АКТ активиран предкондиционирањем контролише неуронску толеранцију на исхемију кроз МДМ2–п53 путⅠ

Апстрактан

Један од најважнијих механизама неуропротекције посредоване предкондиционирањем је слабљење ћелијске апоптозе, изазивајући толеранцију мозга након накнадне штетне исхемије. У овом контексту, антиапоптотички ПИ3К/АКТ сигнални пут игра кључну улогу у регулисању ћелијске диференцијације и преживљавања.

Цлицк то цистанцхе тубулоса прах занеуропротекција

Познато је да активни АКТ повећава експресију мишје двоструке минуте-2 (МДМ2), Е3-убиквитин лигазе која дестабилизује п53 како би промовисала преживљавање ћелија рака. Код неурона смо недавно показали да је интеракција МДМ2-п53 потенцирана фармаколошким предкондиционирањем, заснованом на субтоксичној стимулацији НМДА глутаматног рецептора, који спречава исхемијом индуковану неуронску апоптозу.

Међутим, није познато да ли овај механизам доприноси толеранцији неурона током исхемијског предкондиционирања (ИПЦ). Овде показујемо да је ИПЦ индуковао ПИ3К посредовану фосфорилацију АКТ на Сер473, који је заузврат фосфорилисао МДМ2 на Сер166. Ова фосфорилација је покренула нуклеарну стабилизацију МДМ2, што је довело до дестабилизације п53, чиме је спречила апоптозу неурона након исхемијског инзулта. Инхибиција ПИ3К/АКТ пута са вортманином или утишавањем АКТ-а изазвала је акумулацију цитосолног МДМ2, укидајући ИПЦ-индуковану неуропротекцију.

Дакле, ИПЦ побољшава активацију ПИ3К/АКТ сигналног пута и промовише толеранцију неурона контролисањем интеракције МДМ2-п53. Наши налази обезбеђују нови механистички пут укључен у ИПЦ-индуковану неуропротекцију путем модулације АКТ сигнализације, што сугерише да је АКТ потенцијална терапијска мета против исхемијске повреде. Кључне речи: АКТ; МДМ2; п53; ПИ3К; исхемијска толеранција; предусловљавање

1. Представљање

Код људи је откривено постојање пролазног исхемијског напада (ТИА) као ендогено предусловљено стање са предностима функционалних исхода код пацијената са можданим ударом [1–3]. Ендогена неуропротекција индукована кратким, субтоксичним исхемијским стимулусом, позната као исхемијско прекондиционирање (ИПЦ), сматра се стратегијом у новој области неуропротекције против исхемијске повреде [4–6].

Докази показују да неуропротекција коју промовише ИПЦ зависи од транскрипције, транслације и пост-транслационих механизама, који мењају функцију кључних протеина након исхемије [6–11]. Међутим, механизам укључен у ИПЦ-индуковану исхемијску толеранцију (ИТ) није у потпуности разјашњен у људском мозгу [12,13].

Развој нових експерименталних приступа разумевању неуропротекције посредоване ИПЦ-ом представља моћно средство за дешифровање ендогених механизама у основи ИТ мозга [6], који имају потенцијал да открију нове терапеутске циљеве усмерене на минимизирање оштећења мозга код пацијената са можданим ударом. У последње две деценије, апоптотска смрт неуронских ћелија се позиционирала као суштински механизам укључен у церебралну исхемијску повреду [14–16]. У том смислу, протеин киназа Б или АКТ, серин/треонин киназа која захтева да се активира функционална фосфоинозитид киназа (ПИ3К), сматра се суштинском метом за неуропротективне терапије након исхемије [17,18].

Недавно смо показали да инхибиција ПИ3К/АКТ сигналног пута повећава осетљивост неурона на ексцитотоксичност [19]. АКТ је укључен у комплексну анти-апоптотичку сигналну мрежу [20], чије компоненте могу бити присутне на различитим субћелијским локацијама у зависности од типа ткива [21,22]. У срцу, АКТ је био укључен у кардиопротекцију промовисану предкондиционирањем [23].

Докази такође показују да фосфорилисани АКТ промовише преживљавање неурона на почетку церебралне исхемије [24]. Иако активација АКТ-а може допринети индукцији ИТ у мозгу [25], тачан механизам који укључује његову активацију посредовану ИПЦ-ом остаје неухватљив. У туморским ћелијама, активација ПИ3К/АКТ сигналног пута доводи до фосфорилације МДМ2 на Сер166/186, што промовише нуклеарну транслокацију МДМ2 [26,27] и појачава његову убиквитинирајућу активност [28].

У језгру, МДМ2 се везује за п53 и промовише његову убиквитинацију и каснију протеазомалну деградацију, што инхибира функцију п53 [29]. У условима стреса, п53 такође може да изазове прекомерну експресију МДМ2, што обрнуто потискује активацију п53 у петљи негативне повратне спреге [30]. Инхибиција ПИ3К спречава активацију АКТ [31] и фосфорилацију МДМ2 у претходно кондиционираном срцу [32].

У овом контексту, претходно смо открили да ин виво предкондиционирање мозга смањује запремину инфаркта након пролазне оклузије средње церебралне артерије (тМЦАО) повећањем експресије нивоа протеина МДМ2. Сходно томе, комплекс МДМ2–п53 је ослабио исхемијом изазвану активацију сигналног пута п53/ПУМА/каспасе-3 у примарним кортикалним неуронима [33].

Овде се бавимо улогом ПИ3К/АКТ сигналног пута у ИПЦ-посредованој неуронској толеранцији против накнадне исхемијске повреде, као и основни механизам, и углавном се фокусирамо на потенцијалну везу између активације АКТ и комплекса МДМ2-п53 .

2. Резултати

2.1. Неурозаштита коју промовише ИПЦ

Посредује се фосфорилацијом АКТ на Сер473, фосфорилацијом МДМ2 на Сер166 и дестабилизацијом п53 Претходно смо описали утицај интеракције МДМ2–п53 на осетљивост неурона на исхемију [34] и ИТ [33]. Овде смо истражили потенцијалну улогу АКТ-а у неуропротекцији посредованој ИПЦ-ом као кандидата да буде укључен у пут МДМ2-п53.

Прво, потврдили смо да је исхемија промовисала активацију АКТ у неуронима, о чему сведочи фосфорилација АКТ на Сер473. Као што је приказано на слици 1А, кратак (20 мин) ОГД је значајно индуковао експресију п(Сер473)АКТ и МДМ2, док су нивои АКТ протеина остали непромењени (слика С1А). Међутим, АКТ фосфорилација није примећена када су неурони били подвргнути продуженом ОГД-у (90 мин). Штавише, нивои протеина МДМ2 су били нижи, што је у складу са вишом експресијом п53 протеина као што је приказано на слици 1А.

Временски зависна регулација експресије Мдм2 после ОГД (слика 1Б) потврђује да субакутна исхемија може бити важна за индуковање механизама који спречавају стабилизацију п53 после ОГД, као што је претходно описано [33]. Користили смо кратак ОГД (20 мин) праћен 2 х реоксигенације као модел ИПЦ (Слика С1Б) [33]; тако смо анализирали неуронске екстракте прикупљене на 4 х реоксигенације након ОГД (ОГД/Р) или након ОГД којем је претходио ИПЦ протокол (ИПЦ плус ОГД/Р). Паралелно, неурони су инкубирани у поставкама нормоксије (Нк) или предкондиционирања (ИПЦ) (слика С1Б).

Као што је приказано на слици 1Ц и слици С1Ц, ИПЦ је изазвао рану активацију АКТ, што је откривено фосфорилацијом на Сер473 [35], праћено стабилизацијом МДМ2 протеина и фосфорилацијом на Сер166. ИПЦ је такође спречио стабилизацију п53 изазвану ОГД/Р (Слика 1Ц). Занимљиво је да су имунофлуоресцентне слике приказане на слици 1Д откриле да је ИПЦ промовисао фосфорилацију АКТ на Сер473 у неуронима, који се претежно акумулирао у језгру, и смањио стабилизацију п53 након ОГД/Р (ИПЦ плус ОГД/Р) у поређењу са неуронима који нису претходно кондиционирани (ОГД). /Р).

Сходно томе, ИПЦ је спречио неуронску апоптозу и активацију каспазе{0}} изазвану ОГД/Р, што је мерено проточном цитометријом (Слика С1Д) и флуориметријским тестовима (Слика С1Е), респективно. Да бисмо потврдили улогу п53 у неуропротекцији посредованој ИПЦ, користили смо неуроне који експримирају (дивљи тип; вт) или не (нокаут; ко) протеин п53. Наши резултати показују да су неурони којима недостаје п53 (слика С1Ф) били отпорнији на апоптозу изазвану ОГД-ом од неурона п53 вт.

Штавише, нивои апоптозе у неуронима п53КО били су слични онима уоченим у претходно кондиционираним (ИПЦ плус ОГД/Р) вт неуронима (слика С1Г), чиме се потврђује кључна улога дестабилизације п53 у неуропротекцији посредованој ИПЦ [33]. Наши резултати показују да је ИПЦ индуковао неуропротекцију против исхемијског инзулта кроз механизам који укључује фосфорилацију АКТ на Сер473, стабилизацију МДМ2 и фосфорилацију на Сер166 и дестабилизацију п53.

2.2. ИПЦ покреће фосфорилацију МДМ2 на Сер166 преко ПИ3К/АКТ пута

ПИ3К/АКТ сигнални пут је укључен у неуронску ИТ и ин витро [36] и ин виво [37]. Међутим, улога ИПЦ посредоване активације ПИ3К / АКТ пута у регулацији комплекса МДМ2-п53 остаје неистражена. Да би се ово разјаснило, неурони су инкубирани са иреверзибилним и специфичним инхибитором ПИ3К/АКТ пута, вортманином [19].

Као што је приказано на слици 2А, вортманин је укинуо ИПЦ-појачану (Сер473) АКТ фосфорилацију и дестабилизацију п53, као што је приказано на слици 1Д. Ови резултати указују на директну везу између активације АКТ и инхибиције п53-посредоване неуронске апоптозе (слика С1Д) и активације каспазе-3 (слика С1Е) индуковане након ОГД/Р. Главни регулатор стабилизације п53, МДМ2, је мета АКТ [26], који фосфорилише МДМ2 на Сер166 и Сер186 [26]. Инхибиција ПИ3К са вортманином спречила је фосфорилацију оба (Сер473) АКТ и (Сер166) МДМ2 индуковану ИПЦ (Слика 2Б).

Специфична Акт посредована фосфорилација МДМ2 на Сер166 индукована ИПЦ је потврђена коришћењем мале интерферирајуће РНК (сиРНА) посебно дизајниране против АКТ1 протеина (сиАкт), високо израженог у кортикалним неуронима, и чија је активност неопходна за преживљавање неурона након исхемије [ 38]. Као што је приказано на слици 3, сиАкт је смањио укупне нивое АКТ и п(Сер473)АКТ протеина 3. дана након трансфекције, како у ХЕК-293Т ћелијама (Слика 3А) тако и у кортикалним неуронима (Слика 3Б).

Штавише, АКТ нокдаун (сиАкт) је спречио (Сер166) МДМ2 фосфорилацију (слика 3Б). Ови резултати показују да ИПЦ-активирани ПИ3К/АКТ сигнални пут промовише фосфорилацију МДМ2 на Сер166, што може бити одговорно за стабилизацију МДМ2 и последичну дестабилизацију п53 након исхемијске повреде.

2.3. ИПЦ-активирани АКТ покреће нуклеарну стабилизацију МДМ2 протеина након исхемије

Активација АКТ је укључена у нуклеарну транслокацију МДМ2 у туморске ћелије [26]. Узимајући у обзир важност нуклеарне стабилизације МДМ2 за преживљавање неурона након исхемије [34] и, прецизније, његову неуропротективну улогу у ИПЦ [33], одлучили смо да даље истражимо значај ПИ3К/АКТ сигналног пута у регулацији субцелуларне локализације МДМ2. беланчевина.

Дакле, неурони или ХЕК-293Т ћелије су трансфектоване хуманим МДМ2-означеним протеином (МДМ2-ГФП). Репрезентативне мрље трансфицираних ХЕК-293Т ћелија и слике неурона који ектопично експримирају хумани МДМ2 протеин након четири различита експериментална услова (Нк, ИПЦ, ОГД/Р и ИПЦ плус ОГД/Р) приказани су на слици 4А и слици С1Х , редом.

Ектопична експресија МДМ2- ГФП је потврдила да ИПЦ промовише нуклеарну акумулацију МДМ2 у поређењу са непредкондиционираним исхемијским (ОГД/Р) или нормоксичним (Нк) неуронима (слика 4А, Б), као што је откривено квантификацијом односа нуклеарне/цитосолне флуоресценције (Слика С2Б) и интензитет нуклеарне флуоресценције МДМ2-ГФП (Слика С2Ц).

2.4. ИПЦ промовише п(Сер473)АКТ и МДМ2 интеракцију, што побољшава стабилизацију МДМ2 у језгру и смањује индуковану неуронску апоптозу након исхемије

Након демонстрације улоге ИПЦ-појачане активације ПИ3К/АКТ пута у нуклеарној стабилизацији МДМ2, даље смо истражили да ли су п(Сер473)АКТ и МДМ2 интераговали унутар језгра (Слика 6А). Имунопреципитација МДМ2 из екстракта нуклеарних протеина, праћена имуноблотингом против МДМ2 и п(Сер473)АКТ, открила је да је ИПЦ промовисао интеракцију између п(Сер473)АКТ и МДМ2, након ОГД/Р, спречавајући тако ОГД/Р-индуковану нуклеарну п53 стабилизацију, као што је приказано на улазу за језгро (слика 6А).

На крају, проучавали смо штетан ефекат поремећаја ПИ3К/АКТ пута на апоптозу неурона (слика 6Б). Инхибиција АКТ-а је супротставила заштитном ефекту ИПЦ-а пре ОГД-а, што потврђује неуропротективну улогу АКТ-МДМ2 у контексту ИТ-а. Наши резултати, дакле, показују да ИПЦ индукује фосфорилацију и активацију АКТ-а, који промовише фосфорилацију МДМ2 на Сер166 и нуклеарну транслокацију, где је у интеракцији са п (Сер473) АКТ. Овај механизам може допринети побољшаној нуклеарној стабилизацији МДМ2, који игра суштинску улогу у исхемијској толеранцији изазваној ИПЦ.

Како Цистанцхе штити неуроне?

Постоје неки докази који указују на то да Цистанцхе може заштитити неуроне смањењем апоптозе (програмиране ћелијске смрти) и промовисањем преживљавања неурона. Апоптоза је природни процес који се јавља у телу да би се уклониле оштећене или нежељене ћелије, али може бити штетна када се јавља претерано или неодговарајуће. У лабораторијским студијама је откривено да Цистанцхе инхибира апоптозу, а овај ефекат може помоћи у заштити неурона од оштећења.

Поред тога, Цистанцхе садржи низ биоактивних једињења за која се показало да имају неуропротективне ефекте. На пример, садржи ехинакозид, за који се показало да штити неуроне од оксидативног стреса и упале. Такође садржи актеозид, за који је утврђено да има антиинфламаторна и антиоксидативна својства.

Наставиће се...

Емилија Барио 1,†, Ребека Весино 1,2,†, Ирене Санчез-Моран 1, Кристина Родригез 1,2,3, Алберто Суарез-Пиндадо 1, Хуан П. Болањос 1,2,3,4, Анђелес Алмеида 1, 2,3 и Марија Делгадо-Естебан 1,2,3,*

1 Институт за функционалну биологију и геномику, Универзитет у Саламанци, ЦСИЦ, 37007 Саламанка, Шпанија; емибг7@гмаил.цом (ЕБ); rebecavecino@usal.es (РВ); ирена_sm@usal.es (ИС-М.); c.rodriguez@usal.es (ЦР); Алсуап77@гмаил.цом (АС-П.); jbolanos@usal.es (ЈПБ); aaparra@usal.es (АА)

2 Институт за биомедицинска истраживања Саламанке, Универзитетска болница у Саламанци, Универзитет у Саламанци, ЦСИЦ, 37007 Саламанка, Шпанија

3 Одељење за биохемију и молекуларну биологију, Универзитет у Саламанци, 37007 Саламанка, Шпанија 4 Центро де Инвестигацион Биомедица ен Ред де Фрагилидад и Енвејецимиенто Салудабле (ЦИБЕРФЕС), Институто де Салуд Царлос ИИИ, 28029 Мадрид: {{5} Цорреспонденце ; Тел.: плус 34-923-29-4908