Поли- И олигосахарид Улва Сп. Фракције екстракције уз помоћ ензима модулирају метаболизам екстрацелуларног матрикса

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

Апстрактан:Улва сп. познато је да је извор биоактивних једињења као што су ванови, али њихова биолошка активност на екстрацелуларном матриксу хуманих дермалних фибробласта (ЕЦМ) је слабо пријављена. У овом раду, регулација ЕЦМ је први пут истраживана и на протеомском и на транскриптомском нивоу у нормалним дермалним фибробластима људске коже, након 48 х инкубације са фракцијама поли- и олигосахарида из Улва сп. добијене после екстракције и деполимеризације потпомогнуте ензима. Повећање ћелијске пролиферације (до плус 68 процената) без испољавања било каквог цитотоксичног ефекта на фибробласте је демонстрирано на 50 и 1000 уг/мЛ за обе фракције. На протеомском нивоу, фракције полисахарида од 1000 уг/мЛ највише су побољшале синтезу гликозаминогликана (ГАГ, до плус 57 процената), укупног колагена, посебно типова И (до плус 217 процената) и Ⅲ, као и синтезу и активност ММП-1 (Матрик Металлопротеинасе-1, до плус 309 процената). Насупрот томе, фракције олигосахарида нису имале утицаја на синтезу ГАГ-а, али су показале сличности за колаген и регулацију ММП{12}}.пуритански витамин цНа транскриптомском нивоу, смањење експресије ЦОЛ1А1 и ЦОЛ1А2 и повећање експресије ЦОЛ3А1 и ММП-1 потврдило је модулацију метаболизма ЕЦМ од стране обе фракције. Наше истраживање наглашава да поли- и олигосахарид Улва сп. фракције показују занимљиве биолошке активности и подржавају њихову потенцијалну употребу у области обнављања коже за дермо-козметичке апликације против старења.

кликните овде да бисте сазнали више

Кључне речи:колаген; екстрацелуларног матрикса; људски дермални фибробласт; матрикс металопротеиназа; морске алге; Улва сп.

1. Представљање

Велике зелене плиме изазване Улоа сп. се понављају у Бретањи (Француска) због еутрофикације мора. Наслањавање зелених морских алги има дубоке негативне еколошке утицаје, укључујући промену структуре екосистема, смањење аутохтоног биодиверзитета и економске губитке [1,2]. Осим коришћења као допуна земљишта, исхране за животиње или једноставне деградације пропадањем или сагоревањем услед насукавања, врло мало се зна о валоризацији Улоа сп. у људском здрављу [1]. Међутим, Уллоа сп. је важан извор једињења као што су улвани. Еванс, у води растворљиви сулфатни полисахариди ћелијског зида, који се углавном састоје од рамнозе, уронских киселина и ксилозе, могу представљати до 36 процената суве тежине Уллое [3]. Две главне поновљене дисахаридне јединице улвана су алдобијуронске киселине (улванобиуронске киселине), тип А: -Д-глукуронска киселина (1,4)-везана за -Л-рамноза 3-сулфат, и тип Б: -Л- идуронска киселина (1,4)-везана за -Л-рамнозу 3-сулфат. Мање алдозе дисахарида, које се називају улванобиозе (тип У) се такође могу наћи у улвану[3.4]. Екстракција улвана у смислу квантитативног приноса и квалитета може значајно да варира у зависности од метода екстракције и фракционисања примењених на биомасу. Улвани се обично екстрахују у воденом раствору на високим температурама (80-90 степени) што се назива процесом мацерације. Међутим, Еванс се може опоравити новом зеленом технологијом под називом Екстракција потпомогнута ензимима (ЕАЕ)[5].ЕАЕ омогућава екстракцију једињења од интереса без коришћења услова денатурације као што су растварачи или високе температуре екстракције, и показује разне предности као што су висока каталитичка ефикасност, висока специфичност, благи услови реакције и очување биолошких активности једињења. ЕАЕ такође побољшава принос и смањује трошкове и потрошњу енергије у поређењу са класичним процесом мацерације [6-9]. Након водене екстракције из мацерације или новог процеса као што је ЕАЕ, обогаћивање улваном се често изводи поступком етанолне преципитације [3]. Улвани су показали ин витро и ин виво неколико биолошких активности као што су имуномодулација, антиоксиданс, антиканцер, антикоагуланс, антихиперлипидемијски или антивирусни [3,5,10-14].систанцхеСтруктурна карактеристика Еванса (степен сулфатације, образац сулфатације, састав моносахарида, гликозидне везе, степен гранања, као и молекулска тежина) утиче на његову биолошку активност [3]

Старење коже је сложен процес са два комплементарна процеса: унутрашњим (генетски, ћелијски метаболизам, итд.) и екстринзичним (изложеност УВ зрачењу, загађење, пушење дувана, итд.)[15-17]

Цистанцхе може против старења

Недавно се појавила употреба биоактивних састојака морских алги као извора производа са високом додатом вредношћу за дермокозметичку индустрију. Међу овим биоактивним једињењима, улвани имају висок потенцијал. Заиста, потражња потрошача за природним производима се повећава последњих година, што чини морске производе, а посебно морске алге, занимљивим извором природних састојака који циљају на лепоту и здравље коже [18-22]. Кожа, мета козметичких производа, састоји се од три главна слоја који се преклапају: епидерма, дермиса и хиподерме.шта је цистанчеДермис подржава епидерму и садржи важне ћелије коже познате као фибробласти. Фибробласти, главне ћелије папиларног дермиса које се налазе одмах испод епидермиса, у суштини синтетишу и организују екстрацелуларни матрикс (ЕЦМ). ЕЦМ се састоји од различитих макромолекула укључујући колагене (70 процената суве тежине) углавном типа И и ИИИ, еластин (2-4 процената), гликопротеине (фибронектин, ламинин, итд.), гликозаминогликане (ГАГ) или сулфатиране (хепаран сулфат, дерматан сулфат, кератан сулфат, хондроитин сулфат) и несулфат (хијалуронска киселина), протеогликани и деградативне компоненте као што су ММП (матрикс металопротеиназе)[23,24]. Колаген типа И представља до 80 процената укупног колагена [25] и један је од главних састојака ЕЦМ дермиса коже; укључен је у еластичност, флексибилност и напетост коже. Колаген типа И је хетеротример, троструки хеликс протеин, састављен од два цл ланца и једног ц2 ланца који су кодирани генима ЦОЛ1Ал и ЦОЛ1А2 [26]. Фибриларни колагени типа И и ИИ представљају преко 90 процената укупног колагена и блиско су повезани у кожи [27,28]. Колаген типа ИИ је заступљенији у младој кожи него у старијој кожи и посебно је укључен у зарастање рана [29,30]. Да би се успоставила молекуларна мрежа за склапање ЕЦМ-а, ГАГ-ови су повезани са протеинима и формирају протеогликане (нпр. декорин или версикан) који ступају у интеракцију са колагеном типа И [31]Унутар ЕЦМ-а, ММП, који су ензими ЕЦМ катаболичког пута, су повезани, у латентном или активном облику, за свој ткивни инхибитор металопротеиназа познатих као ТИМП, који регулишу њихову активност [32]. ММП-1(колагеназа-1) је главни ензим одговоран за деградацију колагена типа И, а ТИМП-1 је његов одговарајући инхибитор [334]. Фибробласти су кључни регулатори ЕЦМ хомеостазе. Равнотежа и спајање синтезе између компоненти ЕЦМ коже укључених у анаболизам, као што су колаген типа И и ИИ, ГАГ или ТИМП, и у катаболизму као што су ММП, омогућава обнављање и континуирано ремоделирање овог ЕЦМ-а[25]. У старењу коже , главна последица је неравнотежа регулације ЕЦМ са смањењем пролиферације фибробласта, модулацијом нивоа компоненти ЕЦМ са значајним смањењем синтезе колагена типа И, секреције ГАГ и синтезе ТИМП{24}}, као и повећањем ММП-1 ниво [24,35].

За сада, само неколико студија је истраживало ефекат Улва сп. фракције на метаболизам ћелија коже фибробласта и на протеомском и на транскриптомском нивоу[36-39]и, до данас, није спроведена потпуна студија на протеомском и транскриптомском нивоу на фракцијама поли- и олигосахарида Улуа добијеним из ЕАЕ процеса.Цистанцхе против старењаУ овој перспективи, ова студија истражује, ин витро, ефекте поли- и олигосахаридних фракција из Улва сп. изведен из нове зелене технологије ЕАЕ на метаболизам хуманих дермалних фибробласта. Проучавани су њихови ефекти на пролиферацију и одрживост фибробласта и на анаболизам и катаболизам ЕЦМ на протеомском и транскриптомском нивоу како би се истакао њихов потенцијал у нези коже (нпр. против старења).

2. Резултати

2.1. Поли- и олигосахаридне фракције Улва сп.

из ЕАЕ показују различит биохемијски састав и дистрибуцију молекулске тежине

Механизми производње фракција поли- и олигосахарида су детаљно описани у одељку Материјал и методе: „4.2 Производња и карактеризација фракција поли- и олигосахарида“. Претходне детаљне анализе биохемијске карактеризације (угљени хидрати, уронске киселине, сулфатне групе и протеини) и молекуларне масена расподела фракција поли- и олигосахарида из Уллоа сп. изведени из ЕАЕ [36]. Подаци су комбиновани у табели 1.

Укратко, полисахаридне фракције сирових улвана (УЕ) и дијализованих улвана (ДС-УЕ) се састоје од улвана високе молекуларне тежине (сирових ванова) са 23.5-37.4 процента угљених хидрата,18.5-37. 0 проценат уронских киселина,29.9-49.1 проценат сулфатних група и 10.5-12.8 процената протеина. Састав угљених хидрата је углавном био рамноза (50 процената) и глукуронска киселина (11 процената). ДС-УЕ фракција је значајно богатија улванима од УЕ фракције. Олигосахаридне фракције, деполимеризоване ване од ХзО2 (ДЕП-ХД ПП-УЕ) и деполимеризоване ване од амберлит смоле (ДЕП-АД ПП-УЕ), састоје се од комбија ниске молекулске тежине са 24.4-30.4 процента угљених хидрата ( рамноза 44.9-55.4 процената и глукуронска киселина 7.5-11.0 процената), 21.6-30.8 процената уронске киселине и 12.8-16.8 процената протеини.

Међутим, процес деполимеризације је довео до делимичног губитка сулфата (није детектован у ДЕП-АДПП-а само 6,6 процената у ДЕП-ХД ПП-УЕ). Расподела молекулске тежине (Мв) фракција олигосахарида је показала просечно ниску Мв од 8 кДа за ДЕП-ХД ПП-УЕ и нижу за ДЕП-АД ПП-У са 1,5 кДа.

2.2.Поли- и олигосахаридне фракције Улва сп. Стимулише метаболичку активност, али не утиче на одрживост фибробласта

Метаболичка активност нормалних хуманих дермалних фибробласта (НХДФ), 48х-изложених фракцијама поли- и олигосахарида Уллоа (50 и 100 уг/мЛ током 48 х), процењена је помоћу ВСТ-1 (Слика 1). У овим експериментима (н=9), фракције Уллва из ЕАЕ повећале су пролиферацију фибробласта до плус 68 процената у поређењу са контролом.цистанцхе бенефициосЗначајно повећање метаболичке активности (стр<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Да би се утврдило да ли су ови ефекти повезани са токсичношћу ћелија, одрживост ћелија третираних Улоу екстрактом је процењена мерењем ослобађања ЛДХ (лактат дехидрогеназе) коришћењем ЦитоТок96 степена теста након 48 х инкубације (н=3)(Слика 2). Тест цитотоксичности је показао да све фракције нису показале значајну цитотоксичност у поређењу са контролом.

2.3. Поли- и олигосахаридне фракције Улва сп. Стимулише метаболизам екстрацелуларног матрикса у фибробластима

Ефекат фракција поли- и олигосахарида Уллоа на синтезу сулфатираних и несулфатираних гликозаминогликана (ГАГ) фибробласта је процењен бојењем Алциан плавом после 48 х инкубације (н=4) (Слика 3). Значајно повећање синтезе примећено је само за УЕ и ДС-УЕ при 100 уг/мЛ узимајући у обзир оба сулфата (п<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Занимљиво је напоменути да је ДС-УЕ, најбогатија фракција улвана, највише побољшала синтезу ГАГ-а. При 50 уг/мЛ, УЕ и ДС-УЕ су повећали синтезу несулфатних ГАГ-ова, али не значајно (плус 14,2 процената и плус 22,7 процената респективно). Фракције олигосахарида ДЕП-АД ПП-УЕ при 1000 уг/мЛ благо су смањиле синтезу несулфатираних ГАГ-а, али не значајно (-3 процената), а ДЕП-ХД ПП-УЕ је благо побољшала, али не значајно синтезу ГАГ-а при 100 уг/ мЛ ( плус 4,1 проценат за сулфатизоване и плус 10,9 процената за несулфате).

Укупна синтеза колагена (Слика 4) је процењена помоћу Ред Сириус теста након 48 х изложености фибробласта фракцијама поли- и олигосахарида Уллоа (н=7 при 100 уг/мЛ и н=6 при 50 уг/мЛ) .

Све фракције су показале повећање синтезе колагена зависно од концентрације. Маргинални и не значајан пад синтезе колагена је забележен за све фракције на 50 уг/мЛ у поређењу са контролом. Насупрот томе, при 1000 уг/мЛ, све фракције су повећале укупну синтезу колагена и на значајан начин за УЕ ( плус 22 процента ,п<><0.01),and dep-hd=""><>

Поли- и олигосахарид Ефекат ЕАЕ фракције добијене на синтезу колагена типа И (н=6) и синтезу ММП-1 (н=4) је процењен ЕЛИСА тестовима (Слика 5).

Све фракције су побољшале синтезу колагена типа И и синтезу МП{0}}, али не увек значајно. Повећање синтезе колагена типа И зависило је од концентрације. Утврђено је да су фракције полисахарида, УЕ и ДС-УЕ, при 1000 уг/мЛ, значајно （п<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Ефекти фракција поли- и олигосахарида Уллоа при 100 уг/мЛ, након 48 х излагања фибробластима, на синтезу колагена типа И(н=5) и типа Ⅲ(н=4) на производња ММП-1(н=6) и ТИМП-1(н=5) ​​процењена је Вестерн блот (ВБ) анализом са методом нормализације коришћењем методе укупног протеина траке ( Слика 6).

На слици 6а,е, и ВБ су истакли, респективно, повећање синтезе зрелог колагена типа И (≈130кДа) и зрелог колагена типа ИИИ (≈190 кДа) за све фракције. Квантификација протеина на слици 6ц колагена типа И и слици 6г колагена типа ИИИ открила је НС (не статистички значајно) повећање њихове синтезе у присуству поли- и олигосахарида Уллоа сп. разломци. У међувремену, ВБ на слици 6б,д нам је омогућио да квантификујемо значајан （п<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Активност ММП-1 колагеназе је одређена зимографским тестом у присуству фракција поли- и олигосахарида Уллоа при 100 уг/мЛ (слика 7а), квантификована и упоређена са контролом (слика 7б), након 48 сати излагања фибробластима (н =4).

Резултати су открили да и поли- и олигосахарид Улва сп. фракције нису значајно повећале ММП-1 активност фибробласта.

2.4. Поли- и олигосахаридне фракције Улва сп. Диференцијално модулирајте експресију ЕЦМ гена фибробласта

Ефекат фракција добијених од поли- и олигосахарида Уллоа ЕАЕ је проучаван на нивое стабилног стања мРНА неколико компоненти екстрацелуларног матрикса (ЦОЛ1А1, ЦОЛ1А2, ЦОЛ3А1, ММП-1 и ТИМП-1)(н =4)(Слика 8).

Приметили смо да су се све фракције на 1000 уг/мЛ значајно смањиле (стр<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Табела 2 приказује комбиноване резултате на нивоу стабилног стања генске мРНК након излагања фибробластима фракцијама од 1000 уг/мЛ.

Табела 2 показује да се УЕ значајно смањио (стр<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Овај чланак Мар. Другс 2021, 19, 156. хттпс://дои.орг/10.3390/мд19030156 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/маринедругс