Смањење повреде очувања/реперфузије бубрега контролисаном хипертермијом током перфузије Ек Виво машине

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Тхомас Минор1,*,† и Цхарлотте вон Хорн1,†

Могући рено-протективни ефекат контролисаног кратког третмана топлотним шоком током изоловане ек виво машинске перфузије донорских трансплантата пререперфузијатреба испитати у примарној ин витро студији.Порцинебубрези(н=14) су узети након 20 минута мировања срца донора и подвргнути 20 сати статичког складиштења на хладном у раствору Универзитета Висконсин. Пререперфузија, бубрезибили су подвргнути 2 сата машинске рекондиционирања перфузије са постепеним повећањем температуре перфузије до 35 степени. У половинибубрези(н=7), примењен је кратак хипертермички импулс (10 минута перфузије на 42 степена) у периоду машинске перфузије. Функционални опоравак графтова примећен је након нормотермне реперфузије ин витро. Хипертермички третман је резултирао 50-постотним повећањем протеина топлотног шока (ХСП) 70 и ХСП 27 мРНА и био је праћен ~ 50-постотним побољшањем тубуларне реапсорпције натријума и глукозе након реперфузије, у поређењу са контролама. Штавише, губитак аспартат аминотрансферазе путем бубрега значајно је смањен на једну трећину контроле, као и губитак протеина у урину, процењен односом албумина и креатинина. Закључено је да се ек виво третман топлотним шоком чини лако изводљивим и обећавајућим опцијама за побољшање машина за самоодбрану бубрега одреперфузијаповреданакон очувања које заслужује даље истраживање у претклиничким моделима.

Цистанче др вита опцје веома добар забубрегареперфузија

Студи Хигхлигхтс

КОЈА СУ ТРЕНУТНА ЗНАЊА О ТЕМИ?

✔ Индукција протеина топлотног шока (ХСП) у локалним ткивима је добро познати одбрамбени механизам као одговор на стресове околине. Повећана регулација тих молекуларних пратилаца изазива механизме поправке и толеранцију на накнадне ћелијскеповреда. Цлиницалбубрегатрансплантација се све више ослања на употребу проширених критеријума донаторских органа који имају повећану осетљивост на исхемију/реперфузијуповреда. Ек виво машинска перфузија маргиналних трансплантата органа пружа привилегован приступ графту и нову перспективу за лаку и контролисану примену хипертермичне стимулације на изоловани орган како би се покренули одговори топлотног шока и ослободили сигнални путеви који повољно утичу на узастопно погоршање ткива. повреде и побољшатибубрежниопоравак након трансплантације.

КОЈЕ СЕ ПИТАЊУ ОБРАЋАВАО ОВА СТУДИЈА?

✔ Испитујемо потенцијални заштитни ефекат кратког хипертермног стимулуса током ек виво пре трансплантацијебубрегаперфузијана функционални исход на постисхемичниреперфузија.

ШТА ОВА СТУДИЈА ДОДАЈЕ НАШИМ ЗНАЊИМА?

✔ Ова студија даје неке индикације да хипертермички третман током ек виво перфузије бубрежне машине делује као могуће ново средство за побољшање функционалних исхода маргинално очуванихбубрезинакон постисхемијске реперфузије. Подаци подржавају релевантну улогу ХСП-а у смањењу деструкције ћелија и побољшању посттрансплантационе тубуларне функције бубрега.

КАКО ОВО МОЖЕ ПРОМЕНИТИ КЛИНИЧКУ ФАРМАКОЛУ

ОГИЈ ИЛИ НАУКА О ПРЕВОДУ?

✔ Додавање кратке контролисане хипертермије успостављеном нормотермном машинском перфузионом протоколу је лако применљив метод за клиничку примену и може допринети побољшаном опоравку органа након трансплантације.

Клиничка трансплантација бубрега се све више ослања на употребу проширених критеријума донорских органа који су оштећени пре узимања или су вероватно мање од оптималних

квалитета. Заједно са све већим уделом оних органа који имају повећану осетљивост на штетне окидаче након исхемијског очувања, 1,2 промене ткива

у вези са исхемијом/реперфузионом повредом представљају све већи проблем у трансплантацији бубрега који изазива ћелијску дисфункцију након реперфузије.

Индукција ћелијских пратиоца и активирање фенотипа заштитног сигнала (нпр. субкритичним термичким стресом), је добро познати механизам за смањење промена ткива које се односе на каснију стресну ситуацију и изазивање хомеостазе ткива.3,4

Појава изоловане машинске перфузије као алтернативе или додатка исхемијском складиштењу маргиналних донорских трансплантата отворила је нову перспективу за лаку и контролисану примену хипертермичког изазова на изоловани орган како би се покренуо одговор топлотног шока и ослободио сигнал путеви који повољно утичу на узастопно погоршање повреде ткива и побољшавају опоравак бубрега након трансплантације.

Експериментално је доказано да је ефекат предкондиционирања одговора топлотног шока повезан са привременим супранормалним повећањем циторрезистенције5, као и да је оперативан кроз појачавање секундарних механизама ћелијске поправке.6 Недавно је показано да индукција протеина топлотног шока (ХСП) могу пружити заштиту чак и када се индукују рано након што се првобитни увреда ткива већ догодила.7

Привилеговани приступ изолованом органу искључује гломазне захтеве за загревањем целог тела и изазива штетне нежељене ефекте на организме даваоца или примаоца.

Стога је ова студија замишљена као пилот истраживање за испитивање примарних доказа хипертермијског третмана током ек виво перфузије бубрежне машине како би деловало као могуће ново средство за побољшање функционалног исхода маргинално очуваних бубрега након постисхемијске реперфузије.

МЕТОДЕ

Сви експерименти су спроведени на бубрезима који су узети од угинулих женки немачких ландрас свиња (старост: 10-12 недеља, тежина: 25 и 30 кг). Поштовани су савезни закон о заштити животиња и принципи неге лабораторијских животиња (публикација Националног института за здравље (НИХ) бр. 85-23, ревидирана 1985). Животиње су третиране по правилима и по одобрењу локалних власти.

Бубрези су уклоњени 20 минута након заустављања циркулације и испрани на задњем столу гравитацијом од 100 цм са хладним (4 степена) раствором Универзитета Висконсин све док ефлуент не постане бистар. Хепарин није даван ни у једном тренутку.

Графтови су затим чувани 18 сати у чаши напуњеној раствором Универзитета Висконсин и температуром регулисаном на 4 степена помоћу криотермостата.

У контролној групи, бубрези су затим подвргнути 2 сата оксигенисане (95 процената О2; 5 процената ЦО2) нормотермне машинске перфузије са Акик РС И раствором допуњеним са 40 г/Л албумина говеђег серума. Као што је раније предложено, 8,9 перфузија је започета у хипотермији након чега је уследило постепено повећање до 35 степени у првих 60 минута, контролисано програмабилним циркулишућим криотермостатом.

У експерименталној групи, кратак период контролисане хипертермије (ЦХ) је укључен у изоловану перфузију

Ек Виво третман топлотним шоком малих трансплантата органа и фон Хорнов протокол. Након достизања 35 степени, температура перфузата је привремено повећана на 43 степена током 10 минута (Слика 1) пре наставка перфузије на 35 степени током остатка 2-часовног периода. Време и висина повећања температуре су изведени из претходних експеримената са инкременталним скринингом са циљем да се добије конзистентан ефекат.

У три експеримента, парцијални притисак кисеоника у ткиву контролисан је коришћењем игличастог оптичког сензора кисеоника од микровлакана, који је био повезан са температурно компензованим оптичким мерачем кисеоника (Мицрок 4, ПреСенс прецисион сенсинг, Регенсбург, Немачка), који је истовремено забележио одговарајућу температуру помоћу сонде термистора.

Игла је постављена на унутрашњи кортикални регион бубрега како би се документовала адекватна оксигенација ткива чак и током хипертермичних периода перфузије.

Модел изоловане реперфузије бубрега

Опоравак бубрега од повреде очувања/реперфузије је процењен коришћењем успостављеног ин витро модела реперфузије, као што је претходно описано.10

Укратко, бубрези су хладно испрани са 100 мЛ физиолошког раствора на крају периода рекондиционирања машине, а затим држани на собној температури 20 минута како би се симулирао други топли период исхемије током хируршке имплантације ин виво. Ово време је такође коришћено за канилирање уретера великом цевчицом да би се омогућило сакупљање урина након реперфузије.

Бубрези су стављени у термостатски контролисану комору од плексигласа и перфундирани кроз бубрежну артерију при средњем пулсирајућем притиску од 90 ммХг. Венски ефлуент се слободно одводио у резервоар. Оксигенација перфузата је изведена са 95 процената О2/5 процената ЦО2 коришћењем термо-контролисаног оксигенатора са шупљим влакнима. Артеријски притисак је одржаван помоћу серво-контролисане ваљкасте пумпе у комбинацији са трансдуктором притиска који је повезан са артеријском перфузионом канилом. Урин је сакупљен из ПЕ цеви уметнуте у уретер који је вођен ка спољашњој страни резервоара. Сваких 100 мЛ сакупљеног урина филтрирано је и поново инфундирано у резервоар како би се

Слика 1РеналпО2 кортикалног ткива (испрекидана линија) током ек виво машинске перфузије у односу на одговарајућу температуру перфузата (пуна линија).

за одржавање константног састава електролита перфузата током времена.

Аналитички поступци

Парцијални притисак кисеоника и концентрације глукозе и електролита у перфузији мерени су у пХ анализатору гасова у крви (АБЛ 815флек ацид-базна лабораторија, Радиометар, Копенхаген).

Активности ензима аспартат аминотрансферазе (АСТ) и концентрације креатинина одређиване су на рутински начин рефлексивном фотометријом на Рефлотрон Плус јединици за негу (Роцхе Диагностицс, Манхајм, Немачка).

Реналклиренс је израчунат за одговарајуће интервале као уринарни креатинин × проток урина/креатинин перфузије.

Концентрација албумина у фракцији урина на крају експеримента мерена је фотометријски коришћењем теста везивања боје са бромокрезол зеленим у лабораторијском центру универзитетске болнице и количина протеина је нормализована у односу на одговарајуће концентрације креатинина као албумина у урину до однос креатинина.

Филтрирано оптерећење натријума (ФЛ На) је израчунато као

ФЛ=ГФР × На

ФРНА=(ФЛНа − На(урин) × проток урина)∕ФЛНа

Филтрирано оптерећење и фракциона реапсорпција глукозе су израчунати у складу са тим.

Реверзна транскрипција и накнадна ланчана реакција полимеразе

Укупна РНК је изолована из брзо замрзнутих узорака ткива из спољашњег кортекса и анализирана као што је претходно описано.8

Основне вредности су израчунате из узорака ткива који су узети из виталнихбубрезиек виво. Резултати су квантификовани коришћењем ΔΔЦт методе. Циљни гени су нормализовани на глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназу као интерни стандард. Вредности експресије Фолд гена су израчунате за сваки појединачни узорак као нормализоване у односу на основне вредности.

У студији су коришћени следећи прајмери ​​(купљени од Киаген ГмбХ, Хилден, Немачка): глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (бр. ППС00192А), ХСП72 (бр. ППС00074А), ХСП27 (бр. ППС01262) и ХО{ {6}} (бр. ППС01191А).

Вестерн Блот

Имуноблотинг протеина је изведен из лизата целих ћелија из спољашње срединебубрежникортекса електрофорезом натријум додецил сулфат-полиакриламид гела и електрофоретским трансфером на нитроцелулозну мембрану, као што је претходно описано.8 Бојење је урађено помоћу Понцеау С верификоване униформности пуњења и преноса протеина.

Инкубација са примарним антителима је обављена преко ноћи на 4 степена (зечја анти-фосфо екстрацелуларна сигнално регулисана киназа (ЕРК, Тхермо Фисхер, #МА5-15174—1:500) или анти ХСП 72 (СтрессМарк Биосциенце, #СЦМ) -100—1:300). После инкубације са секундарним антителом везаним за пероксидазу рена (1:1,000) током 1 сата на собној температури, протеин је детектован појачаном хемилуминисценцијом коришћењем Ц-Дигит Блота Скенер (Ли-ЦОР).

Квантификација садржаја протеина је изведена дензитометријски помоћу УН-СЦАН-ИТ гела верзије 6.1 (Силк Сциентифиц, Орем УТ) као нормализованог у односу на експресију укупног ЕРК (Тхермо Фисхер, #МА5-15174) или ß-актина (Тхермо Фисхер , #ПА1-46296).

Статистика

Све вредности су изражене као средња вредност ±СД за н {{0}} животиња по групи, а разлике између група су тестиране неупареним, двостраним т-тестом коришћењем Велцх-ове корекције за неједнаке варијансе, ако није другачије назначено. Статистичка значајност је постављена на П <>

РЕЗУЛТАТИ

Машинска перфузија

Током контролисаног оксигенизованог загревања графтова перфузисаних машином, привремена хипертермија је довела до видљивог пролазног пада убубрежнипО2 кортикалног ткива (Слика 1), које је ипак увек остајало изнад 200 ммХг и стога је јасно испуњавало физиолошке захтеве током нормотермне перфузије за које је пријављено да су 30–50 ммХг.11,12

Реналослобађање АСТ у циркулишући перфузат било је чак нешто ниже у групи са хипертермијом него у контролним условима (19,8 ± 12,1 наспрам 33,3 ± 25,9 У/Л; ЦХ у односу на контролу, није значајно).

Молекуларно очитавање пролазне хипертермије током ек виво машинске перфузије

Очување и реперфузија доводе до значајне индукције ХСП-а чак и под контролним условима са ~ 2- пута, 8- пута, па чак и 100- пута повећањем мРНА транскрипата хемоксигеназе 1, ХСП 27 , и ХСП 72, респективно.

Без обзира на то, контролисана пролазна хипертермија током машинске перфузије ефикасно је повећала ово повећање индукције гена за око 50 процената у свим случајевима. Утврђено је да је ефекат веома значајан за ХСП 27 као и за ХСП 72, док се статистички значајност не може доказати у погледу индукције хем оксигеназе 1 (Слика 2).

Фосфорилација ЕРК-а представља брзи заштитни сигнални догађај који реагује и који такође може промовисати експресију ХСП 72.13

Испитивано је као рана реперкусија топлотног стреса на ниво протеина. Вестерн блот анализе су откриле да пролазна хипертермија током машинске перфузије значајно повећава количину ЕРК фосфорилације у ткиву у поређењу са контролном групом (Слика 3). Сходно томе, такође је утврђено да је експресија протеина ХСП 72 значајно повишена изнад контролних вредности након контролисане хипертермије током машинске перфузије.

Пролазна хипертермија се побољшавабубрежниопоравак након конзервације

Проток перфузије током реперфузије био је у просеку између 300 и 400 мЛ/мин без разлике између ова два

групе. Производња урина је такође била слична у обе групе са 897 ± 354 наспрам 601 ± 280 мЛ/90 минута (контрола наспрам ЦХ).

Реналослобађање АСТ је узето као параметар глобалне ћелијске повреде и праћено током реперфузије (Слика 4). Види се да је хипертермички третман резултирао почетно нижим вредностима на почетку реперфузије и даље ублажавао прогресивни пораст током перфузије која је у току.

РеналФункција тубуларне ћелије је процењена анализом реапсорпције натријума и глукозе из ултрафилтрата (Слика 5). Утврђено је да фракционе стопе реапсорпције одбубрези, који су претходно били подвргнути контролисаној хипертермији током машинске перфузије, значајно су надмашили оне у контролној групи за ~ 40 процената.

Да би се искључила могућност да контролабубрезимогли бити напуњени апсолутно већим садржајем натријума или глукозе у ултрафилтрату, одредили смо и укупно оптерећење филтрацијом обе супстанце, које се, међутим, није разликовало између две групе са ФЛ На од 2,7 ± {{3 }}.7 и 2.5 ± 0.8 ммол/мин и ФЛ глу до 24.8 ± 12.1 и 28.6 ± 9.4 мг/мин (контрола наспрам ЦХ, респективно).

Стопе гломеруларне филтрације су такође биле двосмислене у обе групе; вредности клиренса за креатинин су износиле {{0}}.25 ± 0.06 мЛ/г/мин у контролној групи и 0.24 ± 0.08 мЛ/г/мин. после ЦХ.

Насупрот томе, цурење протеина у урину је значајно смањено убубрезикоји су били подвргнути ЦХ (слика 6).

ДИСКУСИЈА

Употреба ек виво машинске перфузије представља тренд развоја у управљању очувањем графта пре трансплантације органа.

У последњој деценији, хипотермична машинска перфузија се етаблирала као супериоран метод очувања у поређењу са једноставним статичким складиштењем у хладњачама14,15 и постала је популарна за очување органа већег ризика, као и проширених критеријума.14–16

Показало се да пулсирајућа стимулација васкулатуре током екстрателесног периода17, као и присуство кисеоника18 одржавајубубрежнихомеостазу и побољшатифункционалнаисходи након трансплантације.

Недавни технички напредак подстакао је нови тренд ка нормотермној машинској перфузији као физиолошкијој алтернативи технологијама хипотермичне перфузије, која компензује већи трошак побољшаним одржавањем метаболичке хомеостазе и аутентичнијом могућношћу да се процени очувани трансплантат. пре трансплантације.19,20

Осим тога, нормотермна машинска перфузија представља идеалну платформу за терапијске интервенције на изолованом органу који може послужити у сврхе кондиционирања са циљем ублажавања последица претходне повреде/очувања или предусловља за каснију реперфузиону повреду након друге топле исхемије и реперфузије након трансплантације.

цистанцхе бубрег виркунг

Утврђено је да третман топлотним шоком као терапијски приступ промовише веома ефикасне заштитне механизме у бубрезима и индукује толеранцију на специфичне увреде стабилизацијом структуре протеина и интегритета ћелије. Овај ефекат се углавном заснива на синтези специфичних ХСП-а, који су конститутивно изражени у бубрезима и могу бити високо регулисани као одговор на различите стресне услове.4

Ова студија показује да кратак хипертермички изазов током изоловане перфузије бубрега ефикасно изазива реакцију молекуларног топлотног шока, што је доказано на нивоу пре транскрипције и на нивоу протеина, и активира сигнализацију преживљавања путем ЕРК пута. Описани поступак стога није био повезан са очигледном хипоксијом ткива, упркос изолованој перфузији без додатних носача кисеоника.

Раније је утврђено да индукција ХСП може почети унутар < 1 сата21 и да се експресија ХСП 72 повећава на мноштво већ након 3 сата.22 ХСП 70 је најистакнутији пратилац који реагује на хипертермички стрес и игра кључну улогу улога у заштити ткива повећањем ћелијске машинерије за самоодбрану.5

ХСП 72 спречава погрешно савијање протеина,5 олакшава уклањање оштећених протеина6 и учествује у поновном савијању и поправљању протеина. У подржавању процеса поправке ћелија који су много јефтинији од де ново синтезе. ХСП 72 тако смањује метаболичке потребе током критичне ситуације након реперфузије након ћелијске повреде21 и на тај начин помажећелијски опоравакод увреде.

Стабилизација лизозомалних мембрана23 смањује ћелијску повреду киселим хидролазама и узастопном индукцијом ћелијске смрти. На молекуларном нивоу, раније студије показују да ХСП 72 активира МЕК/Ерк пут и релевантни заштитни ефекат је повезан са Раф, МЕК и Ерк фосфорилацијом и преживљавањем ћелија.24,25 Сходно томе, у нашем моделу, ЦХ је довео до значајног смањење укупног ослобађања АСТ, што је узето као параметар општег оштећења ћелија. Штавише, прогресивни пораст АСТ током текуће реперфузије је такође значајно ослабљен третманом.

Упоредо са овим ишло је значајно ублажавањедисфункција бубрегапошто је утврђено да је капацитет реапсорпције тубуларних ћелија повећан за ~ 50 процената у односу на контролне вредности.

ХСП 27 је ХСП ниске молекуларне тежине за који је такође утврђено да је важан актер у заштитном одговору на топлотни шок у бубрезима.4 Студије на тубуларним ћелијама пацова показују да је акумулација ХСП 27 у ћелијама проксималних тубула повезана са повећаним преживљавањем и регенерација.26

На основу резултата ове пилот студије, чини се да је имплементација кратког хипертермичког изазова у протокол за перфузију ек виво машина лак начин да се кондиционирају маргинално очувани трансплантати бубрега који промовишу отпорност на реперфузијску повреду побољшањем ћелијске самоодбране. машина. Још увек постоје контроверзе да ли би машинска перфузија требало да се обави унапред, одмах након набавке графта27 упркос логистичким непријатностима, или да ли би кратак период исхемијске перфузије након транспорта органа статичким складиштењем био довољан и лакше изводљив у клиничка рутина.28,29 Ек виво кондиционирање трансплантата помоћу ЦХ би било могуће у оба модалитета.

Међутим, треба бити опрезан у погледу преурањених коначних закључака. Изоловани перфузирани бубрег (ИПК) је користан алат за студије функционалног скрининга30, а корелације између ИПК података и клиничких исхода чине ИПК модел потенцијално корисним алатом за процену функције бубрега.17,31 Међутим, прилично константан функционални капацитет модела ограничен је на неколико сати,32 што искључује дугорочна посматрања.

Пошто се максимална експресија ХСП-а и даље може јавити након овог времена,22 потенцијално даље повећање заштитног ефекта хипертермијског третмана (нпр. у смислу побољшане регенерације након исхемијског инзулта) неће бити узето у обзир у нашем пилот подешавању. Штавише, добро је познато из ранијих студија на другим моделима, да третман топлотним шоком или прекомерна експресија ХСП 27 изазвана лентивирусом могу довести до ублажавања инфламаторне реактивности повређених циљних органа.

уз значајно смањење инфилтрације неутрофила у ткиво.33,34

Заузврат, познато је да је инфилтрација леукоцита водећи феномен акутног типа који изазива штетне инфламаторне реакције након исхемије бубрега и реперфузије ин виво.

Међутим, да би се искључили истовремени штетни ефекти активације крвних ћелија на вештачким површинама цеви, који би били неизбежни у проширеном ин витро моделу, чини се да су стварна трансплантација и реперфузија под физиолошким условима, укључујући природну морфологију крвних судова, обавезне да се тачно адресирају ћелијски упалних ефеката, који стога нису били обрађени у овој пилот истрази.

Коначно, недавни налази су показали значајнеполне разликеу транскриптима израженим у ћелијама проксималних тубула мужјака у односу на женке који могу одражавати полне диспаритете у хроничној болести бубрега или проинфламаторним генским модулима.35 У нашој студији коришћене су само женске животиње, чиме су заобиђене наводне полне диспаритете у реакције топлотног шока. С друге стране, могуће другачије понашање мушког ткива није обрађено и стога се не може објаснити у овој студији.

У закључку, наши досадашњи подаци показују да је кратка хипертермична ек виво перфузија лак начин да се прати индукција у изолованом бубрежном графту који даје паренхимску заштиту при раној реперфузији и гарантује даљу потврду коришћењем ин виво модела трансплантације са продуженим временом посматрања.

Признања. Аутори са захвалношћу одају драгоцену техничку помоћ Бастијану и Регини Луер.

Финансирање. За овај посао нису добијена финансијска средства.

Сукоб интереса. Аутори су изјавили да нема супротстављених интереса у овом раду.

Прилози аутора. ТМ и ЦвХ су написали рукопис. ТМ и ЦвХ су осмислили истраживање. ТМ и ЦвХ су извршили истраживање. ТМ и ЦвХ су анализирали податке.