Скенирајућа микроскопија јонске проводљивости живог људског гломерула

За више информација:ali.ma@wecistanche.com

Руслан Боховик1,2|Микхаило Федориук1,2|Елена Исаева1,2|Андрев Схевцхук3|Олег Палигин1|Александар Старушенко1,4

1Одељење за физиологију, Медицински колеџ Висконсина, Милвоки, ВИ, САД2Одељење за ћелијску мембранологију, Богомолецов институт за физиологију, Кијев, Украјина3Одсек за медицину, Империал Цоллеге Лондон, Лондон, УК44Цлемент Ј. Заблоцки ВА медицински центар, Милвау, САД

ПрепискаАлександар Старушенко и Руслан Боховик, Одсек за физиологију, Медицински колеџ Висконсина, 8701 Ватертовн Планк Роад, Милваукее, ВИ 53226, САД. Емаилови: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Информације о финансирању Одељење за борачка питања, број гранта/награде: И01 БКС004024; Национални институт за срце, плућа и крв, број гранта/награде: П01 ХЛ116264 и Р35 ХЛ135749; Америчко физиолошко друштво, број гранта/награде: награда за унапређење каријере у истраживању; Национални институт за дијабетес и пробаву иБубрегБолести, Број гранта/доделе: ДК126720

Апстрактан

Оштећење подоцита је обележје гломеруларних болести, као што је фокална сегментна гломерулосклероза, типично повезана са израженом албуминуријом и прогресијом бубрежне патологије. Структурне абнормалности и губитак подоцита су такође повезани са болешћу минималних промена и чешћидијабетесна болест бубрега. Овде смо први пут применили технику скенирајуће микроскопије јонске проводљивости (СИЦМ) да проценимо свеже изоловане људегломерулатопологија. СИЦМ пружа јединствену прилику за проценугломерулаподоцити као и други структурни сегменти нефрона са резолуцијом електронске микроскопије али у живим узорцима. Овде је приказана примена СИЦМ методе код живог човекагломерула, који пружа доказ принципа за будућу динамичку анализу морфологије мембране и различитих функционалних параметара у живим ћелијама.

Цлицк то цистанцхе нежељена дејства и Цистанцхе за болест бубрега

1. ПРЕДСТАВЉАЊЕ

Гломерулуспредставља сноп капилара који се налази на улазном делу нефрона, где се крв селективно филтрира кроз баријеру гломеруларне филтрације коју чине ендотелне ћелије, базална мембрана гломерула и подоцити. Примарни и секундарни процеси суседних подоцита се преплићу, стварајући прорезну дијафрагму која чврсто покрива капиларе гломерула. Ова дијафрагма има сложену морфологију и чини коначну баријеру за филтрацију крви доприносећи селективности величине и омогућавајући пропустљивост за молекуле мање од албумина. Смањење броја подоцита и брисање процеса стопала забележено је код фокалне сегментне гломерулосклерозе, болести минималних промена и дијабетичке нефропатије.1-3Штавише, губитак подоцита и модификација њихове архитектуре могу бити евидентни у врло раним фазамабубрегаболести које могу бити у основи/погоршати њихово напредовање. Снимање ћелијске морфологије високе резолуције постаје суштинско и корисно средство за проучавање ћелијских структура и улоге коју оне играју у функцији ћелије и напредовању болести.4 Скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ) је широко коришћена метода за спровођење таквих студија. Ипак, то захтева вишеструке сложене процедуре за припрему узорка, што онемогућава анализу живог узорка.5 Стога, постоји критична потреба за развојем нових алата за проучавање промена морфологије подоцита у живим узорцима. Режим скакајуће сонде скенирајуће микроскопије јонске проводљивости (СИЦМ) је техника која омогућава неоптичко снимање површина живих ћелија са сложеном морфологијом високе резолуције.6-8Главна предност ове методе је просторна резолуција близу неколико нанометара и дуг З (вертикални) опсег, који се може применити на живе узорке са закривљеном морфологијом у физиолошки релевантним условима. СИЦМ је мултимодална техника снимања која се може комбиновати са другим успостављеним техникама, истовременом и динамичком анализом морфологије мембране и различитим функционалним параметрима, као што су запремина ћелије, мембрански потенцијали, струје једног јонског канала, па чак и динамика комплекса мембранских протеина. у живим ћелијама.9-11 Овде дајемо пример примене СИЦМ-а за анализу морфологије живог човекагломеруластруктура.

Цистанцхе - симптоми болести бубрега

2. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ

За експеримент смо користили део кортикалне области од одбаченог човека од трансплантацијебубрегасецирају и чувају у раствору за конзервацију у Висконсину, након чега следи инкубација у физиолошком раствору са кисеоником (ПСС).12 Бубрежни гломерули су изоловани коришћењем технике вибродисоцијације као што је претходно описано.13 Овај приступ омогућава брзу изолацију добро очуваних бубрежних гломерула од људибубрези. За обављање СИЦМ снимања, свеже изолованог човекагломеруласу причвршћени на поли-Л-лизин стаклену површину постављену у ћелијску комору напуњену ПСС раствором. Узорци су ручно позиционирани у ки смеровима под инвертованим оптичким микроскопом Никон ТЕ2000-У (Никон Инструментс). За сонду за скок, коришћене су СИЦМ нанопипете од боросиликатног стакла са отпором од приближно 100 МΩ, што одговара процењеном пречнику врха око 120 нм. Нанопипете су извучене хоризонталним извлакачем пламена/браон типа П-97 (Суттер Инструментс, Новато, ЦА). Нанопипете су напуњене истим ПСС раствором који се користи за купатило и постављене су у з-смеру помоћу пиезоелектричног актуатора. Јонска струја која тече кроз нанопипете мерена је са Акопатцх 700Б патцх-цламп појачивачем (Акон Инструментс) у режиму напонске стезаљке и надгледана од стране прилагођеног модификованог универзалног контролера (ИЦАППИЦ Лтд, УК), који је истовремено контролисао позиционирање узорка и пипете. 6 Сви експерименти су спроведени на собној температури (20-22 степен). За снимање сложених увијених структура као што су процеси стопала подоцита угломерула, користили смо бацкстеп/хоппинг режим СИЦМ који је најприменљивији за снимање топографије живих ћелија са високом резолуцијом.6,14 Један корак принципа скакања састоји се од догађаја када се референтна струја мери позиционирањем нанопипете знатно изнад узорак. Затим, нанопипета се приближава дуж з-осе површини узорка све док измерени ниво струје не падне на унапред подешену задату тачку која одговара ~ 1.0 проценат -1.2 процената референтне струје. У овом тренутку, приступ је прекинут, КСИЗ-координате КСИ и З пиезо актуатора се снимају као површинска координата узорка за прву тачку снимања, а пипета се повлачи са површине. Ова процедура се затим понавља на свакој појединачној тачки снимања дуж ки осе одређене унапред подешеном резолуцијом и опсегом подручја скенирања. За слику 1Б, опсег скенирања и резолуције слике биле су 30 µм × 30 µм и 512 пк × 512 пк, а за слику 1Ц биле су 5 µм × 5 µм и 480 пк × 480 пк, респективно. Необрађени СИЦМ топографски подаци и накнадна обрада слике обављени су коришћењем софтвера за микроскопску анализу СИЦМ ИмагеВиевер (ИЦАППИЦ Лтд, УК).

СЛИКА 1 Примена микроскопије скенирајуће јонске проводљивости. А, Свеже изоловани човекгломерулапричвршћен за површину поли-лизинског стакла. На левој страни је приказана микропипета која се приближава површини гломерула да би се извршила СИЦМ слика. Б, Пример компоненти баријере за филтрацију гломерула, укључујући посуде покривене подоцитним и стопалима, визуелизовано помоћу СИЦМ-а. 45 мин за скенирање укупне површине (30 × 30 µм, резолуција 512 × 512 пиксела; з-оса се мења за 15 µм). Ц, Проширени поглед на архитектуру секундарних процеса стопала људских подоцита откривених СИЦМ-ом високе резолуције. 12 мин за скенирање укупне површине (резолуција 5 × 5 µм, резолуција 480 × 480 пиксела; з-оса се мења за 3 µм). Приказане су скале

3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА

СИЦМ квалитет слике је упоредив са СЕМ и омогућава прецизно испитивањегломерулаповршинску структуру, укључујући крвне судове и подоците, и архитектуру секундарних процеса стопала.4 У нашој претходној студији, користили смо СИЦМ снимање да проценимо патолошке структурне промене у процесима стопала подоцита код пацова дијабетичке нефропатије типа 2 (Т2ДН).15 Ми спровели компаративну анализу тродимензионалне архитектуре баријере за филтрирање подоцита код недијабетичких и Т2ДН пацова. Наши подаци су открили значајан губитак процеса стопала подоцита у Т2ДН гломерулима дајући тачну процену хистопатолошких промена које су се јавиле код дијабетичке нефропатије које су у основи нефринурије и албуминурије код ових пацова.15 Овде смо по први пут показали успешан приступ у процени три -димензионална површинска структура свеже изолованог, живог људског гломерула. Људски бубрежни гломерули су сферне структуре пречника око 300 µм16; стога, врх пипете мора пажљиво да се приближи врху области од интереса. Наша СИЦМ поставка има опсег скенера од 25 µм з-осе и 30 × 30 µм ки-осе, што нам је омогућило да добијемо слику високе резолуције великог делагломерулаповршине. Време аквизиције у великој мери зависи од опсега скенирања, резолуције и величине врха електроде за скакање. За снимање живих ћелија у сложеним структурама попут свеже изолованог гломерула, време скенирања варира од 10 до 50 минута по кадру (погледајте легенду слике за више детаља). Кумулативни ефекат високе резолуције, велике површине скенирања и стохастичких флуктуација у живим системима може резултирати артефактима слике представљеним као хоризонтални и вертикални помаци између циклуса репозиције пипете у нади. Имајте на уму да се у сложеним геометријама са изненадним променама у површинским локацијама, и време аквизиције и артефакти слике, као што су тамни или лоши пиксели, могу повећати. СИЦМ топографска слика (слика 1А) илуструје гломеруларне капиларе прекривене јасно видљивим примарним и секундарним процесима стопала подоцита. СИЦМ омогућава добијање узорака слика са различитим опсезима скенирања у нанометарској скали, задржавајући довољан ниво резолуције.17 Слика 1Б представља архитектуру секундарних процеса стопала људских подоцита откривених СИЦМ-ом високе резолуције. Даља анализа таквих топографских слика може се користити за проучавање морфолошких промена процеса стопала подоцита у патолошким условима и као одговор на различите примене лекова.

Примена СИЦМ технике за испитивање тродимензионалне површинске структуре узорака меких ткива, укључујућигломерулаи ћелије подоцита, првобитно су представили Накајима ет ал4. Аутори су користилибубрегакришке да се ова техника упореди са конвенционалним СЕМ. Овде смо проширили ове студије на живи људски гломерул. Користећи овај приступ, открили смо велики потенцијал СИЦМ технике за брзо и поуздано испитивањегломерулафилтрациона баријера. Једна од великих предности СИЦМ-а (поред употребе живих узорака) је да не захтева вишеструке процедуре припреме узорака које су обично потребне за ЕМ микроскопско снимање, укључујући дехидратацију и раствор за фиксирање. Стога, СИЦМ омогућава избегавање скупљања узорака посматраних са ЕМ, што може довести до погрешних стварних димензија. Важно је да СИЦМ у реалном времену на свеже изолованим гломерулима такође омогућава тестирање динамике кретања процеса стопала као одговор на акутну изложеност лековима од интереса. Коначно, СИЦМ пипета се може користити за обављање патцх-цламп снимања једноканалних струја.18 У ту сврху, након реконструкције топографске карте, софтвер за аквизицију (ИЦАППИЦ Лтд, УК) је омогућио контролисано кочење СИЦМ стакла. скакање сонде на површини коморе, смањујући отпор микроелектрода на услове патцх-цламп (7 до 12 МΩ) и чинећи је погодном за једноканално снимање у истом експерименту. СИЦМ омогућава одабир тачне локације електроде са патцх-цламп на површини ћелије на основу топографских података помоћу добро контролисаног вертикалног приступа са нанометарском прецизношћу, што резултира лаким формирањем контактног гигазаптивача са ћелијском мембраном под називом Смарт Патцх.19

Укратко, метода описана овде има одличан потенцијал за проучавање гломерула и других свеже изолованих сегмената нефрона. Штавише, показује да је могуће користити људебубрегаузорци без детаљне припреме за процену морфолошких промена у проучавању патологија.

Цистанцхе за болест бубрега

ЗАХВАЛНИЦЕ

Истраживање у лабораторији аутора финансирало је Одељење за борачка питања И01 БКС004024, Национални институт за срце, плућа и крв Р35 ХЛ135749 и П01 ХЛ116264, Национални институт за дијабетес и пробаву иБубрегДисеасес Р01 ДК126720 и награда за унапређење каријере за истраживање америчког физиолошког друштва.

СУКОБ ИНТЕРЕСА

Др Андрев Схевцхук је акционар и прима консултантске накнаде од ИЦАППИЦ Лтд. Сви остали аутори су изјавили да немају конкурентне интересе

ПРИЛОЗИ АУТОРА

Руслан Боховик: Концептуализација (једнако); Курирање података (олово); Формална анализа (олово); Писање-оригинални нацрт (једнако); Писање-преглед и уређивање (једнако). Михаил Федориук: Курирање података (подршка); Формална анализа (попратна); Писање-преглед и уређивање (једнако). Елена Исаева: Концептуализација (подршка); Курирање података (подршка); Формална анализа (попратна); Писање-оригинални нацрт (подржавање); Писање-преглед и уређивање (једнако). Андрев Схевцхук: Концептуализација (подршка); Софтвер (подржава); Писање оригиналног нацрта (попратни); Писање-преглед и уређивање (једнако). Олег Палигин: Концептуализација (једнако); Формална анализа (попратна); Методологија (подржава); Администрација пројекта (подршка); Писање-оригинални нацрт (попратни); Писање-преглед и уређивање (једнако). Александар Старушченко: Концептуализација (главни); Администрација пројекта (вођа); Ресурси (олово); Надзор (водећи); Писање-оригинални нацрт (једнако); Писање-преглед и уређивање (једнако).

ИЗЈАВА О ДОСТУПНОСТИ ПОДАТАКА

Подаци који подржавају налазе ове студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.