болница Ксиангиа, Централ Соутх Университи, Цхангсха, Хунан 410011, Народна Република Кина
ц Одељење за офталмологију, Народна Република Кина
д Одељење за уринарну хирургију, Народна Република Кина
е Одељење за хирургију грудног коша, Народна Република Кина
ф Одељење опште хирургије, Друга болница Ксиангиа, Народна Република Кина
г Одељење за јавно здравље, Централ Соутх Университи, Цхангсха, Хунан, Народна Република Кина
х Одељење за ендокринологију, Народна болница Шенџен, Други клинички медицински колеџ Универзитета Јинан, Прва придружена болница Јужног универзитета науке и технологије, Шенџен, Народна Република Кина
1 Ксиаозхоу Ли и Јиан Пан подједнако су допринели овој студији
