Липокалин повезан са неутрофилном желатиназом показује јачу способност да инхибира повећање цисте АДПКД ћелија у поређењу са несекретованим обликом Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. Ефекти мНГАЛ на формирање циста 2Л3 ћелија у 3Д култури
Пролиферација ћелијаје абнормално повећан код 2Л3 мишева и доводи до формирања и увећања цисте [17]. На основу претходних резултата које је мНГАЛ инхибираоПролиферација 2Л3 ћелија у 2Д култури(Слика 3), спекулисали смо да мНГАЛ може даље инхибирати формирање циста у 2Л3 ћелијама. Да бисмо истражили да ли мНГАЛ може да инхибира формирање циста у 2Л3 ћелијама, успоставили смо платформу за 3Д културу која је обезбедила одговарајуће окружење са Матригелом за формирање циста (Слика 6). Ћелије су посејане у 96-плоче са бунарчићима (1000 ћелија/бунарићу) преко претходно формираног Матригела преко ноћи. Након што су ћелије причвршћене на гел, ћелијама је додато још Матригела да би се формирао узорак сличан сендвичу (слика 6А). Ћелије су одржаване у 3Д култури на 37 ◦Ц и 5% ЦО2 најмање 5 дана да би се формирале цисте. Цисте у 3Д култури су се повећавале са продуженим временом културе (слика 6Б). Да бисмо потврдили да су сферни конструкти уочени у 3Д култури цисте са луменом, фиксирали смо их и обојени антителима на ДАПИ и Е-кадхерин и актин да бисмо идентификовали ћелијска језгра, адх ћелија-ћелија, езију и апикална мембрана, респективно. Конфокалном микроскопијом уочени су различити оптички з пресеци цисте 2Л3 у 3Д култури од врха (слој 1) до средине (слој 5), а лумен је потврђен унутар сферичне цисте (Слика 6Ц, Додатни материјал
НОВЕ БИЉЕ ЗА АДПКД(ПОЛИЦИСТИЧНА БОЛЕСТ БУБРЕГА)
Да би се истражили ефекти мНГАЛ-а на формирање циста ћелија 2Л3 у 3Д култури, ћелије у 3Д култури су третиране форсколином од 1. до 3. дана да би се изазвало формирање цисте. Ћелије су затим третиране са или без мНГАЛ-а од 4. до 8. дана, а пречници цисте су мерени сваког дана (Слика 6Д). Цисте у 3Д култури расле су пропорционално са бројем дана културе, са пречникима у распону од 40 до 120 µм (Слика 6Е–Г), док је мНГАЛ значајно потиснуо пречник цисте (Слика 6Ф) и површину (Слика 6Г) до 8. дана. , није било значајне разлике у повећању броја циста између контролне и групе третиране мНГАЛ-ом од 4. до 8. дана (Слика 6Х). Даље смо анализирали број великих циста (пречник > 100 µм) између две групе и открили да је мНГАЛ значајно смањио проценат великих циста у поређењу са контролном групом 8. дана (Слика 6И).
3.5. Ефекти трансфекције са пН + ЛС и пН − ЛС на експресију НГАЛ и пролиферацију ћелија у 2Л3 ћелијама
Да бисмо проучили да ли је потреба за вишом концентрацијом мНГАЛ (2 мг/мЛ) у 3Д култури за инхибицију раста циста 2Л3 ћелија (слика 6) последица недостатка посттранслационе модификације мНГАЛ, дизајнирали смо конструкт за прекомерну експресију мНГАЛ. у 2Л3 ћелијама. Поред тога, показано је да НГАЛ може да интерагује са НГАЛ-Р и даље индукује апоптозу [29]. Стога, да би се разумело да ли је НГАЛ интераговао са НГАЛ-Р да би индуковао апоптозу и даљеинхибирају виталност ћелија(Слика 3) и раст цисте (Слика 6), конструкт за прекомерну експресију несекретованог НГАЛ (без водеће секвенце) је такође трансфектован у 2Л3 ћелије.
НГАЛ миша (НП_032517.1) и људски НГАЛ (НП_005555.2) су 200-аа и 198-аа протеини, респективно, и оба имају {{6 }}аа сигнални пептид за секрецију лоциран на Н-терминусу НГАЛ протеина (Слика 7А). Поређење секвенци је показало 62% идентитета и 80% позитивности између мишјег НГАЛ и људског НГАЛ-а. Показало се да мишји НГАЛ има два Н-везана места гликозилације на аспарагину (Асн, Н) на аа 81 и 85, док је хумани НГАЛ имао једно место на аа 85 (Слика 7А), откривајући разлику између њих у посттранслационој модификацији.
Слика 7. Ефекти трансфекције са пН + ЛС и пН − ЛС на експресију НГАЛ и пролиферацију ћелија у 2Л3 ћелијама. (А) Поравнање мишјег НГАЛ (НП_032517.1) и хуманог НГАЛ (НП_005555.2) протеина. 20-аа сигнални пептиди су приказани плавом бојом. Два пријављена Н-везана места гликозилације на Асн (Н) на аа 81 и 85 мишјег НГАЛ и једно на аа 85 хуманог НГАЛ обележена су звездицом (*). Идентитети: пуна линија; позитивни: упарене тачке. Горе наведене информације о секвенци су из БЛАСТП програма на веб страници Националног центра за биотехнолошке информације (НЦБИ). (Б) Конструишите дијаграм мНГАЛ са (пН + ЛС) или без (пН − ЛС) секретованом Игκ лидерском секвенцом на пЛАС2.1в.ПеГФП-И2-Бсд вектору. (Ц) Резултат гел електрофорезе потврдио је конструкт пН + ЛС (647 бп) и пН − ЛС (587 бп) који су дигестирали НхеИ и НотИ. (Д) Временска линија инфекције и селекција 2Л3 ћелија са пН + ЛСи пН − ЛС, респективно. Ћелије 2Л3 су инфициране пН + ЛС или пН − ЛС у плочи са 6а бунарчићем првог дана. Селекција бластицидином је почела 2. дана и медијум је мењан свака 3 дана. После селекције током недељу дана, ћелије су сакупљене да би се анализирале помоћу РТ-КПЦР, вестерн блот и ЕЛИСА. (Е) Детекција експресије репортерског еГФП-а да би се испитала ефикасност трансфекције пН + ЛС и пН − ЛС другог дана. Око 10% ћелија је инфицирано ГФП конструктом. Скала бар: 50 µм. РТ–кПЦР резултати су показали да су пН + ЛС и пН − ЛС имали већу експресију Лцн2 (представљени укупни ниво НГАЛ) (Ф) и ц-миц (представљени трансфектовани егзогени ниво НГАЛ) (Г) у поређењу са контролном групом. (Х) Није било значајне разлике у Слц22а17 (НГАЛ-Р) између група. РК: релативна квантификација=2−∆∆Цт; Гапдх је коришћен као интерна контрола сваког узорка. Вредности су нормализоване на контролну групу. (И) Вестерн блот резултати су показали да пН + ЛС и пН − ЛС имају већу експресију НГАЛ од контролне групе. (Ј) ЕЛИСА је показала да пН + ЛС и пН − ЛС ћелијелуче значајно већи НГАЛ од контролне групе, док је излучена количина НГАЛ пН − ЛС ћелија била значајно мања од пН + ЛС ћелија. (К) Уградња БрдУ показала је да су пН + ЛС и пН - ЛС ћелије имале нижи однос пролиферације ћелија од контролне групе, док су пН - ЛС ћелије имале већи од пН + ЛС ћелија. Студентов т-тест је изведен да би се одредила значајност између две групе (н=3 у РТ–кПЦР и ЕЛИСА тесту, н=4 у вестерн блот-у и инкорпорацији БрдУ). *п < 0.05; ** п < {{10}}.01; *** п < 0,001 наспрам 2Л3 сваке групе; # п < 0,05; ### п < 0,001 у односу на пН + ЛС групу; нс: нема значајне разлике.
У овој студији користили смо водећу секвенцу мишјег Игκ-ланца (ЛС) [44] уместо оригиналног сигналног пептида мНГАЛ да бисмо обезбедили повећано лучење егзогеног протеина мНГАЛ. За прекомерну експресију секретованог или несекретованог НГАЛ-а, коришћени су НГАЛ са или без ЛС у пЛАС2.1в.ПеГФП-И2-Бсд векторима, наиме, пН + ЛС и пН − ЛС, који су приказани на слици 7Б. Два промотера, пЦМВ и хПГК, коришћена су за покретање независне експресије два протеина, НГАЛ-ц-миц-Хис6 и еГФП. Да би се осигурало уметање конструкта, НхеИ и НотИ су коришћени за варење два плазмида, а резултати гел електрофорезе су показали 647-бп траку од пН + ЛС и 587-бп траку од пН − ЛС (због недостатка 60-бп лидерске секвенце) (слика 7Ц).
За инфекцију пН + ЛС и пН-СП у 2Л3 ћелије, ћелијама су додати полибрен и лентивирус и инкубирани на 37 ◦Ц током 24 сата, након чега је уследила селекција са бластицидином (слика 7Д). Детекција ГФП експресије је изведена флуоресцентном микроскопијом након инфекције (Слика 7Е). Инфициране ћелије су сакупљене недељу дана након селекције бластицидина за РТ-кПЦР, вестерн блот и ЕЛИСА да би се анализирао ниво експресије НГАЛ (Слика 7Ф-Ј). РТ-кПЦР резултати су показали да је инфекција 2Л3 ћелија са пН + ЛС и пН − ЛС довела до повећања експресије Лцн2 (Слика 7Ф) и Лцн2-ц-миц (Слика 7Г), што је представљало нивое укупног и егзогени НГАЛ, респективно, док није било разлика у нивоима експресије Слц22а17 (НГАЛ-Р) (слика 7Х). Вестерн блот резултати су показали да пН + ЛС и пН - ЛС ћелије имају више нивое интрацелуларне експресије НГАЛ од контролних 2Л3 ћелија (Слика 7И). ЕЛИСА резултати за ћелијски супернатант показали су да су пН + ЛС и пН − ЛС ћелије имале значајно више нивое излученог НГАЛ од контролне групе 2Л3 ћелија (слика 7Ј). Поред тога, количина НГАЛ коју луче пН - ЛС ћелије била је значајно мања од оне коју излучују пН + ЛС ћелије (слика 7Ј), док су две групе имале сличне нивое експресије НГАЛ (слика 7И). Овај налаз је подржао наше предвиђање да прекомерна експресија НГАЛ без сигналног пептида (пН - ЛС) ограничава лучење НГАЛ упркос присуству високог нивоа интрацелуларног НГАЛ. Да би се истражило да ли излучени НГАЛ, а не несекретирани НГАЛ инхибира пролиферацију ћелија, извршен је тест инкорпорације БрдУ, који је показао да пН + ЛС и пН - ЛС ћелије имају значајно нижу пролиферацију од контролне групе (Слика 7К). Поред тога, пН - ЛС ћелије су имале значајно већу пролиферацију од пН + ЛС ћелија (слика 7К). Ови резултати сугеришу да је секреција НГАЛ из 2Л3 ћелија била потребна да би се инхибирала ћелијска пролиферација.
3.6. Ефекти менталне прекомерне експресије који доводе до сигналних путева у 2Л3 ћелијама
На основу наших претходних резултата који показују да мНГАЛ може инхибирати ЕРК и АКТ путеве у 2Л3 ћелијама (Слика 4) и даље смањити пролиферацију ћелија (Слика 3) и повећање цисте (Слика 6), користили смо Вестерн блоттинг да анализирамо да ли ЕРК и АКТ путеви су погођени у пН + ЛС и пН − ЛС ћелијама (Слика 8). Вестерн блот резултати су показали да су пН + ЛС и пН − ЛС групе имале значајно нижи однос п-ЕРК (Т202/И204)/ЕРК од контролне групе, а пН − ЛС група је имала већи однос п-ЕРК (Т202/И204)/ЕРК од пН + ЛС групе (Слика 8А). Однос п-АКТ (С473)/АКТ био је нижи у пН + ЛС групи него у контролној групи, док пН − ЛС ћелије нису биле значајно различите од оних у контролној и пН + ЛС групи (Слика 8Б). Однос п-ЦРЕБ (С133)/ЦРЕБ био је значајно већи у пН − ЛС групи него у пН + ЛС групи, док ни пН + ЛС ни пН − ЛС нису показали значајну разлику у односу на контролну групу (слика 8Ц). Ови резултати сугеришу да пН + ЛС и пН − ЛС имају статистички значајне разлике у односу п-ЕРК/ЕРК (слика 8А), док пН + ЛС група није показала бољи ефекат у АКТ (слика 8Б) и ЦРЕБ ( Слика 8Ц) активација.
Према претходним резултатима да би примена мНГАЛ-а могла да изазове апоптозу (слика 3) и аутофагију у 2Л3 ћелијама (слика 5) и смањи пролиферацију ћелија (слика 3) и повећање цисте (слика 6), користили смо вестерн блоттинг да бисмо истражили ефекат на апоптозу. и аутофагија у пН + ЛС и пН − ЛС ћелијама (слика 9). Вестерн блот резултати су показали да пН + ЛС ћелије имају значајно већи однос расцепљене-/про-капазе-3 (Слика 9А) и цепљене-/про-ПАРП (Слика 9Б) од контролне групе; пН − ЛС ћелије нису показале значајну разлику у односу расцепљене-/про-капазе-3 (Слика 9А) и цепљене-/про-ПАРП (Слика 9Б) у поређењу са контролном групом, као и однос расцепљених- /про-цаспасе-3 је била значајно нижа од оне у пН + ЛС групи (слика 9Б). Ови резултати су показали да прекомерна експресија секретованог НГАЛ уместо несекретираног НГАЛ индукује апоптозу у 2Л3 ћелијама.
Већи однос ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И (слика 9Ц) и нижи однос п62/ГАПДХ (слика 9Д) идентификовани су у пН + ЛС ћелијама у поређењу са контролном групом; пН − ЛС ћелије нису имале значајну разлику у односу ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И (Слика 9Ц) и п62/ГАПДХ (Слика 9Д) у поређењу са контролном групом, а однос ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И је био значајно нижи него у пН + ЛС група (слика 9Ц). Овај резултат је открио да је прекомерна експресија излученог НГАЛ, а не несекретованог НГАЛ-а, изазвала аутофагију у 2Л3 ћелијама.
3.7. Ефекти прекомерне експресије мНГАЛ на формирање циста 2Л3 ћелија у 3Д култури
На основу претходних резултата да је мНГАЛ инхибирао пролиферацију 2Л3 ћелија и повећање цисте у 2Д и 3Д култури, респективно (Слике 3 и 6), сумњали смо да прекомерна експресија излученог НГАЛ-а може даље инхибирати повећање цисте 2Л3 ћелија кроз инхибицију ћелијске пролиферације ( Слика 7К).
Да би се истражили ефекти прекомерне експресије НГАЛ у 2Л3 ћелијама на формирање цисте, 2Л3 контролне ћелије, пН + ЛС и пН − ЛС ћелије су третиране форсколином 1-3 дана да би се изазвало формирање цисте. Пречник, површина и број циста мерени су свакодневно након индукције форсколина (Слика 10А). Цисте 2Л3 контролних, пН + ЛС и пН − ЛС ћелија у 3Д култури расле су на начин који зависи од дана културе (Слика 10Б) и показивале су очигледне разлике у величини цисте од 4. до 8. дана. Група пН + ЛС је имала значајно мање пречнике цисте (Слика 10Ц) и површине (Слика 10Д) од контролне групе од 4. до 8. дана, док је пН − ЛС група имала значајно мање пречнике циста од контролне групе 6. и 8. дана (Слика 10Ц). Није било значајне разлике у површини цисте између контролне и пН − ЛС групе. Поред тога, пН - ЛС група је имала значајно веће пречнике и површине цисте од пН + ЛС групе 8. дана (Слика 10Ц, Д). Иако није било значајне разлике у стопи повећања броја циста међу контролним, пН + ЛС и пН − ЛС ћелијама (Слика 10Е), пН + ЛС и пН − ЛС групе су имале значајно ниже проценте великих (пречник > 100 µм) цисте од контролне групе (Слика 10Ф) од 4. до 8. дана. Ови резултати су показали да пН + ЛС и пН − ЛС оба инхибирају повећање цисте, док је инхибиторни ефекат пН − ЛС био слабији од пН + ЛС . Овај налаз је открио да прекомерна експресија излученог мНГАЛ-а има супериорну способност да инхибира повећање циста 2Л3 ћелија у 3Д култури него несекретирани мНГАЛ.
-Извршен је тест да би се утврдила значајност између група (н=3). * п < 0.05; *** п < 0.001 у односу на контролну групу; # п < 0,05 у односу на пН + ЛС групу
каспаза{{0}} (А) и цепљен-/про-ПАРП (Б) од контролне групе, која је представљала индукцију апоптозе излученим мНГАЛ. пН − ЛС ћелије нису имале значајну разлику у односу цепана-/про-капаза-3 и цепана-/про-ПАРП у поређењу са контролном групом. пН + ЛС ћелије су имале већи однос ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И (Ц) и нижи однос п62 (Д) у поређењу са контролном групом. пН −ЛС ћелије нису имале значајну разлику у односу ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И и п62 у поређењу са контролном групом. Тубулин, Винцулин и ГАПДХ су коришћени као интерне контроле сваког узорка. Вредности су нормализоване на контролну групу. Студентов т-тест је спроведен да би се одредила значајност између група (н=3). * п < 0.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001 у односу на контролну групу; # п < 0,05; ## п < 0,01 вс.пН + ЛС група.
Слика 9. Ефекти прекомерне експресије мНГАЛ протеина на апоптозу и аутофагију у 2Л3 ћелијама. Вестерн блот резултати су показали да пН + ЛС ћелије имају значајно већи однос расцепљене-/про-капазе-3(А) и цепљене-/про-ПАРП (Б) од контролне групе, што је представљало индукцију апоптозе од излученог мНГАЛ-а. пН −ЛС ћелије нису имале значајну разлику у односу цепана-/про-капаза-3 и цепана-/про-ПАРП у поређењу са контролном групом. пН + ЛС ћелије су имале већи однос ЛЦ3БИИ/ЛЦ3Б И (Ц) и нижи однос п62 (Д) у поређењу са контролном групом. пН − ЛС ћелије нису имале значајну разлику у односу ЛЦ3Б ИИ/ЛЦ3Б И и п62 у поређењу са контролном групом. Тубулин, Винцулин и ГАПДХ су коришћени као интерне контроле сваког узорка. Вредности су нормализоване на контролну групу. Урађен је Студентов т-тест да би се утврдила значајност између група
(н {{0}}). * п < 0.05; ** п < 0.01; *** п < 0,001 у односу на контролну групу; # п < 0,05; ## п < 0,01 у односу на пН + ЛС групу
4–8. Број циста 4. дана сваке групе је коришћен као контрола за израчунавање односа броја циста. (Ф) Проценат циста велике величине у 3Д култури контролне групе, пН + ЛС и пН − ЛС ћелија током дана 4-8. Студентов т-тест је спроведен да би се одредила значајност између група (н=3). * п < {{10}}.05; ** п < 0.01 у односу на контролну групу; # п < 0,05; ## п < 0,01 у односу на пН + ЛС групу.
